丹參酮ⅡA對脂質運載蛋白2誘導人臍靜脈內皮細胞損傷的影響研究

萬 強，劉中勇

·論著·

·中醫(yī)·中西醫(yī)結合研究·

丹參酮ⅡA對脂質運載蛋白2誘導人臍靜脈內皮細胞損傷的影響研究

萬 強，劉中勇

目的 探討丹參酮ⅡA對脂質運載蛋白2(LCN-2)誘導人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)損傷的保護作用及其與細胞外信號調節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)信號轉導通路的關系。方法 2015年3—5月將HUVEC分為不同濃度組：分別以0、5、10、20 μmol/L LCN-2作用HUVEC 48 h；不同作用時間組：分別以10 μmol/L LCN-2作用HUVEC 0、12、24、48 h；不同藥物干預組：對照組(未做任何處理)、LCN-2組(LCN-2 10 μmol/L刺激48 h)、LCN-2+丹參酮ⅡA組(10 μmol/L丹參酮ⅡA預處理HUVEC 1 h后再加10 μmol/L LCN-2刺激48 h)、LCN-2+PD98059組〔PD98059(終濃度20 μmol/L)預處理HUVEC 30 min后再加10 μmol/L LCN-2刺激48 h〕。采用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)檢測細胞增殖〔吸光度(A值)〕，流式細胞術檢測細胞凋亡，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測上清液中白介素6(IL-6)、單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)表達水平，Western blotting法檢測HUVEC中B淋巴細胞癌2(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、磷酸化細胞外信號調節(jié)蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)表達水平。結果 與0 μmol/L組和5 μmol/L組比較，10 μmol/L組、20 μmol/L組A值、Bcl-2表達水平下降，細胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bax、p-ERK1/2表達水平升高(P<0.05)；與10 μmol/L組比較，20 μmol/L組IL-6、MCP-1表達水平升高(P<0.05)。與0 h組比較，24 h組MCP-1表達水平升高(P<0.05)；與0 h組和24 h組比較，48 h組、72 h組A值、Bcl-2表達水平下降，細胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bax、p-ERK1/2表達水平升高(P<0.05)；與48 h組比較，72 h組IL-6表達水平升高，Bcl-2、p-ERK1/2表達水平下降(P<0.05)。與對照組比較，LCN-2組、LCN-2+丹參酮ⅡA組、LCN-2+PD98059組A值、Bcl-2表達水平下降，細胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bax表達水平升高，LCN-2組及LCN-2+丹參酮ⅡA組p-ERK1/2表達水平升高(P<0.05)；與LCN-2組比較，LCN-2+丹參酮ⅡA組、LCN-2+PD98059組A值、Bcl-2表達水平升高，細胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bax、p-ERK1/2表達水平下降(P<0.05)；與LCN-2+丹參酮ⅡA組比較，LCN-2+PD98059組A值、p-ERK1/2表達水平下降，細胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bcl-2、Bax表達水平升高(P<0.05)。結論 丹參酮ⅡA可通過抑制ERK1/2信號轉導通路，減輕LCN-2誘導的HUVEC損傷。

丹參酮ⅡA；脂籠蛋白質類；細胞外信號調節(jié)MAP激酶類；人臍靜脈內皮細胞

萬強，劉中勇.丹參酮ⅡA對脂質運載蛋白2誘導人臍靜脈內皮細胞損傷的影響研究[J].中國全科醫(yī)學，2016，19(9)：1086-1090.[www.chinagp.net]

Wan Q，Liu ZY.Effect of tanshinone ⅡA on human umbilical vein endothelial cell injury induced by lipocalin-2[J].Chinese General Practice，2016，19(9)：1086-1090.

脂質運載蛋白2(lipocalin-2，LCN-2)又名中性粒細胞明膠酶脂質運載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)，是一種新型脂肪細胞因子。內皮細胞損傷、凋亡是動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)進程的起始階段[1]。研究表明,LCN-2可引起內皮細胞損傷從而促進AS形成[2]。丹參酮ⅡA(tanshinone ⅡA)為唇形科植物丹參的主要脂溶性成分，研究表明,丹參酮ⅡA可從多種途徑發(fā)揮抗AS效應[3]，但其機制尚未完全闡明。本實驗以人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)為模型，加用丹參酮ⅡA及細胞外信號調節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated protein kinase 1/2，ERK1/2)信號轉導通路特異性阻滯劑PD98059，觀察丹參酮ⅡA對LCN-2誘導HUVEC損傷的影響，并探討其抗AS機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑 2015年3—5月，HUVEC購于Cascade Biologics公司，丹參酮ⅡA(純度≥98%)、二甲基亞砜(DMSO)購于美國Sigma公司，胎牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司，DMEM培養(yǎng)基購于美國Gibco公司，LCN-2購于美國Acrobiosystems公司，PD98059購于美國Tocris Bioscience公司，Annexin V-FITC試劑盒購于美國Bio Vision公司，白介素6(IL-6)、單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購于美國eBioscience公司，B淋巴細胞癌2(Bcl-2)抗體、Bcl-2相關X蛋白(Bax)抗體、磷酸化細胞外信號調節(jié)蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)抗體購于美國Cell Signal Technology公司。

1.2 主要儀器 恒溫細胞培養(yǎng)箱、超凈臺、低溫高速離心機、酶標儀購于美國Thermo公司，全自動生化儀購于美國Beckman公司，熒光倒置顯微鏡購于日本奧林巴斯公司，流式細胞儀購于美國ACEA Biosciences公司，電泳儀購于美國Bio-Rad公司。

1.3 研究方法

1.3.1 細胞分組及處理 將HUVEC分為不同濃度組：分別以0、5、10、20 μmol/L LCN-2作用HUVEC 48 h[4]。不同作用時間組：分別以10 μmol/L LCN-2作用HUVEC 0、12、24、48 h。不同藥物干預組：(1)對照組(未做任何處理)；(2)LCN-2組：LCN-2 10 μmol/L刺激48 h；(3)LCN-2+丹參酮ⅡA組：10 μmol/L丹參酮ⅡA[5]預處理HUVEC 1 h后再加10 μmol/L LCN-2刺激48 h；(4)LCN-2+PD98059組：PD98059(終濃度20 μmol/L[5])預處理HUVEC 30 min后再加10 μmol/L LCN-2刺激48 h。

1.3.2 四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)檢測細胞增殖 HUVEC以1×104/孔接種于96孔板，24 h后撤去血清，分組見1.3.1，每組設6個復孔。干預完成后以20 μl MTT (5 g/L)37 ℃孵育4 h，每孔加DMSO 150 μl低速振蕩10 min使結晶物溶解，酶標儀測570 nm處吸光度(A值)。

1.3.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 HUVEC以2×105/孔接種于12孔板，24 h后換無血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，分組見1.3.1，每組設6個復孔。收集細胞，加Annexin V-FITC及碘化丙啶(PI)雙染，流式細胞術檢測細胞凋亡率。

1.3.4 ELISA法檢測IL-6、MCP-1表達水平 取對數(shù)生長期的HUVEC以1×105/ml接種于培養(yǎng)皿，分組見1.3.1，每組設6個復孔。收集上清液，ELISA法檢測上清液中IL-6、MCP-1表達水平，操作步驟參照說明書。

1.3.5 Western blotting法檢測Bcl-2、Bax、p-ERK1/2表達水平 分組見1.3.1，每組設6個復孔，提取HUVEC總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，每孔取上清液20 μl加上樣緩沖液，100 ℃加熱5 min。凝膠電泳轉膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗(1∶1 000)4 ℃過夜，二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，ECL系統(tǒng)顯色，以β-actin為內參，采用Image Tool 3.0進行灰度值分析。

2 結果

2.1 不同濃度及不同作用時間LCN-2對HUVEC的作用 不同濃度組A值、細胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bcl-2、Bax、p-ERK1/2表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中與0 μmol/L組和5 μmol/L組比較，10 μmol/L組、20 μmol/L組A值、Bcl-2表達水平下降，細胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bax、p-ERK1/2表達水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與10 μmol/L組比較，20 μmol/L組IL-6、MCP-1表達水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1、圖1)。

不同作用時間組A值、細胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bcl-2、Bax、p-ERK1/2表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中與0 h組比較，24 h組MCP-1表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與0 h組和24 h組比較，48 h組、72 h組A值、Bcl-2表達水平下降，細胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bax、p-ERK1/2表達水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與48 h組比較，72 h組IL-6表達水平升高，Bcl-2、p-ERK1/2表達水平下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2、圖2)。

2.2 不同藥物干預對HUVEC的作用 不同藥物干預組A值、細胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bcl-2、Bax、p-ERK1/2表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中與對照組比較，LCN-2組、LCN-2+丹參酮ⅡA組、LCN-2+PD98059組A值、Bcl-2表達水平下降，細胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bax表達水平升高，LCN-2組和LCN-2+丹參酮ⅡA組p-ERK1/2表達水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與LCN-2組比較，LCN-2+丹參酮ⅡA組、LCN-2+PD98059組A值、Bcl-2表達水平升高，細胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bax、p-ERK1/2表達水平下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與LCN-2+丹參酮ⅡA組比較，LCN-2+PD98059組A值、p-ERE1/2表達水平下降，細胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bcl-2、Bax表達水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表3、圖3)。

表1 不同濃度組A值、細胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bcl-2、p-ERK1/2、Bax表達水平比較

注：A值=吸光度，IL-6=白介素6，MCP-1=單核細胞趨化蛋白1，Bcl-2=B淋巴細胞癌2，Bax=Bcl-2相關X蛋白，p-ERK1/2=磷酸化細胞外信號調節(jié)蛋白激酶1/2；與0 μmol/L組比較，aP<0.05；與5 μmol/L組比較，bP<0.05；與10 μmol/L組比較，cP<0.05

表2 不同作用時間組A值、細胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bcl-2、p-ERK1/2、Bax表達水平比較

注：與0 h組比較，aP<0.05；與24 h組比較，bP<0.05；與48 h組比較，cP<0.05

表3 不同藥物干預組A值、細胞凋亡率、IL-6、MCP-1、Bcl-2、p-ERK1/2、Bax表達水平比較

注：LCN-2=脂質運載蛋白2；與對照組比較，aP<0.05；與LCN-2組比較，bP<0.05；與LCN-2+丹參酮ⅡA組比較，cP<0.05

注：p-ERK1/2=磷酸化細胞外信號調節(jié)蛋白激酶1/2，Bax=Bcl-2相關X蛋白，Bcl-2=B淋巴細胞癌2

圖1 Western blotting法檢測不同濃度組Bcl-2、Bax、p-ERK1/2的表達水平

Figure 1 Levels of Bcl-2,Bax and p-ERK1/2 expression among different concentration groups detected by Western blotting

圖2 Western blotting法檢測不同作用時間組Bcl-2、Bax、p-ERK1/2的表達水平

Figure 2 Levels of Bcl-2,Bax and p-ERK1/2 expression among different time groups detected by Western blotting

注：LCN-2=脂質運載蛋白2

圖3 Western blotting法檢測不同藥物干預組Bcl-2、Bax、p-ERK1/2的表達水平

Figure 3 Levels of Bcl-2,Bax and p-ERK1/2 expression among different drugintervention groups detected by Western blotting

3 討論

LCN-2于中性粒細胞中被發(fā)現(xiàn)并分離，是脂質運載蛋白家族的2號成員，相對分子量約25 kDa，廣泛分布于腎臟、肺臟、肝臟及小腸等多種組織器官中，具有多種生物學功能，在細胞的增殖與凋亡及炎性反應過程中起調節(jié)作用[6]。既往對LCN-2的研究主要集中在腎臟病、感染性疾病及腫瘤等方面，近年來研究表明，LCN-2可作為心血管疾病生物標志物，獨立預測心血管事件的發(fā)生[7]。AS患者血清LCN-2水平顯著升高，且與AS嚴重程度呈正相關[8]，LCN-2水平在AS患者不穩(wěn)定粥樣斑塊中亦升高[9]，均提示LCN-2與AS形成密切相關。內皮細胞損傷后釋放的炎性因子可致單核細胞黏附遷移、中膜平滑肌細胞增生、泡沫細胞堆積形成脂質斑塊，最終促進AS形成[1]。IL-6及MCP-1在AS慢性炎癥中扮演重要角色，對巨噬細胞、單核細胞的遷移和激活起調控作用，并能促進血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)增殖，參與AS形成過程[10]。Bcl-2基因家族蛋白中的促凋亡蛋白Bax和抑凋亡蛋白Bcl-2的比例對細胞凋亡起直接調控作用[11]。Bax可通過與細胞外膜的電壓依賴性陰離子通道(voltage dependent anion channel，VDAC)或細胞內膜的腺苷轉位因子(adenine nucleotide translocator，ANT)的結合，介導線粒體膜上的膜通透性孔道的開放，促進細胞凋亡，而Bcl-2可通過與Bax競爭性結合ANT，或直接阻止Bax與VDAC、ANT結合以發(fā)揮其抗凋亡效應[12]。本研究結果顯示，LCN-2可抑制HUVEC增殖、上調HUVEC內Bax/Bcl-2比例，以促進HUVEC凋亡、誘導分泌IL-6及MCP-1等從而加重HUVEC損傷。

ERK1/2信號轉導通路是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPKs)家族分支之一，ERK1/2可通過一系列級聯(lián)磷酸化將細胞外信號轉導至細胞核內，調控HUVEC的多種基因轉錄，在構建細胞骨架、維持細胞形態(tài)、調節(jié)細胞增殖及凋亡等生物學進程中起重要作用[13]，該信號轉導通路的激活可通過促進VSMC增殖、炎性細胞浸潤等促進AS形成[14]。既往研究證實，p-ERK1/2參與了HUVEC中炎性因子表達的調控[15]。本研究結果顯示，LCN-2可呈濃度及作用時間依賴性誘導HUVEC中p-ERK1/2表達水平的增加，并誘導分泌炎性因子IL-6及MCP-1，加重HUVEC損傷，提示LCN-2對HUVEC的損傷作用可能與激活ERK1/2信號轉導通路有關。

丹參酮ⅡA能通過抗氧化應激、抗炎、調節(jié)血脂、抑制平滑肌細胞增殖和遷移、減少巨噬細胞浸潤等多種途徑發(fā)揮抗AS效應[3，16-17]。研究表明，丹參酮ⅡA的抗AS機制與抑制ERK1/2信號轉導通路密切相關，丹參酮ⅡA可通過抑制ERK1/2信號轉導通路下調c-fos表達水平，顯著抑制頸動脈球囊損傷大鼠VSMC增殖并減少血管內膜增生，從而延緩AS進程[18]。但丹參酮ⅡA是否可通過抑制ERK1/2信號轉導通路，減輕LCN-2誘導的HUVEC損傷而抗AS尚不清楚。本研究結果證實，丹參酮ⅡA及PD98059均可顯著降低HUVEC中p-ERK1/2表達水平、減輕LCN-2誘導的HUVEC增殖抑制、下調Bax/Bcl-2比例以抑制HUVEC凋亡、降低IL-6及MCP-1表達水平，提示丹參酮ⅡA的抗AS機制可能通過抑制ERK1/2信號轉導通路，減輕LCN-2誘導的HUVEC損傷得以實現(xiàn)，此發(fā)現(xiàn)有望為丹參酮ⅡA在AS防治中的應用提供新依據(jù)。丹參酮ⅡA對LCN-2抑制HUVEC增殖、誘導HUVEC凋亡、促進分泌IL-6及MCP-1、調節(jié)Bax表達水平的作用強于PD98059，這可能是HUVEC內存在其他信號轉導通路，且各信號轉導通路間相互作用的結果。丹參酮ⅡA可能也通過其他信號轉導通路參與了減輕LCN-2誘導的HUVEC損傷過程。丹參酮ⅡA的抗AS作用機制和臨床應用仍需大量基礎實驗及臨床試驗研究加以明確。

作者貢獻：萬強進行實驗實施、評估、資料收集、撰寫論文、成文、進行質量控制及審校；劉中勇進行實驗設計與實施、資料收集整理、并對文章負責。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：陳素芳)

Effect of Tanshinone ⅡA on Human Umbilical Vein Endothelial Cell Injury Induced by Lipocalin-2

WANQiang，LIUZhong-yong.DepartmentofMedicalCardiology，AffiliatedHospitalofJiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Nanchang330006，China

Objective To investigate the protective effect of tanshinone ⅡA on human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) injury induced by lipocalin-2 (LCN-2) and its relation with ERK1/2 signal transduction pathway.Methods From March to May in 2015,HUVEC were divided into different concentration groups:(0,5,10 and 20 μmol/L LCN-2 for 48 h),different time groups:(10 μmol/L LCN-2 for 0,12,24 and 48 h) and different drug intervention groups:control group,LCN-2 group (10 μmol/L LCN-2 for 48 h),LCN-2+tanshinone ⅡA group (10 μmol/L tanshinone ⅡA for 1 h then 10 μmol/L LCN-2 for 48 h) and LCN-2+PD98059 group (20 μmol/L PD98059 for 30 min then 10 μmol/L LCN-2 for 48 h).MTT assay was used to detect cell proliferation and flow cytometry was used to detect cell apoptosis;the levels of interleukin-6(IL-6) and monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) were determined by enzyme-linked immuno-sorbent assay (ELISA),and the levels of Bcl-2,Bax and p-ERK1/2 in HUVEC were determined by Western blotting.Results Compared with 0 μmol/L group and 5 μmol/L gruop,10 μmol/L group and 20 μmol/L group were significantly lower in A value and the level of Bcl-2 but were significantly higher in apoptosis rate,the levels of IL-6,MCP-1,Bax and p-ERK1/2(P<0.05).Compared 10 μmol/L group,20 μmol/L group was higher in the levels of IL-6 and MCP-1 (P<0.05).Compared with 0 h group,24 h group was higher in the level of MCP-1 (P<0.05).Compared with 0 h group and 24 h group,48 h group and 72 h group were lower in A value and the level of Bcl-2 but were higher in apoptosis rate and the levels of IL-6,MCP-1,Bax and p-ERK1/2 (P<0.05).Compared with 48 h group,72 h group was higher in the level of IL-6 but was lower in the levels of Bcl-2 and p-ERK1/2 (P<0.05).Compared with control group,LCN-2 group,LCN-2+tanshinone ⅡA group and LCN-2+PD98059 group were lower in A value and the level of Bcl-2 but were higher in apoptosis rate and the levels of IL-6,MCP-1,Bax and LCN-2 group,LCN-2+tanshinone ⅡA group were higher in the level of p-ERK1/2 (P<0.05).Compared with LCN-2 group,LCN-2+tanshinone ⅡA group and LCN-2+PD98059 group were higher in A value and the level of Bcl-2 but were lower in apoptosis rate and the levels of IL-6,MCP-1,Bax and p-ERK1/2 (P<0.05).Compared with LCN-2+tanshinone ⅡA group,LCN-2+PD98059 group was lower in A value and the level of p-ERK1/2 but was higher in apoptosis rate and the levels of IL-6,MCP-1,Bcl-2 and Bax(P<0.05).Conclusion Tanshinone ⅡA attenuates HUVEC injury induced by LCN-2 and its mechanism may be related to the inhibition of ERK1/2 signal transduction pathway.

Tanshinone ⅡA；Lipocalins；Extracellular signal-regulated MAP kinases；Human umbilical vein endothelial cells

國家自然科學基金資助項目(81460680)；江西省科技計劃資助項目(20135BBG70002)

330006 江西省南昌市，江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院心血管病科

劉中勇，330006 江西省南昌市，江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院心血管病科；E-mail：liuzhongyong2014@163.com

R 363

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.09.021

2015-06-14；

2016-01-12)