大王棕內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究

王忠,羅都強(qiáng)

(河北大學(xué)藥物化學(xué)與分子診斷教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071002)

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大王棕內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究

王忠,羅都強(qiáng)

(河北大學(xué)藥物化學(xué)與分子診斷教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071002)

摘要：通過(guò)高效液相色譜法，正相硅膠柱色譜法、凝膠柱色譜法等分離方法對(duì)大王棕內(nèi)生真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，再應(yīng)用NMR和MS等現(xiàn)代波譜分析方法對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，從中首次分離鑒定了6個(gè)化合物，分別為1’, 2’-epoxy-3’, 4’-didehydropenicillide.；丁二酸；3β- 羥基- 5α, 8α- 過(guò)氧化麥角甾- 6, 22- 二烯；ergosta- 7, 22- dien- 3β, 5α, 6α- triol；3β- 羥基- 麥角甾- 5, 7, 22- 三烯；4- 羥基苯乙酸。

關(guān)鍵詞：大王棕；化學(xué)成分；結(jié)構(gòu)鑒定

大王棕也稱大王椰子，植株很高大，但是種子小的如黃豆一般[1]，大王棕樹(shù)形及其美觀好看，是一種優(yōu)良的觀光綠化喬木，極其合適在西雙版納栽種，其果實(shí)富含油脂，可以作為飼料，種子也可以用作鴿子的飼料，葉子可以作為掃把，葉柄可以加工制作成牙簽[2]，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

1主要儀器與材料

植物內(nèi)生真菌Pestalotiopsis briosiana采自海南尖峰大王棕葉子，河北大學(xué)藥物化學(xué)與分子診斷教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種庫(kù)保藏。Bruker AM-600核磁共振儀(德國(guó)BRUKER光譜儀器公司)；Bruker Apex-Ultra 7.0 T質(zhì)譜儀(德國(guó)BRUKER光譜儀器公司)；GF254薄層層析硅膠(青島海洋化工廠)；柱層析硅膠(100-200、200-300目，青島海洋化工廠)；Sephadex LH-20凝膠(瑞典Amersham Biosciences公司)；

2菌株的發(fā)酵

超凈工作臺(tái)紫外照射30 min后，用接種環(huán)將植物內(nèi)生真菌Pestalotiopsis briosiana 的菌種接種到改良土豆液體培養(yǎng)基中(10×300 mL)，將其放入雙層搖床在28 ℃，150 r/min恒溫培養(yǎng)7天，得到3 L種子液；按照15% (v/v)的接種量，將發(fā)酵好的種子液轉(zhuǎn)接至土豆培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)(共150瓶)，室溫(26℃)恒濕培養(yǎng)15天，得液體發(fā)酵物40L。

3提取及分離純化

將收集得到的液體發(fā)酵物放入萃取桶里，按1倍體積比加入乙酸乙酯40 L，將液體發(fā)酵產(chǎn)物攪碎，排除空氣，使其完全浸泡在乙酸乙酯中，總共萃取4次，兩次浸泡萃取間隔7天，合并萃取液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾得浸膏123 g。

將得到123 g濃縮浸膏與123 g柱層析硅膠(60-80目)按1：1的比例充分?jǐn)嚢杌靹颍芄馐覝胤胖酶稍锍煞勰?，達(dá)到使提取物充分吸附于硅膠顆粒上的效果。然后裝柱進(jìn)行加壓硅膠(200-300目)柱層析，用石油醚/乙酸乙酯系統(tǒng)梯度洗脫(100:0，95:5，90:10，60:10，40:10，20:10，10:10(v/v))，得到7個(gè)部分(Fr.1-7)。Fr.2(300 mg)經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析，Sephadex LH-20凝膠(CHCl3/CH3OH，1:1)過(guò)濾和重結(jié)晶，得到化合物1 (17 mg)、2(15 mg)、4(19 mg)，F(xiàn)r.4(200 mg)經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析，Sephadex LH-20凝膠(CHCl3/CH3OH，CH3OH)過(guò)濾及重結(jié)晶，得到化合物3 (7 mg)、5 (11 mg)、6 (13 mg)

4結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1，C28H40O6，淡黃色晶體。1H- NMR (600 MHz, CDCl3): δH:6.93 (H, d, 8.4, H-1), 7.36 (H, d, 8.5, H-2), 5.22 (2H, s, H-7), 6.42 (1H, s, H-8), 6.87 (1H, s, H-10), 4.11 (1H, d, 1.4, H-1’), 3.32 (1H, d, 1.4, H-2’), 1.03 (2H, s, H-4’), 1.80 (3H, s, H-5’), 3.98 (3H, s, OMe-4), 2.25 (3H, s, Me-9). 13C-NMR (150 MHz, CDCl3) δC: 117.56 (d, C-1), 129.42 (d, C-2), 129.85 (s, C-3), 156.22 (s, C-4), 120.98 (s, C-4a), 166.72 (d, C-5)，69.02 (t, C-7), 125.72(s, C-7a), 120.34 (d, C-8), 135.13 (s, C-9), 117.88 (d, C-10), 147.25 (s, C-11), 141.28 (s, C-11a), 151.65 (s, C-12a)，53.43 (d, C-1’), 64.66 (d, C-2’), 140.39 (s, C-3’), 115.25 (t, C-4’), 16.72 (q, C-5’), 63.10 (q, OMe-4), 20.90 (q, Me-9).上述氫譜碳譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[3]一致。被命名為 1’, 2’-epoxy-3’, 4’-didehydropenicillide.

化合物2, C4H6O4，白色晶體。1H- NMR (600 MHz, CD3OD):δH: 5.25 (2H, brs, -COOH), 2.70 (4H, m, H-2, 3).13C-NMR (150 MHz, CD3OD) δC: 174.5 (d, C-1,4), 29.7 (t, C-2,3) ，上述NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[4]對(duì)照一致。被命名為丁二酸。

化合物3，C28H44O3，無(wú)色針狀結(jié)晶。13C-NMR (150 MHz, CDCl3) δC: 33.4 (t, C-1), 28.8 (t, C-2), 65.5 (d, C-3), 38.7 (t, C-4), 83.1 (s, C-5), 136.7 (d, C-6), 130.8 (d, C-7), 79.8 (s, C-8), 51.5 (d, C-9), 37.4 (s, C-10), 23.5 (t, C-11), 39.5 (t, C-12), 44.4 (s, C-13), 51.5 (d, C-14), 20.7 (t, C-15), 28.3 (t, C-16), 56.8 (d,C-17), 13.2 (q, C-18), 18.6 (q, C-19), 39.5 (d, C-20), 20.6 (q, C-21), 135.2 (d, C-22.), 132.4 (d, C-23), 42.7 (d, C-24), 32.8 (d, C-25), 20.5 (q, C-26), 19.4(q, C-27), 18.1 (q, C-28)。上述NMR碳譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]一致，故鑒定該化合物為3β- 羥基- 5α, 8α- 過(guò)氧化麥角甾- 6, 22- 二烯。

化合物4，C28H46O3，無(wú)色晶體。13C-NMR (150 MHz, CD3OD) δC: 31.3 (t, C-1), 21.3 (t, C-2), 67.7 (d, C-3), 39.8 (t, C-4), 76.2 (s, C-5), 73.7(d, C-6), 118.2 (d, C-7), 142.6 (s, C-8), 44.2 (d, C-9), 34.1 (s, C-10), 22.6 (t, C-11), 37.7 (t, C-12), 44.1 (s, C-13), 55.4 (d, C-14), 23.5 (t, C-15), 28.9 (t, C-16), 56.8 (d ,C-17), 12.4 (q, C-18), 12.3 (q, C-19), 39.6 (d, C-20), 18.6 (q, C-21), 136.5 (d, C-22), 132.8 (d, C-23), 41.4 (d, C-24), 17.8 (q, C-25), 33.5 (d, C-26), 19.9 (q, C-27), 19.7 (q, C-28)。上述碳譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]數(shù)據(jù)一致，故鑒定該化合物為ergosta- 7, 22- dien- 3β, 5α, 6α- triol。

化合物5，C28H44O，無(wú)色針狀結(jié)晶。13C-NMR (150 MHz, CDCl3) δC: 38.3 (t, C-1), 32.1 (t, C-2), 70.4 (d, C-3), 40.1 (t, C-4), 139.7 (s, C-5), 119.6 (d, C-6), 116.1 (d, C-7), 141.5 (s, C-8), 46.1 (d, C-9), 37.3 (s, C-10), 21.3 (t, C-11), 39.2 (t, C-12), 42.8 (s, C-13), 54.2 (d, C-14), 23.7 (t, C-15), 28.1 (t, C-16), 56.0 (d, C-17), 12.1 (q, C-18), 16.2 (q, C-19), 40.6 (d, C-20), 21.4 (q, C-21), 135.3 (d, C-22), 132.5 (d, C-23), 42.9 (d, C-24), 32.8 (d, C-25), 20.2 (q, C-26), 19.9 (q, C-27), 17.5 (q, C-28) 。上述碳譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]一致，故鑒定該化合物為3β- 羥基- 麥角甾- 5, 7, 22- 三烯。

化合物6：C8H8O3，黃色油狀。1H-NMR(600 MHz , CD3OD) δH:7.12 (2H, d, J=8.4 Hz,H-2, H-6), 6.65 (2H, d, J=8.4Hz,H-3,H-5), 3.47 (2H,s,H-7);13C-NMR (150MHz, CD3OD)δC: 127.3 (s,C-1), 131.5 (d,C-2,6), 116.5 (d,C-3,5), 157.3 (s,C-4), 41.4 (t,C-7) ,173.5 (s,C-8)。以上MNR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]一致，故鑒定為4- 羥基苯乙酸。

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中圖分類號(hào):O629

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1671-1602(2016)08-0031-02

通訊作者簡(jiǎn)介：羅都強(qiáng)(1968-)，男，河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院教授，研究方向?yàn)橹参锘瘜W(xué)及藥物研究開(kāi)發(fā)。

作者簡(jiǎn)介：王忠(1989-)，男，河北大學(xué)碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。