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    液相色譜串聯(lián)電化學(xué)檢測(cè)器測(cè)定人體血漿和尿液兒茶酚胺濃度

    2016-03-04 19:11:15王玲陽(yáng)愿望
    現(xiàn)代養(yǎng)生·下半月 2015年12期
    關(guān)鍵詞:兒茶酚胺

    王玲 陽(yáng)愿望

    【摘要】目的:建立一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確的測(cè)定人體血漿、尿中兒茶酚胺的方法,為臨床檢測(cè)和研究提供技術(shù)支持。方法:采用活性氧化鋁(AL2O3)對(duì)血漿和尿液標(biāo)本中的兒荼酚胺進(jìn)行酸解吸附、凈化,利用離子對(duì)反相高效液相色譜串聯(lián)電化學(xué)檢測(cè)器法(RP-HPLC-ECD)對(duì)其測(cè)定,工作電壓+0.80V,靈敏度50nA,以外標(biāo)法定量。結(jié)果:去甲腎上腺素、腎上腺素、多巴胺分離良好,出峰時(shí)間分別為8分鐘、9分鐘、11分鐘,且不受體內(nèi)其他內(nèi)源性物質(zhì)及代謝物干擾。樣本在2.0-100ng/ml濃度范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系,分離參數(shù)R≥1.5,其方法絕(相)對(duì)回收率分別為82.5-104.4%、83.4-100.7%、77.0-91.8%,最低檢測(cè)濃度1.0ng/ml。結(jié)論:RP-HPLC-ECD檢測(cè)人體血漿、尿中兒茶酚胺具有操作簡(jiǎn)便,分析快速,特異性高,重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。

    【關(guān)鍵詞】?jī)翰璺影?;反相高效液相色譜;嗜鉻細(xì)胞瘤

    單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)兒茶酚胺類(lèi)(Catecholamines,CAs)化合物,主要包括去甲腎上腺素(NE)、腎上腺素(E)、多巴胺(DA)。它是人類(lèi)中樞神經(jīng)重要的信息傳遞物質(zhì),不僅直接參與植物神經(jīng)功能的調(diào)控,還與許多功能型疾病有關(guān)。血漿和尿液中的CAs含量不但可作為嗜鉻細(xì)胞瘤的診斷依據(jù),而且可應(yīng)用于其他與兒茶酚胺有關(guān)疾病的研究,對(duì)研究這類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的生理功能及其代謝變化具有重要意義。傳統(tǒng)的熒光法與放射免疫測(cè)定法(Radio-immunassay,RIA),氣相色譜法(GC),或步驟繁瑣,或價(jià)格昂貴不易實(shí)現(xiàn)。由于電化學(xué)檢測(cè)器的高靈敏度,使該類(lèi)化合物體內(nèi)微量分析得以應(yīng)用。本文建立的RP-HPLC-ECD測(cè)定人體血漿及尿中的兒茶酚胺,具有方法簡(jiǎn)單,快速,專(zhuān)一,在應(yīng)用中重復(fù)性較好,適用于臨床測(cè)定及研究人體內(nèi)兒茶酚胺的代謝分析。

    1儀器與材料

    1.1儀器

    美國(guó)Waters e2695型高效液相色譜系統(tǒng)、Waters2465電化學(xué)檢測(cè)器及Empower2色譜數(shù)據(jù)處理工作站。XW-80A旋渦混合儀(海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司),DL-8M低速冷凍離心機(jī)(上海市離心機(jī)械研究所有限公司)。

    兒茶酚胺(NE、E、DA)標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司);AL2O3、Tris進(jìn)口分裝;甲醇、乙腈、冰乙酸、EDTA-Na2、B8(辛烷磺酸鈉)以上均為進(jìn)口色譜純;濃鹽酸、無(wú)水NaAc為國(guó)產(chǎn)優(yōu)級(jí)純或分析純?cè)噭?,試?yàn)用水為娃哈哈596ml裝飲用純凈水。

    2方法與結(jié)果

    2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

    準(zhǔn)確稱(chēng)取NE、E、DA標(biāo)準(zhǔn)品用0.1mol/L HCL配制成1μg/ml的CAs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,分裝后置于-70℃冰箱長(zhǎng)期保存。臨使用時(shí)用0.1mol/L HCL溶液稀釋成終濃度分別為100.0、50.0、20.0、5.0、2.0ng/ml五個(gè)濃度梯度。

    2.2 Tris-HCL緩沖液的配制

    稱(chēng)取Tris 12.114 g用0.1mol/HCL溶解配制成1.OmoFl Tris-HCL緩沖液,調(diào)PH值至8.9。

    2.3氧化鋁的活化

    參照Anton等方法,稱(chēng)100g氧化鋁于1000ml燒杯中,加2moFl HCL 500ml,90℃攪拌45min,冷卻,棄上清液及懸浮粒;加2mol/l HCL 250ml,70℃攪拌10mm,冷卻,棄上清液及懸浮粒,共兩次;加2mol/1 HCL 500ml,50℃攪拌10mm,冷卻,棄上清液及懸浮粒;反復(fù)用純水200ml/次,洗滌至PH≈3.4。將氧化鋁轉(zhuǎn)至蒸發(fā)皿,120℃烤1h,200℃烤2h,冷卻后在室溫下干燥貯存。每次做試驗(yàn)前取部分氧化鋁200~C烤2h進(jìn)行活化,冷卻至室溫,后稱(chēng)活化的氧化鋁20mg/管至15ml塑料刻度試管中備用。

    2.4色譜條件

    分析柱,C18柱(Hypersil ODS2 5μm4.6*250mm,大連依利特科學(xué)儀器有限公司)。流動(dòng)相:無(wú)水NaAc4.1g,EDTA-Na250mg,B8 80mg,冰乙酸7.5ml,乙腈80ml,加試驗(yàn)用水至1000ml,調(diào)節(jié)PH值至4.2,0.22μm濾膜過(guò)濾后超聲脫氣。流速0.45ml/min;電化學(xué)檢測(cè)器工作電壓+0.80V,Ag/AgCL為參比電極,Range=50 nA,柱溫40℃。此條件下NE、E、DA分離良好,如圖1a,圖1b所示。

    2.5樣品處理

    2.5.1標(biāo)本收集

    血漿標(biāo)本,宜在空腹臥床休息30min后抽取靜脈血,EDTA抗凝,4℃3500r/min,立即離心5分鐘,分離血漿后置-20℃凍存,檢測(cè)時(shí)室溫復(fù)融;尿液標(biāo)本,在容器中以5-10ml濃鹽酸作防腐處理,收集24小時(shí)尿并記錄尿量,混勻,取10ml置-20℃凍存,檢測(cè)時(shí)室溫復(fù)融。

    2.5.2樣品處理

    在2.3項(xiàng)下已加入活化氧化鋁的15ml塑料刻度試管內(nèi)加入0.4ml Tris-HCL緩沖液,取抗凝血,離心分離血漿1-2ml(離心后的尿液0.2ml),旋渦振蕩15min,使兒茶酚胺吸附在氧化鋁上,離心10min,棄上清液,沉淀用5ml試驗(yàn)用水(預(yù)冷)洗滌4次,離心,小心用棉簽盡量吸干水相,沉淀加入0.2 mol/l的HCL 0.2 ml,旋渦振蕩15min,將吸附于氧化鋁上的兒茶酚胺解析下來(lái),離心,取20lxl洗脫液用于進(jìn)樣,根據(jù)外標(biāo)法定量。

    2.6結(jié)果

    2.6.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

    血漿:分別取空白血漿1.0ml及空白尿樣0.2ml置15ml塑料刻度試管內(nèi),將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用0.1mol/HCL溶液稀釋成如“2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制”項(xiàng)下的標(biāo)準(zhǔn)工作液,混勻后照“2.5.2樣品處理”項(xiàng)下操作,進(jìn)樣,以外標(biāo)法峰面積對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸。CAs濃度在2.0-100ng/ml濃度范圍內(nèi)線性良好,結(jié)果如表1示。

    2.6.2精密度和重復(fù)性

    取同一濃度標(biāo)準(zhǔn)品分多次在相同的試驗(yàn)日和不同的試驗(yàn)日測(cè)定,得方法重復(fù)性;按處理方法反復(fù)測(cè)定得日內(nèi)變異系數(shù)(n=20)為1.44~2.48%,日問(wèn)變異系數(shù)(n=20)為3.51~7.63%。結(jié)果如表2示。

    2.6.3方法回收率

    取空白血漿、尿液作基質(zhì),用配成的(低、中、高)三種濃度分別為5.0、10.0、50.0ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)液分別加樣,按樣品處理方法處理測(cè)定,用實(shí)測(cè)濃度比加入濃度即得回收率。結(jié)果如表3所示。

    3討論

    (1)本實(shí)驗(yàn)采用酸性活化氧化鋁萃取的方法進(jìn)行生物樣品中的兒茶酚胺類(lèi)化合物提取,活化效果滿(mǎn)意,回收率與文獻(xiàn)報(bào)道相近。

    (2)色譜系統(tǒng)檢測(cè)條件設(shè)置多樣,其中色譜柱種類(lèi)、柱效、流動(dòng)相PH、離子對(duì)濃度、有機(jī)相比例等都是影響兒茶酚胺分離和定量的重要因素吲。本法取C18材料反相離子對(duì)色譜柱,流動(dòng)相PH4.2,乙腈8%,分離和檢測(cè)效果良好。采用國(guó)產(chǎn)色譜柱大幅降低成本。

    (3)本法樣品回收穩(wěn)定,峰圖分離完全,檢測(cè)電化學(xué)反應(yīng)呈良好線性關(guān)系和重現(xiàn)性,回收率分別為82.5-104.4%、83.4-100.7%、77.0-91.8%,回收率較高,精密度<8%,最低檢出限達(dá)40pg,全部峰圖在12分鐘內(nèi)出齊,表明本法具良好特異性、穩(wěn)定性和靈敏性,檢測(cè)速度也較寬,線性范圍(2.0-100ng/ml)較寬,能滿(mǎn)足臨床需求。

    (4)對(duì)本實(shí)驗(yàn)樣品的要求及固相萃取前處理時(shí)的一些注意事項(xiàng):本實(shí)驗(yàn)對(duì)血漿標(biāo)本要求嚴(yán)格,抽取靜脈血后應(yīng)立即在低溫條件下分離血漿并即時(shí)送檢,-20℃凍存待測(cè),避免反復(fù)凍融。標(biāo)本送檢不及時(shí)或未立即分離血漿對(duì)結(jié)果有較大影響,脂濁標(biāo)本對(duì)氧化鋁萃取分離(導(dǎo)致回收率降低)和檢測(cè)結(jié)果均有影響。由于NE、E、DA有兩個(gè)鄰位酚羥基,極易被氧化,而且氧化劑、熱、光、堿都會(huì)加速其氧化分解,故有條件時(shí)應(yīng)在避光及低溫條件下進(jìn)行操作處理樣本。

    (5)對(duì)制備好的實(shí)驗(yàn)樣品的保存及降解情況作統(tǒng)計(jì),證實(shí)樣品在48h之內(nèi)無(wú)論4℃存放還是-70℃,其含量變化不大,72h后含量變化有統(tǒng)計(jì)意義。因此制備好的樣品在3d內(nèi)檢測(cè)比較準(zhǔn)確。

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