不同提取方法對(duì)水龜蟲多糖含量的影響

許 龍，常江春，高 敏，房月春，欒 雪，陳 琦，羅志文*

( 1.佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江佳木斯 154007；2.佳木斯大學(xué)應(yīng)用昆蟲研究所，黑龍江佳木斯 154007)

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不同提取方法對(duì)水龜蟲多糖含量的影響

許 龍1，2，常江春1，高 敏1，房月春1，欒 雪1，陳 琦1，羅志文1，2*

( 1.佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江佳木斯 154007；2.佳木斯大學(xué)應(yīng)用昆蟲研究所，黑龍江佳木斯 154007)

水龜蟲科Hydrophilidae是昆蟲綱Insecta有翅亞綱Pterygota鞘翅目Coleoptera多食亞目Polyphaga昆蟲的總稱，也稱牙甲科。我國(guó)已記載的水龜蟲昆蟲在80種以上，其中大型種類包括尖突水龜蟲Hydrophilusacuminatus，又名尖突巨牙甲，它廣泛分布在湖泊、池塘、魚塘及有水草的小溪或水溝中[1]。水龜蟲地理分布范圍廣，國(guó)內(nèi)主要分布于東北三省、北京、天津等地，南到海南、西到西藏也有少量分布的記錄，國(guó)外在日本、朝鮮、緬甸等國(guó)有其分布的記載。水龜蟲的食物螺螄是人畜吸蟲宿主，因此將水龜蟲劃為有益昆蟲。生活在魚池中水龜蟲幼蟲也有捕食魚苗的情況，因此它也是危害塘魚的一種常見害蟲。

水龜蟲可作為藥材應(yīng)用于我國(guó)中藥領(lǐng)域，主治兒童遺尿。有關(guān)國(guó)內(nèi)的水龜蟲文獻(xiàn)資料記載，學(xué)者的研究多集中在對(duì)水龜蟲的生態(tài)學(xué)、行為習(xí)性、發(fā)生規(guī)律及保護(hù)技術(shù)等領(lǐng)域，且以分類學(xué)和生態(tài)學(xué)研究為主[2-4]，而對(duì)水龜蟲藥用成分研究開展較少。人類對(duì)于水龜蟲應(yīng)用多在食用方面，其體內(nèi)含有豐富的蛋白質(zhì)、粗脂肪及礦物質(zhì)，可作為人類的補(bǔ)鈣食品，而對(duì)于其保護(hù)和開發(fā)利用更是沒有深入研究[5]。參考國(guó)內(nèi)昆蟲多糖研究的相關(guān)文獻(xiàn)[6-9]，該試驗(yàn)分別采用熱水浸提、稀堿液提取、酶解提取3種提取方法對(duì)水龜蟲多糖進(jìn)行提取，采用苯酚-硫酸法測(cè)定水龜蟲多糖的含量，通過比較各種方法對(duì)水龜蟲多糖含量的影響，確定了適合水龜蟲多糖的提取方法，為建立高效、實(shí)用的水龜蟲多糖提取途徑提供技術(shù)參考，也為后續(xù)水龜蟲的藥用價(jià)值開發(fā)提供可靠的科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料水龜蟲藥材郵購(gòu)于安徽省中藥材同仁堂品質(zhì)店，經(jīng)佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院羅志文副教授鑒定為尖突水龜蟲Hydrophilusacuminatus，原藥材及樣品現(xiàn)保存于佳木斯大學(xué)應(yīng)用昆蟲研究所。

1.2樣品預(yù)處理采用精細(xì)中藥粉碎機(jī)對(duì)干燥后的水龜蟲原藥材進(jìn)行粉碎，粉碎后過50目篩，放于室溫下干燥后保存?zhèn)溆?。預(yù)處理采用石油醚去除藥材中的脂溶性雜質(zhì)成分，采用95%乙醇去除單糖、低聚糖等干擾性成分。試驗(yàn)按照料液比為1∶3(W/V)的量加入石油醚，25 ℃常溫下浸泡12 h后，抽濾，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮回收石油醚，重復(fù)3次，并于50 ℃恒溫箱干燥后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3試驗(yàn)方案

1.3.1多糖的提取工藝流程。原料→粉碎→預(yù)處理→過濾→濾渣→室溫晾干→提取→紗布過濾→離心→上清液濃縮→乙醇沉淀→離心→溶劑洗滌→低溫干燥→多糖樣品。

1.3.2多糖提取試驗(yàn)。

1.3.2.1水提法。稱取經(jīng)過預(yù)處理的水龜蟲干燥粉末25 g，加入5倍量的蒸餾水，煮沸1 h，過濾，濾渣重復(fù)水提1次，合并濾液，在50 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將濾液濃縮至適當(dāng)?shù)捏w積，加入3倍量的95%乙醇沉淀，冰箱冷藏過夜，離心后沉淀用無(wú)水乙醇洗滌脫水2次，低溫干燥得粗多糖，測(cè)定水龜蟲多糖含量。

1.3.2.2堿提法。 稱取經(jīng)過預(yù)處理的水龜蟲干燥粉末9份，各25 g，以料液比1∶10的量加入稀堿液，設(shè)計(jì)堿液濃度為0.150、0.020、0.025 mol/L；恒溫水浴溫度分別為60、70、80 ℃；提取時(shí)間為1、2、3 h；重復(fù)1次，合并提取液，4層紗布過濾，濾液用鹽酸調(diào)pH 7.0，在50 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將濾液濃縮至適當(dāng)?shù)捏w積，3倍量的95%乙醇沉淀，冰箱冷藏過夜，離心后沉淀用無(wú)水乙醇洗滌脫水2次，低溫干燥得粗多糖，測(cè)定水龜蟲多糖含量。

1.3.2.3酶解法。稱取經(jīng)過預(yù)處理的水龜蟲干燥粉末9份，各25 g，加入10倍量的蒸餾水，設(shè)計(jì)木瓜蛋白酶用量為100、150、200 μg/g，恒溫水浴溫度分別為45、50、60 ℃；提取時(shí)間為1、2、3 h；試驗(yàn)完成后，迅速升溫至100 ℃下酶滅活5 min，4層紗布過濾，在50 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將濾液濃縮至適當(dāng)?shù)捏w積，3倍量的95%乙醇沉淀，冰箱冷藏過夜，離心后沉淀用無(wú)水乙醇洗滌脫水2次，低溫干燥得粗多糖，測(cè)定水龜蟲多糖含量。

1.3.3多糖含量測(cè)定。

1.3.3.1原理。采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量，以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，原理是苯酚試劑可與游離單糖或寡糖、己糖、糖醛酸以及糖的甲基衍生物發(fā)生顯色反應(yīng)，己糖在490 nm波長(zhǎng)(戊糖及糖醛酸在480 nm)處有最大吸收峰，且吸收值與含糖量呈線性關(guān)系。

1.3.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線制作。稱取105 ℃干燥的葡萄糖粉末92.9 mg，在100 mL容量瓶中定容。吸取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液5、10、15、20、25 μL，分別置于比色管中，加蒸餾水使體積達(dá)1.0 mL，再加入5%苯酚溶液，搖勻，快速加入3.25 mL濃硫酸，室溫顯色25 min。另取蒸餾水1.0 mL，加入苯酚和濃硫酸，作為空白對(duì)照。在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定樣品中的吸光度值，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo)繪制出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，得回歸方程y=0.009 2x-0.006 2(R2=0.997 7)。

圖1　葡萄糖吸光度值標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of glucose absorbance value

1.3.3.3樣品多糖含量測(cè)定。吸取待測(cè)樣品溶液0.5 mL，加入蒸餾水至1.0 mL，按“1.3.3.2”操作步驟測(cè)定吸光度，并從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品溶液的多糖含量。

2結(jié)果與分析

2.1熱水浸提法試驗(yàn)采用熱水浸提法，得到的水龜蟲多糖經(jīng)苯酚-硫酸法測(cè)定，得出多糖含量為1.53%。

2.2堿液提取樣品分為9組，每組按料液比1∶10加入稀堿液提取水龜蟲多糖，苯酚-硫酸法測(cè)定多糖的含量。從表1可以看出，與熱水浸提法比較，使用稀堿液提取的水龜蟲多糖含量有了不同程度的提高，各因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)多糖含量的影響依次為堿液濃度>提取溫度>提取時(shí)間，稀堿液提取水龜蟲多糖的最佳濃度為0.020 mol/L，試驗(yàn)提取溫度60 ℃，提取時(shí)間為2 h。按這個(gè)最佳試驗(yàn)條件對(duì)水龜蟲重復(fù)試驗(yàn)3次，測(cè)定多糖含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)稀堿液提取的粗多糖含量平均為2.61%。

表1稀堿液提取水龜蟲多糖條件及結(jié)果

Table 1Conditions and results of extracting polysaccharide fromHydrophilusacuminatusby alkali liquor

試驗(yàn)組Experimen-talgroup堿液濃度Alkaliliquorconcentrationmol/L提取溫度Extractiontemperature℃提取時(shí)間Extractiontime∥h多糖含量Polysaccharidecontent∥%10.0156012.2120.0157022.6130.0158032.5540.0206023.0150.0207032.5260.0208012.8270.0256032.9480.0257012.7490.0258022.22

2.3酶解法由表2可見，與熱水浸提法相比，酶解法提取水龜蟲多糖含量也高于水提法，各因素對(duì)多糖含量的影響依次為酶用量>提取溫度>提取時(shí)間，試驗(yàn)的最佳條件為溫度50 ℃、酶用量100 μg/g、提取時(shí)間2 h。按這個(gè)最佳試驗(yàn)條件對(duì)水龜蟲重復(fù)試驗(yàn)3次，測(cè)定多糖含量，得出酶解法提取的粗多糖含量平均為2.66%。

表2木瓜蛋白酶提取水龜蟲多糖條件及結(jié)果

Table 2Conditions and results of extracting polysaccharide fromHydrophilusacuminatusby papain

試驗(yàn)組Experimen-talgroup酶用量Enzymedosageμg/g提取溫度Extractiontemperature℃提取時(shí)間Extractiontime∥h多糖含量Polysaccharidecontent∥%11004512.6121504522.5132004532.3341005023.1251505032.6462005012.7671006032.1381506012.7192006022.51

3結(jié)論與討論

采用水提法、堿液提取法和酶解法3種方法對(duì)水龜蟲多糖的提取進(jìn)行了研究，所得多糖的含量分別為1.53%、2.61%、2.66%。從提取的多糖含量來看，水提法的含量最低，酶解法的最高，堿液提取法提取的多糖含量介于兩者之間，以糖含量來區(qū)分堿液提取和酶提取的優(yōu)劣不明顯；而從環(huán)保節(jié)約成本方面考慮，堿液法易污染環(huán)境，廢液必須經(jīng)過處理才能排出，酶解法的溶劑和能源消耗較少，且溫度過高酶失活。所以酶解法綜合性好，建議水龜蟲多糖采用酶解的方法進(jìn)行提取。

通過酶解法來提取水龜蟲多糖，可以獲得非常理想的優(yōu)質(zhì)水龜蟲多糖，具有成本低、無(wú)污染、效率高等優(yōu)點(diǎn)，可為筆

者后期開展水龜蟲多糖的分離純化、多糖成分分析及對(duì)荷瘤小鼠抗腫瘤活性等試驗(yàn)積累試驗(yàn)數(shù)據(jù)，也為將來開發(fā)優(yōu)良的昆蟲多糖藥物及功能性食品服務(wù)。

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摘要[目的] 研究水龜蟲多糖的提取條件。[方法] 分別采用3種方法對(duì)水龜蟲多糖進(jìn)行了提取，采用苯酚-硫酸法進(jìn)行多糖含量測(cè)定，對(duì)比不同提取方法中多糖的含量差異。[結(jié)果] 熱水浸提、堿提法和酶解法3種方法對(duì)水龜蟲多糖提取所得多糖的含量分別為1.53%、2.61%、2.66%。[結(jié)論] 通過試驗(yàn)確定了酶解法為水龜蟲多糖的提取最佳方法。

關(guān)鍵詞水龜蟲多糖；提取方法；含量測(cè)定；條件因素

Effect of Different Extraction Methods on the Polysaccharide Content inHydrophilusacuminatus

XU Long1,2, CHANG Jiang-chun1, GAO Min1, LUO Zhi-wen1,2*et al(1. College of Life Sciences, Jiamusi University, Jiamusi, Heilongjiang 154007; 2. Institute of Applied Insect, Jiamusi University, Jiamusi, Heilongjiang 154007)

Abstract[Objective] To study conditions for extracting polysaccharide fromHydrophilusacuminatus. [Method] Three methods were adopted to extract polysaccharide fromHydrophilusacuminatus, polysaccharide content was determined by phenol sulfuric acid method, and polysaccharide contents extracted by different methods were compared. [Result] The polysaccharide content inHydrophilusacuminatusextracted by hot water extraction, alkali extraction and enzymatic hydrolysis was 1.53%, 2.61%, 2.66%, respectively. [Conclusion] Enzymatic hydrolysis is the best method for extracting polysaccharide fromHydrophilusacuminatus.

Key wordsHydrophilusacuminatuspolysaccharide; Extraction method; Determination of content; Condition factors

收稿日期2015-12-07

作者簡(jiǎn)介許龍(1971- )，男，黑龍江佳木斯人，副教授，碩士，從事資源昆蟲學(xué)研究。*通訊作者，副教授，碩士，碩士生導(dǎo)師，從事昆蟲學(xué)研究。

基金項(xiàng)目黑龍江省大學(xué)生科技創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目校級(jí)項(xiàng)目(2014xj016)。

中圖分類號(hào)S 186;X 174

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)01-178-02