實驗教學(xué)改進：血藥濃度法估算家兔口服對乙酰氨基酚藥動學(xué)參數(shù)

謝寶剛　劉愛紅　趙天生　賴小平

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實驗教學(xué)改進：血藥濃度法估算家兔口服對乙酰氨基酚藥動學(xué)參數(shù)

謝寶剛1劉愛紅2趙天生3賴小平3

【摘要】血藥濃度法估算口服對乙酰氨基酚藥動學(xué)參數(shù)是我校藥學(xué)專業(yè)生物藥劑學(xué)與藥物動力學(xué)課程主要的實驗內(nèi)容之一。本文就給藥后取血、樣品前處理及血藥濃度測定方法對原實驗進行了改進。結(jié)果表明，相對于原實驗方法，改進后的實驗操作簡便、取血順利；利用差示分光光度法測定血藥濃度可提高分析方法靈敏度，減少干擾因素。改進后的實驗方法操作行強，具有較好穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，適合實驗教學(xué)。

【關(guān)鍵詞】教學(xué)改進；血藥濃度法；藥代動力學(xué)實驗；差示分光光度法

【中圖分類號】G642

【文獻標(biāo)識碼】A

作者單位：1 330006南昌大學(xué)藥學(xué)院；2 330006南昌大學(xué)分析測試中心；3 330006南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗教學(xué)部

生物藥劑學(xué)與藥物動力學(xué)是是藥劑學(xué)的分支學(xué)科，是藥學(xué)專業(yè)的主干專業(yè)課程之一，由生物藥劑學(xué)與藥物動力學(xué)兩部分組成，其中，生物藥劑學(xué)是研究藥物及劑型在體內(nèi)的吸收、分布、代謝與排泄（ADME）過程，闡明藥物的劑型因素、機體生物因素和藥物療效之間相互關(guān)系的科學(xué)；藥物動力學(xué)是應(yīng)用動力學(xué)的原理與數(shù)學(xué)處理方法，定量描述藥物通過各種途徑進入機體的ADME過程的動態(tài)變化規(guī)律的科學(xué)。藥物動力學(xué)方法廣泛應(yīng)用于制劑研究和藥物質(zhì)量評價、臨床用藥和新藥篩選等方面，是一門實踐性很強的課程。生物藥劑學(xué)與藥物動力學(xué)實驗課的教學(xué)目的是使學(xué)生更好地掌握基本理論，培養(yǎng)學(xué)生的動手能力、發(fā)現(xiàn)問題及解決實際問題的能力，以提高學(xué)生的綜合素質(zhì)[1-3]。但藥物動力學(xué)實驗涉及生物藥劑學(xué)、藥物分析、藥理學(xué)和統(tǒng)計學(xué)等多學(xué)科知識，實驗操作復(fù)雜、影響因素多，可能導(dǎo)致實驗結(jié)果與預(yù)期差距較大，存在實驗效果不理想的情況[4-5]。血藥濃度法估算口服對乙酰氨基酚藥動學(xué)參數(shù)是藥學(xué)相關(guān)專業(yè)主要的實驗內(nèi)容之一，對學(xué)生理解并掌握通過血藥濃度的測定來獲取藥物的藥動參數(shù)具有重要指導(dǎo)意義。該實驗內(nèi)容包括血樣的采集、血藥濃度的測定及實驗數(shù)據(jù)處理等步驟。桂卉等[6]改進了該實驗血清除蛋白方法，操作簡便，適合學(xué)生教學(xué)實驗。然而，在學(xué)生實驗的帶教過程中，發(fā)現(xiàn)該實驗還存在取血不方便；測得的血藥濃度數(shù)據(jù)波動范圍大、誤差偏大等現(xiàn)象，最終導(dǎo)致無法較好擬合藥動學(xué)參數(shù)的缺陷。本文就該實驗在家兔取血和血藥濃度測定等方面對原實驗方法進行了改進，改進后的實驗方法重現(xiàn)性、穩(wěn)定性好，適合學(xué)生教學(xué)實驗，具體報道如下。

1　原實驗主要步驟和方法[6]

家兔灌服對乙酰氨基酚片0.5 g后，采用耳靜脈取血，對血樣加氫氧化鋇、硫酸鋅除蛋白或1.5倍乙腈除蛋白的方法，離心后采用紫外分光光度法在257 nm測定血藥濃度，然后進行數(shù)據(jù)處理：繪制藥時曲線、將測得的血藥濃度代入藥動公式求算消除速率常數(shù)K、半衰期t1/2等藥動參數(shù)。實驗內(nèi)容包括血樣的采集、血藥濃度的測定及實驗數(shù)據(jù)處理三部分內(nèi)容。其中對取血和給藥后血藥濃度的測定是本實驗的實驗課應(yīng)完成的操作，藥動學(xué)參數(shù)估算可以在實驗完成后撰寫實驗報告時獲得。

2　改進后的實驗方法

2.1器材與試劑

儀器與材料：分析天平、容量瓶、751分光光度計、注射器每組2支、動脈夾、三通管、止血鉗、眼科手術(shù)剪、具塞試管、10 ml離心管每組8個、家兔固定箱、刀片、棉球、離心機，1.0 ml及0.2 ml移液槍每組各一把。藥品與試劑：撲熱息痛（原料藥）、2.5%戊巴比妥、無水或95%乙醇、0.02 M NaOH、肝素鈉 1 mg/ml等。

2.2藥濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取一只兔子，耳靜脈取血大約3.0 ml，放置30 min后3 500 rpm離心10 min，得到無藥血清。分別精密吸取對乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)貯備液（4 mg/ml，水箱保存）0.3 ml、0.60 ml、1.2 ml、1.8 ml、2.5 ml、3.0 ml于10 ml容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，分別得到120、240、480、720、1 000、1 200 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再分別精密吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液0.3 ml至6支離心試管中，加兔血清0.2 ml，振搖均勻，加2.5 ml乙醇，震蕩搖勻，3 500 rpm離心10 min，每管取上清液2份，每份0.5 ml，其中一份準(zhǔn)確加水4 ml （共4.5 ml），另一份加0.01 M NaOH 4 ml （共4.5 ml）。最后溶液于751型分光光度計上λ＝265 nm處分別測得不同溶液稀釋樣品的吸收率（A水和ANaOH），由將所測得的吸收度△A---C作圖，進行回歸分析，得到工作曲線。

2.3藥動實驗家兔取血、處理

取家兔一只，體重2～3 kg，雌雄均可，給藥前禁食12 h。腹腔注射戊巴比妥 2.5%1.2 ml/kg進行麻醉。藥物起效后，固定家兔，使其頸部拉直。剪毛，割皮，鑷子、止血鉗鈍性分離頸總動脈。遠心端結(jié)扎，近心端用動脈夾夾緊，留一根絲線備用。刀柄墊起動脈，小剪刀平剪開一斜口，用充滿肝素鈉的三通管進行動脈插管。動脈插管后，家兔導(dǎo)管灌胃對乙酰氨基酚原料藥0.5 g/只（加1.5 ml水配成混懸劑）。給藥后，按20、30、50、70、90、120、150、180、210、250、300 min，定時從動脈插管取血1.0 ml（先放掉大約1.0 ml管中含肝素的血）。將每次所取血液滴于預(yù)先干燥的刻度離心管中。待所有樣品收集完后，全血3 500 rpm／min離心10 min。用移液槍精密吸取血清（上清）0.2 ml置離心管中。

2.4血藥濃度的測定及動力學(xué)參數(shù)求算

上述血清0.2 ml，再加蒸餾水0.3 ml（總體積0.5 ml），加2.5 ml乙醇，震蕩搖勻，3 500 rpm離心5 min，每管取上清液2份每份1.0 ml，其中一份準(zhǔn)確加水4 ml（共4.5 ml），另一份加0.01 M NaOH加水4 ml（共4.5 ml）。最后溶液于751型分光光度計上，λ=265 nm處測得樣品的吸收率，記錄數(shù)據(jù)。

2.5數(shù)據(jù)處理

將各時刻下測得的吸收度△A值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線上的回歸方程，計算出各時刻下的血藥濃度C（μg/ml）。以血藥濃度C為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)，作LogC-t曲線圖。求出K，t1/2，Tmax，Cmax，AUC，Ka和t1/2（a）等藥動學(xué)參數(shù)。

3　結(jié)果

3.1家兔耳緣靜脈取血改為頸總動脈插管術(shù)取血

耳緣靜脈取血是家兔取血常用的方法，但由于學(xué)生在實驗過程中極易使靜脈血管破裂，加上傷口出血凝固快及造成靜脈栓塞的可能。本次實驗發(fā)現(xiàn)，兔子耳緣靜脈取血1～2次可行，多次取血無法順利現(xiàn)實，即使是剪掉兔子的部分耳朵。本實驗亦嘗試首先給家兔注射高劑量的肝素鈉溶液后，再行取血，但結(jié)果仍不太理想。

家兔頸總動脈插管術(shù)是實驗動物學(xué)及相關(guān)基礎(chǔ)研究的基本操作和技能，我校藥學(xué)專業(yè)學(xué)生在生理學(xué)實驗和藥理學(xué)實驗兩門先行課程中均對該技術(shù)進行了系統(tǒng)的學(xué)習(xí)和訓(xùn)練，大部分學(xué)生都能獨立完成家兔頸總動脈插管術(shù)。鑒于此，本實驗對原方法中的耳緣靜脈取血改為頸總動脈插管取血，結(jié)果表明，采用三通管接細導(dǎo)管插入家兔頸動脈后，取血簡便易行、靈活方便多次操作，節(jié)時省力，實驗效果比耳緣靜脈取血好。

3.2血藥濃度測定方法的改進

因紫外分光光度計操作簡便、儀器便宜、保養(yǎng)經(jīng)濟等因素，被廣泛用于學(xué)生實驗中。但該法存在選擇性（專屬性）不強、靈敏度不高等缺陷而可能導(dǎo)致測定結(jié)果不準(zhǔn)確。特別是對血液樣品而言，眾多的有機小分子、蛋白等多可能對測定結(jié)果有較大的干擾。該實驗原有采用氫氧化鋇＋硫酸鋅、氯化汞等除蛋白的方法，利用重金屬方法除蛋白效果不太理想，且污染環(huán)境，樣品有時出現(xiàn)乳光，測定結(jié)果波動幅度大、誤差大。文獻報道[6]，利用1.5倍的乙腈消除血清中的蛋白，操作簡便，效果較好。但本實驗采用該方法去除蛋白測定結(jié)果還是顯示重現(xiàn)性差，實驗中我們發(fā)現(xiàn)不同個體家兔血清及出現(xiàn)的溶血的血清等都對測定結(jié)果影響較大。

該實驗利用分光光度計測定家兔血清中對乙酰氨基酚濃度方法靈敏度較低、影響因素多、經(jīng)常出現(xiàn)測定結(jié)果波動幅度大誤差大的現(xiàn)象。因此，我們認為在保證除盡血清中蛋白等大分子物質(zhì)的基礎(chǔ)上，關(guān)鍵是提高測定方法的靈敏度。差示分光光度法改用濃度比樣品稍低或稍高的標(biāo)準(zhǔn)溶液代替空白試劑來調(diào)節(jié)儀器的透光率以提高分光光度法精密度、準(zhǔn)確度和靈敏度。一般分光光度法其濃度測量的相對誤差在1%～3%，如采用示差分光度法測量，則誤差往往可減少到千分之幾。參考相關(guān)文獻[7-9]，本實驗以上述標(biāo)準(zhǔn)曲線中的一個樣品（13 μg/ml）為研究對象，分別以0.01 M氫氧化鈉溶液和水為基質(zhì)配制得到的對乙酰氨基酚溶液，以水配乙酰氨基酚溶液作參比，在200～350 nm波長范圍內(nèi)處掃描，得到△A曲線。結(jié)果顯示在0.01 M氫氧化鈉溶液中對乙酰氨基酚的△A曲線顯示在265 nm 的波長處有最大吸收差值，見圖1。 因此選用0.01 M氫氧化鈉溶液和水作配制（或稀釋）乙酰氨基酚（血清）樣品的介質(zhì)。

3.3差示分光光度法測定方法學(xué)驗證

按照上述方法，標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品在265 nm測定△A值對濃度數(shù)據(jù)進行回歸，得回歸方程：△A=0.027 c-0.004 5 R2=0.988 9，表明對乙酰氨基酚在1.3～13 μg范圍內(nèi)與△A呈良好的線性關(guān)系。本次研究結(jié)果顯示，血清樣品按上述方法預(yù)處理后，同一份樣品在6 h內(nèi)重復(fù)測定5次，△A相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于5%，表明樣品在實驗過程中穩(wěn)定，預(yù)處理方法簡便可行。考慮到乙腈的潛在毒性及成本，本實驗在樣品前處理沉淀蛋白的過程中，采用乙醇替換文獻[6]中的乙腈；另外改用差示分光光度法測定血清中的對乙酰氨基酚，該法可以在很大程度上消除干擾組分和背景吸收，提高分析方法的靈敏度。

3.4藥動曲線結(jié)果

用改進后的實驗方法進行實驗，繪制的藥時曲線，見圖2。結(jié)果顯示，對乙酰氨基酚在在家兔體內(nèi)的口服給藥基本符合一室動力學(xué)模型，最大吸收時間tmax介于50～90 min，90 min后對乙酰氨基酚基本處在清除期，240 min血藥濃度下降到最大濃度的1/10以下，因此該實驗可在240 min內(nèi)完成采血9～11次（吸收相，最大吸收點，清除相分別3～4個時間點），獲得藥物的藥動學(xué)參數(shù)。

圖1　對乙酰氨基酚差示光譜圖

圖2　血藥濃度-時間曲線

4　 討論

血藥濃度法估算口服對乙酰氨基酚藥動學(xué)參數(shù)是藥學(xué)專業(yè)生物藥劑學(xué)與藥物動力學(xué)課程主要的實驗內(nèi)容之一，對于學(xué)生理解藥物的藥動參數(shù)具有重要指導(dǎo)意義。其中，動物在給藥后順利取血及血藥濃度的準(zhǔn)確測定是該實驗成功的關(guān)鍵。本文在參考相關(guān)文獻的基礎(chǔ)上，綜合考慮學(xué)生實驗技術(shù)水平，儀器材料價廉易得、安全，實驗時間適中等多方面因素。對家兔取血方法，樣品前處理及分析測試方法等進行了改進，實踐證明，相對于以前的實驗方法，改進后的實驗操作簡便、取血順利；差示紫外分光光度法極大的提高了分析的靈敏度，降低了干擾因素。

總之，改進后的實驗方法操作行強，測定結(jié)果準(zhǔn)確，穩(wěn)定性與重現(xiàn)性均好，總體實驗時間適中，更適合學(xué)生教學(xué)實驗。

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Improvement of the Laboratory Teaching Course: Estimation of Orally Pharmacokinetic Parameters of Paracetamol in Rabbits

XIE Baogang1LIU Aihong2ZHAO Tiansheng3LAI Xiaoping31 Pharmacy College of Nanchang University, Nanchang 330006, China. 2 Forecasting and Analysis Center of Nanchang University, Nanchang 330006, China. 3 Deaprtment of Experiment Teaching Administration, Nanchang University, Nanchang 330006, China

[Abstract]Estimation of orally pharmacokinetic parameters of paracetamol by blood method in rabbits is one of the major experiments in the laboratory teaching course on bio-pharmaceutics and pharmacokinetics in pharmaceutical specialty. In this study, the method of obtaining plasma samples, sample preparation, and the assay for determining paracetamol in blood were optimized and improved. Our results showed that the improved method is simple and reliable for obtaining blood samples and pre-treatment, the differential ultraviolet spectrophotometric assay could significantly enhance the sensitivity of measuring analyte in blood. The improved experiment method was demonstrated to be good stability and reproducibility, which is suitable for student experiment in laboratory teaching course.

[Key words]Teaching improvement, Blood drug concentration method, Pharmacokinetic experiment, Differential ultraviolet spectrophotometric assay

doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2016.02.020

【文章編號】1674-9308（2016）02-0031-03