全氟異丁烯染毒對(duì)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響

王延琳，趙 建，黃春倩，王和枚，丁日高

（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院1.野戰(zhàn)輸血研究所，2.毒物藥物研究所，3.抗毒藥物與毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850）

全氟異丁烯染毒對(duì)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響

王延琳1，2，3，趙 建2，3，黃春倩2，3，王和枚2，3，丁日高2，3

（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院1.野戰(zhàn)輸血研究所，2.毒物藥物研究所，3.抗毒藥物與毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850）

目的 觀察體外培養(yǎng)的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（PMVEC）經(jīng)全氟異丁烯（PFIB）染毒后其腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）和MMP-9的含量變化。方法 采用改進(jìn)的組織塊種植法分離培養(yǎng)大鼠PMVEC，細(xì)胞經(jīng)鑒定后分為正常對(duì)照組和5個(gè)PFIB染毒組（n=3）。正常對(duì)照組為靜息狀態(tài)細(xì)胞；染毒組行PFIB暴露（濃度200 mg·m-3，持續(xù)5 min）染毒后0.5，1，2，4和8 h分別收集培養(yǎng)上清液和細(xì)胞裂解液。ELISA檢測(cè)TNF-α，IL-1β，ICAM-1，MMP-2和MMP-9含量，明膠酶譜法分析MMP-2和MMP-9酶活性。結(jié)果 ①依據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的形態(tài)特征、特異性抗原的表達(dá)和植物凝集素結(jié)合實(shí)驗(yàn)鑒定，采用肺組織塊原代培養(yǎng)法獲得的細(xì)胞均符合PMVEC的特征。②與正常對(duì)照組比較，PMVEC經(jīng)PFIB染毒后2 h細(xì)胞裂解液中TNF-α含量顯著升高（P<0.05），4和8 h明顯回落。細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α含量變化趨勢(shì)與細(xì)胞裂解液中TNF-α變化趨勢(shì)類(lèi)似，僅發(fā)生時(shí)間稍滯后。③PFIB染毒后PMVEC激活并合成IL-1β的時(shí)間稍滯后于TNF-α，但達(dá)峰與持續(xù)時(shí)間與TNF-α相似。④PFIB染毒后PMVEC培養(yǎng)上清液中ICAM-1含量持續(xù)保持于較低水平。⑤PFIB染毒組細(xì)胞裂解液中未檢測(cè)到MMP-2活性，培養(yǎng)上清液中檢測(cè)到較高水平的MMP-2含量與活性。PFIB染毒組的培養(yǎng)上清液和細(xì)胞裂解液中均未檢測(cè)到MMP-9表達(dá)與活性。結(jié)論 PFIB染毒刺激存活的PMVEC合成并釋放大量TNF-α，IL-1β，MMP-2和結(jié)合型ICAM-1。

肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞；全氟異丁烯；細(xì)胞因子；黏附分子；基質(zhì)金屬蛋白酶

作為重要的化工原料和副產(chǎn)物，全氟異丁烯（perfluoroisobutylene，PFIB）是一種常溫下為氣態(tài)的無(wú)色無(wú)味低分子量的高氟有機(jī)物，能穿透普通防毒面具，且無(wú)特效的防治措施，是常見(jiàn)的可引起肺部炎性損傷的有毒化學(xué)品。當(dāng)發(fā)生肺部炎性損傷時(shí)，肺泡微血管內(nèi)皮的細(xì)胞連接破壞、細(xì)胞骨架重排，這些結(jié)構(gòu)的破壞導(dǎo)致液體、蛋白質(zhì)、炎性介質(zhì)等進(jìn)入肺泡［1-4］；肺部炎性損傷還影響主要細(xì)胞的分泌功能，當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞受到炎癥刺激時(shí)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB被激活，促進(jìn)多種炎性介質(zhì)mRNA表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)合成與釋放腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6和IL-8等細(xì)胞因子，誘導(dǎo)細(xì)胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）、血管細(xì)胞黏附分子1和E-選擇素等黏附分子的表達(dá)，促進(jìn)中性粒細(xì)胞的扣押和聚集，同時(shí)分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）降解基底膜、破壞正常肺泡結(jié)構(gòu)并引發(fā)更多的炎性細(xì)胞聚集和活化［3-7］。內(nèi)皮細(xì)胞在炎癥過(guò)程中生成的這些炎性介質(zhì)間也有相互協(xié)同作用，進(jìn)而形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果共同促進(jìn)炎癥過(guò)程。

本研究擬在本課題組前期PFIB染毒對(duì)肺氣血屏障形態(tài)影響的研究基礎(chǔ)上，觀察體外培養(yǎng)的肺微細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞（pulmonary microvascular endothe?lial cells，PMVEC）經(jīng)PFIB染毒后其分泌功能的變化特點(diǎn)，為闡明PFIB急性吸入性肺損傷發(fā)病機(jī)制、有效防治PFIB急性吸入性肺損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、藥品和試劑

健康雄性Wistar大鼠（體質(zhì)量140~160 g）購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，SPF級(jí)，許可證編號(hào)SCXK（京）2002-2003。PFIB購(gòu)自上海有機(jī)氟材料研究所，純度為98%。兔抗人因子Ⅷ相關(guān)抗原〔factorⅧ（FⅧ）-related antigen〕多克隆抗體，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；熒光標(biāo)記的植物凝集素，美國(guó)Sigma公司；TNF-α，IL-1β，ICAM-1，MMP-2和MMP-9 ELISA檢測(cè)試劑盒，上海依科賽生物制品有限公司。

1.2 大鼠PMVEC的分離培養(yǎng)和鑒定

本課題組采用改進(jìn)的組織塊種植法［8］，分離培養(yǎng)PMVEC，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)呈現(xiàn)80%~90%單層匯合時(shí)，用0.125%胰蛋白酶消化后1∶3傳代。2~3代后進(jìn)行鑒定，2~5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。主要鑒定方法包括形態(tài)及生長(zhǎng)特性的觀察、免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定FⅧ相關(guān)抗原及植物凝集素結(jié)合實(shí)驗(yàn)［8］。

1.3 PMVEC分組和染毒

將PMVEC分為正常對(duì)照組和PFIB染毒0.5，1，2，4和8 h組，每組3孔。依1.2培養(yǎng)的PMVEC接種于24孔培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)80%~ 90%單層匯合后，移除培養(yǎng)液并用PBS沖洗孔板，然后將培養(yǎng)板置于自制的細(xì)胞暴露動(dòng)態(tài)吸入染毒系統(tǒng)，PFIB染毒濃度為200 mg·m-3，染毒5 min。染毒結(jié)束后向培養(yǎng)板中加入含有20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液1 mL繼續(xù)培養(yǎng)。分別于PFIB暴露后0.5，1，2，4和8 h每孔加入細(xì)胞裂解液200 μL，裂解1 min后用鈍性細(xì)胞刮板刮離細(xì)胞，連同細(xì)胞裂解液一起收集，靜置10 min后，4℃環(huán)境12 000×g離心10 min，收集上清（-20℃凍存）。正常對(duì)照組為靜息狀態(tài)的細(xì)胞，行過(guò)濾空氣暴露，其余處理?xiàng)l件與染毒組相同，呈現(xiàn)80%~90%單層匯合時(shí)收集上清液和細(xì)胞。

1.4 ELISA檢測(cè)TNF- α，IL-1 β，ICAM-1，MMP-2和MMP-9含量

按照各個(gè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，每個(gè)樣本設(shè)2個(gè)復(fù)孔。測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值（A450nm）并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和測(cè)得的樣品A450nm值，計(jì)算樣品的待測(cè)分子的濃度。

1.5 明膠酶譜法測(cè)定MMP-2和MMP-9酶活性［9］

向等量樣品中加入非變性SDS電泳上樣緩沖液（2%SDS，pH 6.8，10%甘油，0.001%溴酚藍(lán)），經(jīng)8%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，凝膠置于洗脫液（Tris-HCl 4 mmol·L-1，CaCl210 mmol·L-1，pH 7.6）中，振蕩洗脫3次，每次25 min。用漂洗液漂洗3次，每次15 min。將膠置于孵育液（Tris 40 mmol·L-1，pH 7.6，CaCl210 mmol·L-1）中，于37℃，40 r·min-1振蕩孵育24~48 h?？捡R斯亮藍(lán)染色2 h，脫色液適當(dāng)脫色后，MMP-2和MMP-9在藍(lán)色背景上呈透亮條帶，凝膠經(jīng)成像系統(tǒng)記錄后，使用ImageJ軟件進(jìn)行累積吸光度分析，以反映MMP相對(duì)活性。并按下式計(jì)算相對(duì)酶活性：酶相對(duì)活性=PFIB染毒組檢測(cè)條帶的灰度值/靜息狀態(tài)組檢測(cè)條帶的灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以x±s表示，使用統(tǒng)計(jì)分析軟件SAS 9.1，按單因素多水平設(shè)計(jì)進(jìn)行一元定量資料的方差分析（方差不齊時(shí)采用秩和檢驗(yàn)），組間的兩兩比較采用Dunnettt檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PMVEC的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：倒置相差顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)約60 h的肺組織塊周?chē)卸趟笮位蜮g圓形細(xì)胞游出。第二代細(xì)胞形態(tài)主要為多角形、短梭形。培養(yǎng)至第三代，排列致密時(shí)細(xì)胞間隙消失，彼此融合形成緊密單層細(xì)胞。如圖1A所示，鏡下觀察傳代培養(yǎng)至2~3代的培養(yǎng)細(xì)胞呈典型的“鋪路石狀”單層貼壁生長(zhǎng)，具有接觸抑制的特征［8、10］，細(xì)胞的胞核清晰，胞漿豐富。FⅧ相關(guān)抗原鑒定：如圖1B所示，培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，倒置顯微鏡下觀察免疫細(xì)胞化學(xué)染色呈陰性。植物凝集素結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1C所示，細(xì)胞經(jīng)植物凝集素結(jié)合實(shí)驗(yàn)鑒定，呈明亮的綠色熒光。

Fig.1Qualification of pulmonary microvascular endothelial cells（PMVECs）prepared with modified tissue block pasted culture method［8］under phase contrast microscope.A：appearance of PMVECs（×100）；B：expression of FⅧ-related antigen in PMVECs（×200）；C：fluorescently-labeled phytohemagglutinin of PMVECs（×400）.

2.2 PFIB染毒后不同時(shí)間PMVEC中TNF- α含量

如圖2所示，PFIB染毒后0.5 h，PMVEC培養(yǎng)上清液中TNF-α含量顯著低于正常對(duì)照組（P< 0.05），之后逐漸升高，至4 h達(dá)到峰值且顯著高于對(duì)照組（P<0.05），8 h回落至正常對(duì)照組水平。PMVEC細(xì)胞裂解液中TNF-α含量則逐漸升高，至染毒后2 h達(dá)峰且與正常對(duì)照組有顯著性差異（P< 0.05），之后漸降低，至8 h降至正常對(duì)照組水平。

Fig.2 Tumor necrosis factor- α（TNF- α）content in PMVEC supernatant and lysate at different time after perfluoroisobutylene（PFIB）exposure.The PFIB-exposed groups inhaled PFIB 200 mg·m-3for 5 min in a flow-past header. Then supernatant and lysate of PMVECs were harvested at 0.5，1，2，4 and 8 h.The content of TNF-α was measured by ELISA.±s，n=3.*P<0.05，compared with normal control（0）group.

2.3 PFIB染毒后不同時(shí)間PMVEC中IL-1 β含量

正常對(duì)照組和PFIB染毒組PMVEC培養(yǎng)上清液中IL-1β的含量均低于檢測(cè)下限。PFIB染毒后0.5和1 h，PMVEC細(xì)胞裂解液中IL-1β水平顯著低于正常對(duì)照組（P<0.05），染毒后2 h升高至正常對(duì)照組水平，染毒后4和8 h又顯著低于正常對(duì)照組水平（P<0.05）（圖3）。

Fig.3 Interleukin-1 β（IL-1 β）content in PMVEC lysate at different time after PFIB exposure.See Fig.2 for PMVEC treatment.The content of IL-1β was measured by ELISA.±s，n=3.*P<0.05，compared with normal control group.

2.4 PFIB染毒后不同時(shí)間PMVEC中ICAM-1含量

如圖4所示，PFIB染毒后0.5~8 h，PMVEC培養(yǎng)上清液中ICAM-1的含量隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高，但均保持在較低水平，均顯著低于正常對(duì)照組（P< 0.05）。而PFIB染毒后0.5 h，PMVEC細(xì)胞裂解液中ICAM-1含量顯著高于正常對(duì)照組（P<0.05）；之后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)ICAM-1含量漸降低，至染毒后4和8 h含量顯著低于正常對(duì)照組（P<0.05）。

Fig.4 Intercellular adhesion molecule-1（ICAM-1）content in PMVEC supernatant and lysate at different time after PFIB exposure.See Fig.2 for PMVEC treatment.The content of ICAM-1 was measured by ELISA.±s，n=3.*P< 0.05，compared with normal control group.

2.5 PFIB染毒后不同時(shí)間PMVEC中MMP-2和MMP-9含量

正常對(duì)照組PMVEC細(xì)胞裂解液中MMP-2表達(dá)量低于檢測(cè)下限。PFIB染毒后PMVEC培養(yǎng)上清液中MMP-2含量漸升高，但與正常對(duì)照組均無(wú)顯著性差異（圖5）。兩組PMVEC培養(yǎng)上清液和細(xì)胞裂解液中MMP-9蛋白含量均低于檢測(cè)下限（結(jié)果未顯示）。

Fig.5 Matrix metalloproteinase-2（MMP-2）content in PMVEC supernatant at different time after PFIB expo?sure.See Fig.2 for PMVEC treatment.The content of MMP-2 was measured by ELISA.±s，n=3.

2.6 PFIB染毒后不同時(shí)間PMVEC中MMP-2和MMP-9活性

以正常對(duì)照組培養(yǎng)上清液中MMP-2的酶活性為1，PFIB染毒后PMVEC培養(yǎng)上清液中MMP-2相對(duì)活性呈現(xiàn)一定程度的升高，至染毒后4 h活性顯著高于正常對(duì)照組（P<0.05）（圖6）。兩組培養(yǎng)上清液中均未檢測(cè)到MMP-9活性。

兩組PMVEC細(xì)胞裂解液中均未檢測(cè)到MMP-2與MMP-9活性。

Fig.6 MMP-2 activity in PMVEC supernatant at different time after PFIB exposure.See Fig.2 for PMVEC treatment. MMP-2 activity was measured by gelatin zymography and MMP-2 activity of normal control group was taken as 1.0.±s，n=3. *P<0.05，compared with normal control group.

3 討論

PMVEC作為氣血屏障的重要組成部分，單層覆蓋在毛細(xì)血管的腔面，在生理和病理情況下均發(fā)揮重要作用，與肺部炎性滲出和肺水腫關(guān)系密切。在致病因素作用下，內(nèi)皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子NF-κB被激活，啟動(dòng)多種炎癥介質(zhì)mRNA的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而促進(jìn)合成與釋放多種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子的過(guò)度表達(dá)及其相互作用是發(fā)生急性肺損傷的重要原因［3、4、11］。在這些因子中，TNF-α和IL-1β作為早期炎性細(xì)胞因子，二者均可刺激趨化因子釋放、上調(diào)黏附分子表達(dá)等［5，12-16］。另外，TNF-α和IL-1β還是重要的NF-κB正反饋因子［14］。ICAM-1是激活的內(nèi)皮細(xì)胞在胞膜上表達(dá)的重要黏附分子，使中性粒細(xì)胞更易黏附于內(nèi)皮細(xì)胞表面并刺激中性粒細(xì)胞的激活［17］。MMP-2在正常肺組織中即廣泛表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞損傷時(shí)常伴有局部組織中MMP-2含量升高［18］，MMP-2參與基底膜損傷和肺組織結(jié)構(gòu)重塑。MMP-9在正常肺組織中表達(dá)較低，炎癥反應(yīng)時(shí)炎性細(xì)胞激活、炎癥因子釋放等因素均可促進(jìn)MMP-9的大量表達(dá)［19］。MMP-2和MMP-9具有強(qiáng)烈的溶解膠原活性，在急性呼吸窘迫綜合征的發(fā)病機(jī)制中起重要作用［4］。

經(jīng)前期多次預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索條件，明確PFIB染毒濃度為200 mg·m-3、染毒時(shí)間5 min，染毒后觀察PMVEC的超微結(jié)構(gòu)變化規(guī)律同整體動(dòng)物PFIB染毒后變化規(guī)律基本一致，據(jù)此作為細(xì)胞染毒實(shí)驗(yàn)條件。本研究發(fā)現(xiàn)，PFIB染毒后PMVEC細(xì)胞裂解液中TNF-α含量呈持續(xù)升高態(tài)勢(shì)，至染毒后2 h達(dá)峰，之后漸降低，至8 h降至對(duì)照組水平；細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α含量變化趨勢(shì)與細(xì)胞裂解液中TNF-α含量變化趨勢(shì)類(lèi)似，僅發(fā)生時(shí)間上稍滯后于后者。以上結(jié)果提示，PMVEC經(jīng)PFIB染毒后可被迅速激活，合成大量TNF-α并快速釋放于周?chē)h(huán)境中。

PFIB染毒后PMVEC激活并合成IL-1β的時(shí)間與TNF-α相仿，但I(xiàn)L-1β的表達(dá)量明顯少于TNF-α，其細(xì)胞裂解液中的含量?jī)H約為后者的1/10，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中未檢出。雖普遍認(rèn)為IL-1β和TNF-α具有相似的生物學(xué)作用，但在PFIB急性吸入性肺損傷的病理過(guò)程中存在不同的表達(dá)特點(diǎn)，合成的IL-1β始終未釋放到細(xì)胞外可能提示PMVEC不是PFIB急性吸入性肺損傷時(shí)IL-1β的主要細(xì)胞來(lái)源。

PFIB染毒后PMVEC細(xì)胞裂解液中ICAM-1含量迅速升高，之后緩慢下降，至染毒后4 h細(xì)胞裂解液中ICAM-1含量顯著低于正常對(duì)照組。與之對(duì)應(yīng)的是，PFIB染毒后PMVEC培養(yǎng)上清液中ICAM-1含量持續(xù)保持于較低水平，遠(yuǎn)低于細(xì)胞裂解液內(nèi)含量。提示PFIB染毒后ICAM-1表達(dá)量顯著增加，其表型以結(jié)合型為主。

本研究PFIB染毒組細(xì)胞裂解液中未檢測(cè)到MMP-2活性，而培養(yǎng)上清液中檢測(cè)到較高水平的MMP-2活性，提示PFIB染毒后PMVEC合成大量MMP-2并快速釋放于周?chē)橘|(zhì)中。PFIB染毒組的培養(yǎng)上清液和細(xì)胞裂解液中均未檢測(cè)到MMP-9表達(dá)，說(shuō)明PFIB染毒并未刺激PMVEC生成和釋放MMP-9，提示PFIB急性吸入性肺損傷時(shí)PMVEC可能不是MMP-9的主要來(lái)源。

本課題組有關(guān)PFIB引起肺部炎性損傷機(jī)制研究時(shí)有許多重要的發(fā)現(xiàn)［1，20］，尤其是PMVEC的形態(tài)學(xué)變化研究表明，PFIB染毒后1 h，PMVEC細(xì)胞核和線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)即出現(xiàn)損傷，并伴有PMVEC凋亡，24 h內(nèi)呈逐步增多的趨勢(shì)，至24 h達(dá)峰值后逐漸恢復(fù)［2］。結(jié)合本文研究結(jié)果分析，一方面PFIB染毒促進(jìn)PMVEC凋亡；另一方面刺激存活的PMVEC合成并釋放大量TNF-α與IL-1β，高表達(dá)結(jié)合型ICAM-1；此外PFIB染毒后PMVEC本身也迅速釋放大量MMP-2，后者可加速肺泡微血管內(nèi)皮細(xì)胞連接的破壞、細(xì)胞骨架的重排，并破壞細(xì)胞外基質(zhì)。在上述因子與其他因素的綜合作用下，中性粒細(xì)胞激活并黏附于PMVEC，釋放活性氧自由基與蛋白酶類(lèi)，對(duì)PMVEC及其基底膜造成進(jìn)一步損傷，最終破壞肺氣血屏障的完整性，失去對(duì)大分子的屏障作用，血漿蛋白漏出形成滲透梯度，血漿水分也隨之滲出血管外造成肺水腫，炎癥介質(zhì)等進(jìn)入肺泡內(nèi)，這些也是急性肺損傷主要的病理基礎(chǔ)。PFIB染毒后PMVEC結(jié)構(gòu)和功能的變化是相輔相成、相互促進(jìn)的，共同加速肺組織炎癥反應(yīng)，促進(jìn)急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征的發(fā)生與發(fā)展。

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Impact of perfluoroisobutylene exposure on pulmonary microvascular endothelial cells of rats

WANG Yan-lin1，2，3，ZHAO Jian2，3，HUANG Chun-qian2，3，WANG He-mei2，3，DING Ri-gao2，3
（1.Institute of Transfusion Medicine，2.Institute of Pharmacology and Toxicology，3.State Key Laboratory of Toxicology and Medical Countermeasures，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China）

OBJECTIVE To investigate the change of tumor necrosis factor-α（TNF-α），interleukin-1β（IL-1β），intercellular adhesion molecules（ICAM-1），matrix metalloproteinases 2（MMP-2）and MMP-9 contents in cultured pulmonary microvascular endothelial cells（PMVECs）in rats after perfluoroisobutylene（PFIB）exposure.METHODS PMVECs were separated and purified using a modified method of implantation of pulmonary tissues.After identification，PMVECs were divided into the normal control group and the PFIB-exposed groups（n=3）.The PFIB-exposed groups inhaled PFIB at the concentration of 200 mg·m-3for 5 min in a flow-past header，while the normal control group were PMVECs in quiescent condition.The supernatants and lysates of PMVECs were harvested at 0.5，1，2，4 and 8 h，respec?tively，after execution.The contents of TNF-α，IL-1β，ICAM-1，MMP-2 and MMP-9 were measured by ELISA，and the activity of MMP-2 and MMP-9 was measured by gelatin zymography.RESULTS①According to the morphologic characteristics of cell growth and the expression of specificity antigens and the bind experiment of phytohemagglutinin，the cells separated and purified by modified method shared the characteristics of PMVECs.②TNF-α was rapidly expressed by PMVECs at 0.5 h post PFIB stimulation and the maximum value was achieved at 2 h post PFIB stimulation（P<0.05）.The newly synthesized TNF-α was slowly released out of the cells.The maximum TNF-α in the supernatant was achieved at 4 h post stimulation.③Within 2 h of stimulation，PMVECs synthesized a large amount of IL-1β and peaks at 2 h.However，IL-1β was never released to the extracellular milieu.④The amount of ICAM-1 was rapidly synthesized by PMVECs after PFIB stimulation，but at a low level.⑤After stimulation with PFIB，MMP-2 in the supernatant of PMVECs culture was gradually increased，peaked at 2 h and then decreased subsequently.The biological activity of MMP-2 in the supernatant was also enhanced after PFIB stimulation.PFIB did not stimulate synthesis or secretion of MMP-9，indicating that PMVECs were not the main source of MMP-9 during PFIB inhalation-induced acute lung injury. CONCLUSION PFIB stimulates the surviving PMVECs to synthesize a large amount of TNF-α，IL-1β，MMP-2 and conjunctive ICAM-1.

pulmonary microvascular endothelial cells；perfluoroisobutylene；cytokines；adhesion molecule；matrix metalloproteinase

s：DING Ri-gao，E-mail：dingrigao@nic.bmi.ac.cn；WANG He-mei，E-mail：whemei@aliyun.com

R994.3，R996

A

1000-3002-（2016）09-0955-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.09.008

Foundation item：The project supported by National Natural Science and Technology Major Project of China（2010ZXJ0900X-005）

2016-01-06接受日期：2016-09-05）

（本文編輯：齊春會(huì)）

國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)（2010ZXJ0900X-005）

王延琳，女，醫(yī)學(xué)博士，助理研究員，主要從事化學(xué)性肺損傷機(jī)制及防治藥物研究。

丁日高，E-mail:dingrigao@nic.bmi.ac.cn;王和枚，E-mail:whemei@aliyun.com