GADD45 α在遺傳毒性檢測中的分子原理及研究進展

靳 溪，席 超，劉 愷，劉 進

（北京師范大學生命科學學院實驗技術中心，北京 100875）

GADD45 α在遺傳毒性檢測中的分子原理及研究進展

靳 溪，席 超，劉 愷，劉 進

（北京師范大學生命科學學院實驗技術中心，北京 100875）

GADD45α作為細胞生長阻滯和DNA損傷誘導基因家族成員，參與細胞周期阻滯、細胞凋亡和細胞衰老等調控，在多種因素誘導的細胞應激及DNA損傷應答調控網絡中發(fā)揮重要生物學功能。多種轉錄因子和蛋白參與GADD45α基因的轉錄調控。GADD45α蛋白通過與其他蛋白相互作用在基因組穩(wěn)定性相關的細胞應答調控中發(fā)揮作用?；贕ADD45α的細胞調控特性構建的遺傳毒性檢測系統(tǒng)被應用于外源化合物的體外遺傳毒性評價，為遺傳毒性評價研究提供了新的思路。本文就GADD45α在遺傳毒性檢測應用中的分子原理和研究進展進行綜述。

GADD45α；DNA損傷；細胞周期；遺傳毒性檢測

生長阻滯和DNA損傷誘導基因（growth arrest and DNA damage-inducible 45α，GADD45α）又名DNA損傷誘導轉錄基因1（DNA damage-inducible transcript 1）。多種細胞應激因素，包括遺傳毒性化合物、細胞營養(yǎng)缺乏、電離輻射和紫外線輻射等都能誘導GADD45α的轉錄表達，該基因過度表達會導致細胞出現生長阻滯和凋亡現象。該基因編碼的蛋白是一類調控分子，其主要功能是保護細胞，在細胞周期阻滯、細胞增殖、細胞凋亡和細胞衰老等調控進程中發(fā)揮重要作用［1-6］?；贕ADD45α的細胞調控特性構建的遺傳毒性檢測系統(tǒng)已被應用于外源化合物的遺傳毒性檢測。該檢測方法實現了基于人源細胞的體外遺傳毒性評價，具有高特異性、可操作性和良好重復性的優(yōu)勢，同時可滿足高通量檢測的需求，為毒理學評價方法提供有益的研究參考。

1 GADD45 α遺傳毒性檢測系統(tǒng)分子原理

基于GADD45α的分子調控機制構建的遺傳毒性檢測系統(tǒng)主要包括報告質粒和轉染細胞2部分，其核心是由該基因啟動子、外顯子和內含子序列，結合報告熒光基因序列〔綠色熒光蛋白（green fluo?rescent protein，GFP）或熒光素酶〕及調控元件構建的報告質粒（圖1）。將該質粒轉染人淋巴母細胞TK6形成GADD45α遺傳毒性檢測系統(tǒng)，即可應用于外源化合物的遺傳毒性評價。該基因在多種DNA損傷誘導因素下通過不同的調控途徑激活轉錄。若外源化合物具有誘導DNA損傷的效應，則報告質粒中該基因啟動子激活，繼而發(fā)出報告熒光，綜合統(tǒng)計分析細胞中熒光強度差異和變化可判斷外源化合物誘導該基因轉錄激活效應，由此實現對外源化合物的遺傳毒性評價［7-8］。

圖1報告質粒結構示意圖.Ⅰ：叉頭盒O類轉錄因子3a結合位點；Ⅱ：Wilms腫瘤基因1-早期生長應答因子1結合位點；Ⅲ：八聚體結合轉錄因子1和CCAAT結合位點；GFP：綠色熒光蛋白.

1.1 GADD45α基因

人GADD45α基因位于染色體1p3112，全長3278 bp，有4個外顯子，mRNA全長1398 bp（NM_001924），編碼序列全長498 bp［9］。它主要表達在細胞核內，并廣泛表達于多種正常組織中。該基因在物種之間高度保守，在人類、羅猴、家貓、倉鼠、小鼠和大鼠有＞90%的氨基酸序列具有一致性［10-11］。在多種小鼠細胞系、人成纖維細胞、人淋巴細胞和人多種腫瘤細胞中，已證明特定的DNA損傷試劑誘導GADD45α基因表達上調。該基因參與多種因素誘導的細胞DNA損傷和細胞凋亡，以及細胞周期和DNA修復等調控，具有重要的生物學功能［12-17］。

1.2 GADD45α基因的轉錄調控

多種轉錄因子和蛋白參與該基因的轉錄調控。根據外源刺激、細胞類型和生長環(huán)境等條件不同，該基因表達調控途徑也不同。

1.2.1 P53蛋白與GADD45α轉錄調控

P53介導的GADD45α上調是水飛薊賓在紫外線輻射誘導細胞損傷時發(fā)揮保護作用的主要調節(jié)機制［18］。該基因的第三內含子中有一個高度保守的P53結合位點，結合此位點可促進該基因的轉錄表達。另外，P53與其他蛋白相互作用間接調控其轉錄。Wilms腫瘤基因1（Wilms tumor 1，WT1）是一個重要的腫瘤抑制蛋白，核轉錄因子GADD45α啟動子區(qū)有WT1結合位點，P53可通過依賴和非依賴途徑調控其轉錄表達［19］。各種影響P53與WT1結合的因素或影響其功能的因素均可能導致GADD45α轉錄活性的改變。

1.2.2 乳腺癌1號基因蛋白（breast cancer 1，BRCA1）與GADD45α轉錄調控

研究發(fā)現，隨著BRCA1的誘導表達，GADD45α的mRNA水平顯著升高。多種人細胞系瞬時轉染表達BRCA1質粒也能誘導GADD45α基因表達［20］。在DNA損傷因素作用下，八聚體結合轉錄因子 1（octamer binding transcription factor 1，OCT1）和核轉錄因子Y亞基α（nuclear transcrip?tion factor Y subunit alpha，NF-YA）表達增高，提示這2個轉錄因子可能參與了遺傳毒性的細胞應答。在GADD45α基因啟動子-121~-75 bp區(qū)間有OCT1結合位點和CCAAT框，可分別與轉錄因子OCT1和NF-YA結合。凝膠遷移實驗進一步證實它們可與GADD45α基因啟動子結合［21-24］。BRCA1對GADD45α的轉錄調控主要是通過與轉錄因子OCT1和NF-YA相互作用，進而結合于GADD45α基因啟動子區(qū)OCT1結合位點和CCAAT框，調節(jié)GADD45α的基因轉錄。GADD45α基因啟動子區(qū)段OCT1結合位點和CCAAT框的堿基序列突變或缺失會導致BRCA1誘導GADD45α基因轉錄表達的作用下降［22］。Aurora激酶抑制劑通過招募OCT1轉錄因子至基因啟動子關鍵區(qū)域調控GADD45α轉錄表達［25］。通過OCT-1和NF-YA激活GADD45α轉錄是紫外線輻射、甲磺酸甲酯和曲古菌素A等刺激因素重要的細胞應答調控方式［21，24］。

1.2.3 其他蛋白與GADD45α轉錄調控

CCAAT增強子結合蛋白（CCAAT enhancer binding protein,C/EBP）可誘導GADD45α基因表達［26］。亞砷酸鹽和亮氨酸缺乏、蛋白酶體抑制及內質網應激等因素誘導活化轉錄因子4（activating transcription factor 4，ATF4）激活該基因轉錄［27］。在磷酸肌醇3抑制劑或氧化應激刺激下，叉頭盒O類轉錄因子3a（forkhead box O 3a，FOXO3a）蛋白結合到該基因啟動子激活GADD45α基因轉錄［28-29］。小鼠成纖維細胞中Myc顯著并有選擇性地抑制FOXO介導的GADD45α基因表達，Myc和Akt通過失活FOXO抑制該基因轉錄［30］。

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated pro?tein kinases，MAPK）信號通路誘導GADD45α表達是通過P38和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-ter?minal kinase,JNK）活化c-Jun。與P53類似，c-Jun在GADD45α第三內含子區(qū)域存在結合位點，激活GADD45α基因的轉錄。雌激素受體β以不依賴配體的方式與該基因啟動子結合募集c-Jun，激活該基因轉錄，參與調控細胞周期G2/M期阻滯［31］。GADD45α在DNA損傷誘導的細胞衰老調控中發(fā)揮重要作用。它通過P38信號通路調控反式激活P53以維持細胞衰老表型。GADD45α，P38和P53之間的反饋調節(jié)在成纖維細胞、角質細胞等類型細胞DNA損傷后誘導和維持細胞衰老表型的調控中必不可少［26，32］。

1.3 GADD45α參與DNA修復調控

GADD45α主要通過促進蛋白質之間相互作用或改變蛋白質結構來發(fā)揮其生物學功能。各種因素誘導細胞應激或DNA損傷后，它通過參與細胞周期、細胞凋亡和DNA修復等功能的調控以維持細胞基因組穩(wěn)定性。已有很多文獻報道，GADD45α參與細胞周期G1/S期和G2/M期阻滯、細胞凋亡和中心體穩(wěn)定性的調控機制［3，33-38］。各種因素誘導基因組DNA出現損傷后，DNA會通過多種途徑調節(jié)進行損傷修復，以保證基因組穩(wěn)定性，防止惡變。損傷修復主要包括錯配修復、直接修復、切除修復、重組修復和易錯修復等。研究發(fā)現，GADD45α在細胞DNA損傷修復中具有重要作用。

GADD45α缺失小鼠造血干細胞在電離輻射刺激后DNA修復延遲［39］。在共濟失調毛細血管擴張突變基因缺失小鼠的造血干細胞中，GADD45α基因缺失加重細胞DNA損傷［40］。在甲磺酸甲酯誘導DNA損傷后的DNA修復中，GADD45α參與堿基切除修復（base excision repair，BER）過程［38，41］。GADD45α缺失可減少BER，影響無嘌呤無嘧啶核酸內切酶（apurinic/apyrimidinic endonuclease，APE）在胞質定位，并且降低APE和增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）的相互作用，延緩無嘌呤位點的移除［42］。有機硒誘導人結直腸癌細胞DNA損傷后的BER活性與GADD45α和修復蛋白（PCNA/APE1）相互作用有關。GADD45α蛋白上存在PCNA蛋白結合位點，GADD45α通過與PCNA和DNA修復復合物相互作用調控DNA修復。PCNA與GADD45α的結合位點對于APE和PCNA相互作用調控十分重要，并因此影響B(tài)ER效果［43］。GADD45α和P21競爭性與PCNA相互作用。在紫外線輻射的角質細胞中，GADD45α下調P21的表達并促進BER進程［26］。

核苷酸切除修復（nucleotide excision repair，NER）是紫外輻射誘導人體細胞DNA損傷后DNA修復的重要途徑。體外實驗和細胞實驗表明，重組GADD45α可促進NER。GADD45α主要通過識別紫外輻射誘導的細胞染色體結構變化，并調控DNA修復復合物的組裝參與NER。GADD45α缺失導致全基因組水平NER功能下降及細胞對DNA損傷應激敏感，如GADD45α缺失的結直腸癌細胞缺失NER功能，同時對紫外輻射和順鉑誘導的DNA損傷應激更加敏感［28，44］。

各種因素誘導細胞應激或DNA損傷后，GADD45α基因的轉錄激活是GADD45α蛋白發(fā)揮細胞調控功能的分子基礎。GADD45α通過參與細胞周期、細胞凋亡和DNA修復等功能的調控以維持細胞基因組穩(wěn)定性。遺傳毒性檢測系統(tǒng)中應用的人源細胞自身對于DNA損傷刺激因素會做出反饋調節(jié)，細胞中GADD45α蛋白通過發(fā)揮維持細胞基因組穩(wěn)定性的調控功能，保障應用于檢測系統(tǒng)細胞的存活。

2 GADD45 α遺傳毒性檢測系統(tǒng)的應用

基于GADD45α在DNA損傷細胞應答調控中的特性和體外毒理學評價發(fā)展需求，已研發(fā)出基于GADD45α分子調控機制的人源細胞遺傳毒性檢測系統(tǒng)，并已應用于外源化合物的毒理學評價。該系統(tǒng)在體外遺傳毒性化合物檢測中具有高度特異性和良好的重復性，被國際生命科學學會健康與環(huán)境科學研究所［45］、英國食品消費品和環(huán)境化合物致突變委員會［46］及歐洲食品安全局［47］等國際機構認可為一種有效的新化合物體外遺傳毒性評價工具。

基于GADD45α分子調控機制構建的遺傳毒性檢測系統(tǒng)依據報告基因類型，可分為基于熒光蛋白基因表達發(fā)出綠色熒光的細胞GSHC（green screen human cells）檢測系統(tǒng)和基于熒光素酶發(fā)光原理發(fā)出藍色熒光的細胞BSHC（blue screen human cells）檢測系統(tǒng)。目前，這2種檢測系統(tǒng)均被應用于外源化合物體外遺傳毒性評價。

2.1 GSHC檢測系統(tǒng)

GSHC檢測系統(tǒng)由Hastwell等［7］最初構建，以GFP作為報告基因，將報告質粒轉染TK6細胞，以96孔板對外源化合物遺傳毒性進行評價。用該檢測系統(tǒng)對直接遺傳毒性化合物、非整倍體誘發(fā)劑、核苷酸合成抑制劑、拓撲異構酶抑制劑和活性氧簇等34種在其他遺傳毒性檢測實驗中（Ames實驗、染色體斷裂實驗和小鼠淋巴瘤細胞實驗等）至少1項呈陽性結果的化合物進行評價。結果顯示，31種化合物具有遺傳毒性，其中11種GSHC檢測陽性的化合物在Ames實驗中呈陰性。同時應用GSHC檢測系統(tǒng)檢測41種遺傳毒性陰性的化合物結果均顯示為陰性。應用GSHC檢測系統(tǒng)對75種藥品進行遺傳毒性檢測并與其他遺傳毒性檢測方法結果進行比較分析。結果顯示，GSHC檢測系統(tǒng)的靈敏度高于Ames實驗，特異性高于體外哺乳動物細胞基因突變實驗，說明GSHC檢測系統(tǒng)對于遺傳毒性化合物具有良好的檢測靈敏度和特異性，可在藥物研發(fā)工作中用于尚無臨床安全評價數據的候選藥物對人體潛在遺傳毒性評價［48］。應用GSHC檢測系統(tǒng)對8種化合物進行遺傳毒性評價，由4個實驗室分別進行，獲得了一致性的結果，說明GSHC檢測方法具備可操作性，實驗結果有良好的重復性［49］。

應用GSHC檢測系統(tǒng)，在添加或不添加S9混合物的條件下，檢測歐洲替代方法驗證中心（Euro?pean Centre for the Validation of Alternative Methods，ECVAM）規(guī)定的體外遺傳毒性檢測效果評估化合物列表中62種化合物?；衔锕卜譃?類。第1類化合物是體內遺傳毒性陽性化合物，在哺乳動物細胞中檢測應得到體外遺傳毒性陽性結果；第2類化合物是非DNA效應化合物（包括非遺傳毒性致癌物），在哺乳動物細胞中檢測應得到體外遺傳毒性陰性結果；第3類化合物是非DNA效應化合物（包括非遺傳毒性致癌物）、代謝性毒物和其他化合物，在哺乳動物細胞中檢測應得到體外遺傳毒性陰性結果，但是已有研究報道，其在高濃度或高水平細胞毒性效應條件下遺傳毒性檢測呈陽性結果。GSHC檢測第1類化合物陽性結果占比90%，第2類化合物陰性結果占比96%，第3類化合物中76%呈現陰性結果。一方面說明GSHC檢測系統(tǒng)對于遺傳毒性化合物具有較好的檢測特異性，可有效控制檢測結果假陽性率［50］；另一方面提示該檢測系統(tǒng)不能應用于非遺傳毒性致癌物的檢測。

在將16種化合物應用于GSHC檢測系統(tǒng)的研究中發(fā)現，盡管GADD45α參與DNA損傷應答和細胞凋亡的細胞信號網絡調節(jié)，但檢測結果顯示細胞凋亡誘導因素不會導致假陽性結果，說明GSHC檢測系統(tǒng)可有效區(qū)分遺傳毒性因素和凋亡刺激因素［51］。應用GSHC檢測系統(tǒng)、SOS顯色反應、Mini-Ames實驗和微核實驗對高德美公司22種化合物進行遺傳毒性早期篩選。GSHC檢測系統(tǒng)的靈敏度和特異性優(yōu)于SOS顯色反應，檢測陽性結果與Mini-Ames實驗陽性結果一致，與微核實驗陽性結果90%一致，說明GSHC檢測系統(tǒng)在候選藥物體外遺傳毒性早期篩查工作中是一種合適且有效的篩選工具［52］。Johnson等［53］應用GSHC檢測系統(tǒng)檢測到4種組蛋白脫乙酰化酶抑制劑類藥物具有體外遺傳毒性效應，推測該類藥物的抗腫瘤活性機制可能與其遺傳毒性作用相關，為該類藥物的研發(fā)和管理評價工作提供參考。

2.2 BSHC檢測系統(tǒng)

GSHC檢測系統(tǒng)應用GFP作為報告熒光，但在應用中發(fā)現某些化合物存在自發(fā)熒光。因此，干擾檢測結果或無法被GSHC檢測系統(tǒng)檢測［50］。將報告質粒中GFP基因替換為高斯熒光素酶（Gaussia luciferase，GLu）基因構建基于熒光素酶發(fā)光原理的BSHC檢測系統(tǒng)可有效解決這一問題。GLu報告熒光在特定底物存在時才會產生，由此可實現排除化合物自發(fā)熒光的檢測干擾。另一方面，因為報告熒光的產生需要底物存在，當不加入底物時，檢測系統(tǒng)無熒光產生，由此可對細胞進行熒光標記，實現細胞生長情況的準確監(jiān)測，為應用BSHC檢測系統(tǒng)時減少細胞使用數量提供可能，由此，BSHC檢測系統(tǒng)具有高通量檢測的可能［54］。

應用BSHC檢測系統(tǒng)，在添加或不添加S9混合物的條件下，檢測ECVAM規(guī)定的體外遺傳毒性檢測效果評估化合物列表中60種化合物?；衔锕卜譃?類（與GSHC的3類相同，略）。BSHC檢測第1類化合物陽性結果占比80%，第2類化合物100%陰性結果，第3類化合物中67.7%呈現陰性結果。說明BSHC檢測系統(tǒng)可應用于體外遺傳毒性化合物篩選，與GSHC檢測系統(tǒng)一樣具有較好的檢測特異性。應用GSHC檢測系統(tǒng)時，第2類化合物中僅有乙二胺四乙酸三鈉呈現遺傳毒性陽性結果，這可能與螯合劑降低細胞內金屬離子濃度的化學特性有關。應用BSHC檢測系統(tǒng)時，第2類化合物均未出現遺傳毒性陽性結果，說明BSHC檢測系統(tǒng)不受螯合劑作用干擾。但在第3類化合物檢測結果中，BSHC陰性率低于GSHC檢測結果，分析可能的原因，一是與2種檢測方法發(fā)光原理不同相關，二是與檢測化合物的濃度有關［54］。

Simpson等［55］應用384孔板BSHC檢測系統(tǒng)檢測GSHC檢測結果呈陽性或陰性化合物，并綜合分析已有研究結果，發(fā)現應用此檢測系統(tǒng)與96孔板的BSHC及GSHC的檢測結果一致。Etter等［56］應用BSHC檢測系統(tǒng)對70種香料和香味化合物進行了體外遺傳毒性評價，發(fā)現相比于常規(guī)體外毒性檢測方法，BSHC檢測系統(tǒng)是一種有效的香料和香味化合物的安全性評價工具，可應用于缺乏常規(guī)遺傳毒性實驗數據資料的化合物體外遺傳毒性檢測。

應用GSHC和BSHC檢測系統(tǒng)評價20種非甾體抗炎藥物。結果表明，非甾體抗炎藥物不易誘導2種檢測系統(tǒng)得出假陽性結果。因為該類藥物不是遺傳毒性致癌物，由此說明這2種檢測系統(tǒng)在體外遺傳毒性評價中具有較高的特異性［46］。Scott等［57］應用這2種檢測系統(tǒng)評價Ames實驗呈陽性結果的硼酸對真核生物的遺傳毒性。結果發(fā)現，硼酸對于真核細胞僅有微弱或陰性的遺傳毒性效應。因此，該研究建議，在將Ames實驗呈陽性結果的化合物評價結論推論到人體遺傳毒性效應之前還需其他的體外或體內評價數據。

基于GADD45α的分子調控機制構建的遺傳毒性檢測系統(tǒng)，從最初的GSHC檢測系統(tǒng)到BSHC檢測系統(tǒng)，從96孔通量到384孔通量，檢測方法在不斷發(fā)展。用于構建檢測系統(tǒng)的人源細胞不再局限于TK6。Xin等［58］構建基于熒光素酶的報告質粒，而后轉染A549細胞和HepG2細胞，應用這2種攜帶報告質粒的細胞系可有效檢測出MMS、苯并芘和甲醛等化合物的遺傳毒性效應，并應用此檢測系統(tǒng)實現快速、靈敏的檢測煉焦爐提取有機物遺傳毒性效應。實驗結果表明，該檢測系統(tǒng)可在較低濃度下有效檢出不同類型環(huán)境中遺傳毒性物質。相比A549細胞，將報告質粒轉染HepG2細胞所構建的檢測系統(tǒng)在環(huán)境污染物遺傳毒性評價中更具應用價值。

3 結語

GADD45α作為細胞生長阻滯和DNA損傷誘導基因，參與細胞周期阻滯、細胞凋亡和細胞衰老等功能調控，在多種因素誘導細胞應激反應調控網絡中發(fā)揮重要生物學功能。深入研究GADD45α基因及其蛋白的調控功能，有助于揭示遺傳毒性因素誘導細胞應答效應的作用機制，為化合物的毒理作用機制研究提供理論基礎。基于GADD45α的細胞調控特性構建的遺傳毒性檢測系統(tǒng)已被應用于化合物體外遺傳毒性評價工作，該檢測系統(tǒng)對于遺傳毒性化合物檢測具有良好的特異性、靈敏性和重復性，是一種有效的體外評價工具。但在檢測應用中也可能出現某些受試化合物抑制熒光素酶發(fā)光反應，從而呈現假陰性結果；受試化合物的細胞毒性過強時會影響檢測系統(tǒng)的穩(wěn)定性。通過對檢測系統(tǒng)報告質粒進行改造，對轉染細胞進行更多的實驗篩選，全面優(yōu)化檢測體系，該檢測系統(tǒng)可在藥物篩選、環(huán)境污染物鑒定和化妝品安全性評價等領域，為化合物的體外毒理學評價提供新的策略。

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GADD45 α in genotoxicity test：molecular principles and research progress

JIN Xi，XI Chao，LIU Kai，LIU Jin
（Experimental Technology Center，College of Life Sciences，Beijing Normal University，Beijing 100875，China）

As a member of growth arrest and DNA damage inducible gene family，GADD45α participats in the regulation of cell cycle，cell senescence，cell survival and apoptosis.GADD45α plays a critical role in the responses to cell injury induced by a variety of factors including cell stress and genotoxic chemicals.Different transcription factors and proteins are involved in transcriptional regulation ofGADD45αgene.GADD45α protein has been implicated in the regulation of genomic stability related cellular responses through interaction with other proteins.Genotoxicity test systems based on the char?acteristics ofGADD45α in regulation of cell function，can be applied to the detection of potentially genotoxic compounds，which provides new ideas and methods about genotoxicity assessment.The molecular mechanism and research progress ofGADD45α in genotoxicity test are summarized in this article.

GADD45α；DNA damage；cell cycle；genotoxicity test

LIU Jin，Tel：（010）58808688，E-mail：liujin@bnu.edu.cn

R394.6

A

1000-3002-（2016）09-0989-08

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.09.013

Foundation item：The project supported by Fundamental Research Funds for the Central Universities（2013YB49）

2015-09-21 接受日期：2016-07-05）

（本文編輯：賀云霞）

中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金資助（2013YB49）

靳 溪，女，博士，工程師，主要從事遺傳毒理學研究，E-mail：jinxi@bnu.edu.cn

劉 進，E-mail：liujin@bnu.edu.cn，Tel：（010）58808688