三七根總苷對(duì)電壓依賴性鈣離子和鉀離子通道的作用

姜河海，年 寅，張阿梅

（1.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650504；2.中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所離子通道與藥物研發(fā)中心，云南昆明 650223）

·論 著·

三七根總苷對(duì)電壓依賴性鈣離子和鉀離子通道的作用

姜河海1，2，年 寅2，張阿梅1

（1.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650504；2.中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所離子通道與藥物研發(fā)中心，云南昆明 650223）

目的 探討三七根總皂苷（RPNS）對(duì)電壓依賴性鈣離子和鉀離子通道的作用。方法 采用雙電極電壓鉗檢測(cè)RPNS 0.01，0.06，0.1，0.6，1及4 g·L-1對(duì)表達(dá)在爪蟾卵母細(xì)胞的Cav1.2的作用；檢測(cè)RPNS 1 g·L-1對(duì)Cav2.1，Cav2.2，Cav3.1，KCNH2，KCNQ1，KCNQ1/KCNE1及大電導(dǎo)鈣激活鉀通道（BK）的作用。結(jié)果 雙電極電壓鉗實(shí)驗(yàn)表明，RPNS對(duì)Cav1.2的抑制作用有明顯的濃度效應(yīng)關(guān)系，其EC50為0.048 g·L-1。與細(xì)胞對(duì)照組相比，RPNS 1 g·L-1對(duì)Cav1.2，Cav2.2和Cav3.1有明顯的抑制作用，對(duì)其峰值電流的抑制率分別為（57.1±8.6）%，（17.2±0.7）%和（50.2±7.7）%（P<0.01）；對(duì)BK通道有明顯的激活作用，對(duì)其峰值電流激活率為（37.9±2.7）%（P<0.01）；對(duì)Cav2.1，KCNH2，KCNQ1和KCNQ1/KCNE1通道無(wú)明顯作用。結(jié)論RPNS明顯抑制Cav1.2和Cav3.1，激活BK通道，但對(duì)Cav2.1，Cav2.2，KCNH2，KCNQ1及KCNQ1/KCNE1無(wú)明顯作用。

總皂苷；三七；Cav1.2；Cav3.1；鉀通道；爪蟾卵母細(xì)胞

高血壓是一種以動(dòng)脈血壓持續(xù)升高的慢性疾病，目前常用的降血壓藥物包括了鈣通道阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI）、血管緊張素受體阻滯劑（angiotensin receptor blocker，ARB）、利尿劑及α/β受體阻滯劑［1］。降血壓可通過(guò)血管舒張完成，血管舒張主要通過(guò)內(nèi)皮依賴性及非內(nèi)皮依賴性的血管舒張途徑。對(duì)于非內(nèi)皮依賴性的血管舒張途徑，高濃度氯化鉀（KCl）可引起血管平滑肌細(xì)胞膜去極化，使得平滑肌細(xì)胞膜上的電壓依賴性鈣通道開(kāi)放，導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流，使血管平滑肌收縮。因此，鈣通道阻滯劑可以通過(guò)阻止鈣離子內(nèi)流導(dǎo)致血管舒張而發(fā)揮降血壓的作用。

三七（Panax notoginseng）為傘形目五加科人參屬多年生草本植物，《本草綱目新編》記載：“三七根，止血之神藥”，作為一種治療高血壓的中藥已在臨床中廣泛使用。近年來(lái)，三七總苷（P.notogin?sengsaponins）在治療心血管疾病方面的研究取得了迅速發(fā)展，被認(rèn)為具有擴(kuò)血管作用，在治療高血壓方面具有良好的療效［2］。目前，對(duì)于三七總苷在心血管方面的研究主要集中在內(nèi)皮依賴性血管舒張機(jī)制的研究。三七花總苷（flower saponins ofP. notoginseng）能通過(guò)激活血管內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合成酶和環(huán)氧合酶而引起血管舒張［3］。通過(guò)HPLCESI-MS/MS技術(shù)從三七總苷中分離出了一系列單體分子如Re，R1，Rc，Rd，Rb3和Rb1等［4］。三七皂苷Ft1通過(guò)內(nèi)皮依賴性一氧化氮合酶來(lái)調(diào)節(jié)血管的舒張［5］。人參皂苷Rg1和Rg3可以引起內(nèi)皮依賴性大鼠主動(dòng)脈舒張［6］，人參皂苷Rb1可以減緩由內(nèi)皮依賴性3-磷脂酰肌醇激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶/內(nèi)皮型一氧化氮合酶途徑造成的血管收縮［7-8］。三七皂苷R1能促進(jìn)胸腹動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的一氧化氮釋放，從而使得自發(fā)性高血壓小鼠血壓降低［9］。然而，也有研究表明，人參皂苷Rd能逆轉(zhuǎn)由受體依賴性鈣通道及儲(chǔ)存門控鈣通道造成的鈣離子增加，但不能逆轉(zhuǎn)電壓門控鈣通道，雖然Rd能減緩自發(fā)性高血壓大鼠的腦血壓，但并未明顯改變外周血管的血壓［10］，三七總苷可通過(guò)抑制心肌細(xì)胞鈣內(nèi)流導(dǎo)致血管舒張［11］。提示三七總苷中有可能存在對(duì)血管平滑肌細(xì)胞膜上鈣離子通道起抑制作用的成分。目前，三七根總苷（root saponins ofP.notogin?seng，RPNS）與血管舒張相關(guān)離子通道的研究未得到詳細(xì)的闡明。因此，本研究采用雙電極電壓鉗檢測(cè)RPNS對(duì)與心血管及神經(jīng)系統(tǒng)功能相關(guān)的離子通道的作用。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑及主要儀器

RPNS由云南省中醫(yī)學(xué)院饒高雄教授提供，參考2010版《中華人民共和國(guó)藥典》，將三七根磨成粉末，用甲醇浸泡過(guò)夜，再80℃水浴微沸約2 h，過(guò)濾得濾液，干燥即得三七根總苷［12］。Cav1.2，Cav2.2，Cav3.1，Cav2.1，KCNQ1，KCNH2，KCNQ1/KCNE1及大電導(dǎo)鈣激活鉀通道（large-conductance calcium-activated potassium channels，BK）通道的重組質(zhì)粒由哥倫比亞大學(xué)生物系楊建教授及華盛頓大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系崔建民教授提供。三卡因〔梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司〕，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析試劑。用超純水配置ND 96液（mmol·L-1：NaCl 96，KCl 2，CaCl21.8，MgCl21，HEPES 5，用NaOH調(diào)pH至7.4）、OR2液（mmol·L-1：NaCl 82.5，KCl 2，MgCl21，HEPES 5，用NaOH調(diào)pH至7.4）、鋇離子溶液〔mmol·L-1：Ba（OH）240，NaOH 50，HEPES 2，KCl 2，BaCl22，用甲烷磺酸調(diào)pH至7.4〕、Kulori液（mmol·L-1：NaCl 89，KCl 2，CaCl 1，MgCl21，HEPES 5，用NaOH調(diào)pH至7.4）及0.3%三卡因液體。

KB-900定軌搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司），RNA顯微注射系統(tǒng)和電極拉制儀（美國(guó)Sutter Instrument），倒置光學(xué)顯微鏡（日本Olympus），Mili Q超純水系統(tǒng)（昆明倍捷科技有限公司），恒溫培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo），數(shù)模轉(zhuǎn)換器（美國(guó)Axon），放大器（美國(guó)Axon）。

1.2 mRNA的制備

將L-型鈣通道（Cav1.2），N-型鈣通道（Cav2.2），T-型鈣通道（Cav3.1），P/Q-型鈣通道（Cav2.1），鉀通道KCNQ1，KCNH2，KCNQ1/KCNE1和BK的重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶將其線性化；用苯酚∶氯仿∶異戊醇（V∶V∶V=25∶24∶1）提純DNA；使用T7聚合酶在體外合成RNA：T7聚合酶（40 U·μL-1）2 μL+m7G帽子（10 mmol·L-1）15 μL+rNTP（80 mmol·L-1）1 μL+DTT（100 mmol·L-1）5 μL+ MgCl2（50 mmol·L-1）5 μL+RNA酶抑制劑2 μL+ 10×T7聚合酶緩沖液5 μL+DEPC水15 μL。體外合成4 h，純化后用DEPC水溶解，置于-80℃保存。

1.3 爪蟾卵母細(xì)胞的制備

成年雌性非洲爪蟾，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。將爪蟾放于0.3%三卡因液體，-20°下冷凍15~25 min，使其完全麻醉，用手術(shù)刀在腹部剪開(kāi)皮膚層及肌肉層，取卵，置于OR2中，剪成3 mm×3 mm的小塊，加入膠原蛋白酶Ⅱ0.5 g·L-1，置于KB-900定軌搖床，用180 rmp·min-1振蕩1~1.5 h，轉(zhuǎn)速調(diào)至100 rmp·min-1，每隔15 min清洗換液，重復(fù)3次，最后用ND96液清洗，靜置30 min，挑選出表面光滑、動(dòng)物極與植物極分明且中間有亮帶、無(wú)殘留纖維組織、圓潤(rùn)飽滿的Ⅴ或Ⅵ期爪蟾卵母細(xì)胞，置于DN96液。向每個(gè)爪蟾卵母細(xì)胞注射mRNA 100~150 ng，表達(dá)3~5 d后電流記錄。

1.4 雙電極電壓鉗檢測(cè)鈣離子通道

拉制電極的電阻為0.3~1 MΩ，以鋇離子溶液作為記錄液，用鋇離子溶液溶解RPNS。電壓鉗制在-80 mV，記錄Cav1.2，Cav2.2和Cav2.1時(shí)的檢測(cè)電壓為-30~+60 mV，記錄Cav3.1時(shí)的檢測(cè)電壓為-50~+60 mV，每個(gè)掃描記錄0.05 s，間隔5 s。實(shí)驗(yàn)組加入RPNS 0.01，0.06，0.1，0.6，1和4 g·L-1，檢測(cè)其對(duì)Cav1.2的作用；加入RPNS 1 g·L-1，檢測(cè)其對(duì)Cav2.2，Cav3.1和Cav2.1的作用。細(xì)胞對(duì)照組加入相同體積的鋇離子溶液。

1.5 雙電極電壓鉗檢測(cè)鉀離子通道

拉制電極的電阻為0.3~1 MΩ，記錄KCNH2時(shí)用Kulori液作為記錄液，用Kulori液溶解RPNS；記錄KCNQ1，KCNQ1/KCNE1及BK通道時(shí)用DN96液作為記錄液，用DN96液溶解RPNS。記錄KCNH2時(shí)，電壓鉗制在-80 mV，用+40 mV的電壓預(yù)刺激1 s，檢測(cè)電壓為-120~+40 mV，每個(gè)掃描記錄3 s，間隔30 s。記錄KCNQ1時(shí)，電壓鉗制在-80 mV，檢測(cè)電壓為-60~+60 mV，每個(gè)掃描記錄3 s，間隔30 s。記錄KCNQ1/KCNE1時(shí)，鉗制電壓為-80 mV，檢測(cè)電壓為-30~+60 mV，每個(gè)掃描記錄7 s，間隔30 s。記錄BK通道時(shí)，鉗制電壓為-50 mV，檢測(cè)電壓為-10~+200 mV，每個(gè)掃描記錄0.06 s，間隔5 s。實(shí)驗(yàn)組加入RPNS 1 g·L-1，檢測(cè)其對(duì)KCNH2，KCNQ1，KCNQ1/KCNE1及BK通道的作用，根據(jù)記錄的不同離子通道細(xì)胞對(duì)照組加入相應(yīng)的相同體積Kulori液或DN96液。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)用x±s表示，用GraphPad Prism 5軟件分析數(shù)據(jù)，組間比較采用雙尾t檢驗(yàn)。濃度效應(yīng)曲線用 Sigmoidal dose-response（variable slope）方 程Y=Bottom+（Top-Bottom）/{1+ 10∧〔（LogEC50-X）×HillSlope〕}擬合。

2 結(jié)果

2.1 RPNS對(duì)Cav1.2的影響

雙電極電壓鉗實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表1）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，RPNS 0.01，0.06，0.1，0.6，1和4 g·L-1對(duì)Cav1.2在+10 mV時(shí)有不同的抑制作用（P< 0.05，P<0.01）。RPNS 1 g·L-1對(duì)Cav1.2的抑制率為（57.1±8.6）%（P<0.01）。與細(xì)胞對(duì)照組相比（圖1A），RPNS 1 g·L-1對(duì)Cav1.2在0~+30 mV均表現(xiàn)出明顯的抑制作用（P<0.05，P<0.01）；圖2A直觀顯示，在+10 mV時(shí)，RPNS 1 g·L-1對(duì)Cav1.2有明顯抑制作用；圖3A表明，不同濃度RPNS對(duì)Cav1.2的抑制作用呈濃度效應(yīng)關(guān)系，EC50=0.048 g·L-1，Hill?slope=1.055。表明RPNS對(duì)Cav1.2有明顯的抑制作用并呈現(xiàn)出一定的電壓及濃度依賴性，但RPNS無(wú)法完全抑制Cav1.2。

Tab.1 Inhibitory effect of root saponins ofPanax notoginseng（RPNS）on peak current（10 mV）of Cav1.2

2.2 RPNS對(duì)其他離子通道的影響

與細(xì)胞對(duì)照組相比（表2），RPNS 1 g·L-1對(duì)Cav2.2和Cav3.1分別在+10 mV和-10 mV時(shí)有顯著抑制作用，抑制率分別為（17.2±0.7）%和（50.2± 7.7）%（P<0.01），對(duì)BK通道在+200 mV時(shí)有顯著激活作用，其激活率為（37.9±2.7）%（P<0.01），但對(duì)Cav2.1，KCNH2，KCNQ1及KCNQ1/KCNE1在+10 mV，-50 mV，+60 mV及+60 mV時(shí)無(wú)明顯作用。圖2B~H表明，RPNS 1 g·L-1對(duì)Cav2.1，Cav3.1及BK通道分別在+10 mV，-10 mV及+200 mV時(shí)有明顯抑制或激活作用，但對(duì)Cav2.1，KCNH2，KCNQ1及KCNQ1/KCNE1分別在+10 mV，-50 mV，+60 mV及+60 mV時(shí)無(wú)明顯作用。與細(xì)胞對(duì)照組相比，RPNS 1 g·L-1（圖1C）對(duì)Cav2.2在+10~+30 mV有明顯抑制作用（P<0.01），RPNS 1 g·L-1（圖1D）對(duì)Cav3.1在-20~+20 mV有明顯抑制作用（P<0.01），RPNS 1 g·L-1（圖1E）對(duì)BK通道在+140~+200 mV有明顯激活作用（P<0.01，P<0.05），RPNS 1 g·L-1（圖1B，F(xiàn)~H）對(duì)Cav2.1，KCNH2，KCNQ1及KCNQ1/KCNE1在任何電壓下均無(wú)明顯影響。與Cav1.2通道相比（圖3B），RPNS 1 g·L-1對(duì)Cav3.1無(wú)抑制作用，但對(duì)Cav2.1、Cav2.2、BK通道、KCNH2、KCNQ1及KCNQ1/KCNE1有明顯抑制作用（P<0.01，P<0.05）。綜上，RPNS 1 g·L-1對(duì)Cav2.2和Cav3.1有明顯抑制作用，但對(duì)BK通道有明顯激活作用，并呈現(xiàn)出一定的電壓依賴性，其中，RPNS 1 g·L-1對(duì)Cav2.2的抑制作用很弱。此外，RPNS1 g·L-1對(duì)Cav2.1，KCNH2，KCNQ1及KCNQ1/KCNE1無(wú)作用。

Fig.1 Effect of RPNS on current-voltage（I-V）rela?tionship of different calcium and potassium channels. A-H：theI-Vrelationship for the current of Cav1.2，Cav2.1，Cav2.2，Cav3.1，BK channel，KCNH2，KCNQ1 and KCNQ1/ KCNE1.x±s，n=24.*P<0.05，**P<0.01，compared with corre?sponding cell control group.

Tab.2 Inhibitory or activated rate of RPNS on peak current of different channels

Fig.2 Effect of RPNS on peak current of different calcium and potassium channels.A-H：the peak current for Cav1.2，Cav2.1，Cav2.2，Cav3.1，BK channel，KCNH2，KCNQ1 and KCNQ1/KCNE1，respectively.

Fig.3 Effect of RPNS on Cav1.2（A）and different calcium and potassium channels（B）.A：concentration-responsive curve of RPNS on peak current of Cav1.2.EC50=0.048 g·L-1，Hillslope=1.055.Fitting equation：Y=Bottom+（Top-Bottom）/{1+ 10^〔（LogEC50-X）×HillSlope〕}.See Tab.1 for the treatment.B：inhibitory or activated rate of RPNS 1 g·L-1on peak current of different channels.See Tab.2 for the treatment.x±s，n=24.*P<0.05，**P<0.01，compared with Cav1.2 channel.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，RPNS 1 g·L-1對(duì)L-型鈣通道及T-型鈣通道有明顯抑制作用，對(duì)BK通道有激活作用，提示RPNS中存在一系列通過(guò)抑制L-型鈣通道和T-型鈣通道、激活BK通道的協(xié)同作用以發(fā)揮非內(nèi)皮依賴性血管舒張的分子，這與三七總苷可用于治療高血壓疾病相吻和。

據(jù)報(bào)道，在血管平滑肌細(xì)胞膜上主要分布著參與血管收縮與舒張的電壓門控L-型鈣通道和BK通道［13-16］。L-型鈣通道抑制劑鹽酸維拉帕米和硝苯地平能明顯引起非內(nèi)皮依賴性血管舒張的作用［17-20］；L-型鈣通道激活劑Bay K8644可減緩由L-型鈣通道阻斷劑引起的血管舒張［21-22］。相比于L-型鈣通道廣泛的存在于血管平滑肌及心肌細(xì)胞膜上并對(duì)血管的收縮起重要作用而言，電壓門控的T-型鈣通道所起的作用則相對(duì)較弱，其主要分布于微血管平滑肌細(xì)胞膜上，其被抑制也可以舒張微血管來(lái)調(diào)節(jié)微血管的血壓，但其對(duì)于主動(dòng)脈血壓的調(diào)節(jié)作用很弱［23］。因此，未將T-型鈣通道作為治療高血壓的主要靶點(diǎn)。BK通道的激活劑KB130015可引起非內(nèi)皮依賴性血管舒張［24］。當(dāng)BK通道被激活時(shí)，鉀離子外流，引起膜電位的超級(jí)化，使得電壓門控的鈣離子通道失活而關(guān)閉，在血管平滑肌細(xì)胞上，主要是通過(guò)抑制L-型鈣通道而導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流減少，使血管不能進(jìn)一步收縮［13，15］。因此，BK通道的激活作用可以間接抑制L-型鈣通道，從而協(xié)同L-型鈣通道的抑制作用引起非內(nèi)皮依賴性血管舒張，而T-型鈣通道的抑制作用則進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)微血管的舒張作用，從而起到降血壓作用。

KCNH2，KCNQ1和KCNQ1/KCNE1主要分布在心臟和腎中，若其功能紊亂可導(dǎo)致室性心律失?；蜷L(zhǎng)QT綜合征［25］。其中，如果有藥物引起了QT間期增長(zhǎng)，那么必然對(duì)KCNH2有作用［26］。P/Q-型鈣通道主要分布在神經(jīng)末梢，若其功能紊亂會(huì)導(dǎo)致偏頭痛或者失神性癲癇［27-28］。N-型鈣通道主要分布在神經(jīng)末梢，特別是感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)末梢，在神經(jīng)疼痛方面起著非常重要的作用，其抑制劑被認(rèn)為是止痛劑［29］。本研究結(jié)果表明，RPNS對(duì)KCNH2，KCNQ1和KCNQ1/KCNE1以及P/Q-型鈣離子通道均無(wú)明顯作用，對(duì)N-型鈣通道的作用很弱，提示RPNS不影響心臟和神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能?？傊狙芯繌碾x子通道角度，提示從RPNS中尋找非內(nèi)皮依賴性舒張血管且對(duì)心臟和神經(jīng)系統(tǒng)無(wú)影響的用于治療高血壓疾病的分子是可行的。

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Effect of root saponins of Panax notoginseng on different voltagedependent calcium and potassium ion channels

JIANG He-hai1，2，NIAN Yin2，ZHANG A-mei1
（1.Faculty of Life Science and Technology，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650504，China；2.Ion Channel Research and Drug Development Center，Kunming Institute of Zoology，Chinese Academy of Sciences，Kunming 650223，China）

OBJECTIVE To investigate the effect of root saponins ofPanax notoginseng（RPNS）on different voltage-dependent calcium and potassium ion channels.METHODS By using the two-elec?trode voltage clamp（TEVC），the effect of RPNS 0.01，0.06，0.1，0.6，1 and 4 g·L-1was investigated on Cav1.2，and the effect of RPNS 1 g·L-1was evaluated on Cav2.1，Cav2.2，Cav3.1，KCNH2，KCNQ1，KCNQ1/KCNE1 and BK channel.All the ion channels examined were expressed inXenopus laevisoocytes.RESULTS TEVC suggested that the effect of RPNS on Cav1.2 exhibited the concentration-response relationship and its EC50was 0.048 g·L-1.Compared with cell control，TEVC also showed that RPNS 1 g·L-1had obviously inhibitory effect on Cav1.2，Cav2.2 and Cav3.1，and the inhibitory rate of RPNS 1 g·L-1on the peak current of Cav1.2，Cav2.2 and Cav3.1 was（57.1±8.6）%，（17.2±0.7）%and（50.2±7.7）%（P<0.01），respectively.RPNS 1 g·L-1had obviously activated effect on BK channel，and the activated rate of RPNS 1 g·L-1on the peak current of BK channel was（37.9± 2.7）%（P<0.01）.RPNS 1 g·L-1showed no significant effect on Cav2.1，KCNH2，KCNQ1 and KCNQ1/ KCNE1.CONCLUSION RPNS may effectively inhibit Cav1.2 and Cav3.1，activate BK channel，but have little effect on Cav2.1，Cav2.2，KCNH2，KCNQ1 and KCNQ1/KCNE1.

total saponins；Panax notoginseng；Cav1.2；Cav3.1；potassium channel；Xenopus laevisoocytes

NIAN Yin，Tel：13987692057，E-mail：nianyin@mail.kiz.ac.cn；ZHANG A-mei，Tel：13577083421，E-mail：zam1980@yeah.net

R285

A

1000-3002-（2016）09-0921-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.09.003

2015-12-08接受日期：2016-08-22）

（本文編輯：?jiǎn)?虹）

姜河海，男，碩士研究生，主要從事離子通道藥物研發(fā)，E-mail：jianghehai2013@aliyun.com；年 寅，男，助理研究員，主要從事離子通道藥物研發(fā)及植物化學(xué)研究；張阿梅女，副教授，主要從事分子病毒學(xué)研究。

年 寅，E-mail：nianyin@mail.kiz.ac.cn，Tel 13987692057；張阿梅，E-mail：zam1980@yeah.net Tel：13577083421