氯吡硫磷染毒撤除對原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞毒性的延遲效應(yīng)

吳春燕，閆長會(huì)，傅風(fēng)華，關(guān)勇彪

（1.煙臺大學(xué)藥學(xué)院，山東煙臺 264005；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，國家北京藥物安全評價(jià)與研究中心，抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850）

氯吡硫磷染毒撤除對原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞毒性的延遲效應(yīng)

吳春燕1，2*，閆長會(huì)2*，傅風(fēng)華1，關(guān)勇彪2

（1.煙臺大學(xué)藥學(xué)院，山東煙臺 264005；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，國家北京藥物安全評價(jià)與研究中心，抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850）

目的 探討低濃度氯吡硫磷（毒死蜱，CPF）染毒撤除對原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細(xì)胞毒性的延遲效應(yīng)。方法 原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元經(jīng)CPF 10和30 μmol·L-1連續(xù)染毒72 h，或連續(xù)染毒48 h后更換無CPF的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，運(yùn)用CCK-8試劑盒檢測海馬神經(jīng)元的存活；用神經(jīng)元核（NeuN）、5-溴脫氧尿苷（BrdU）和βⅢ微管蛋白免疫熒光染色法檢測海馬不同發(fā)育階段神經(jīng)元數(shù)量。結(jié)果 原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元經(jīng)CPF 10和30 μmol·L-1連續(xù)染毒72 h，與正常對照組相似，未檢測到明顯神經(jīng)元死亡；而CPF 10和30 μmol·L-1連續(xù)染毒48 h撤除后24 h，與正常對照組相比，出現(xiàn)細(xì)胞破裂、突觸斷裂現(xiàn)象，且海馬神經(jīng)元數(shù)目明顯減少（P<0.05），神經(jīng)元的存活率明顯下降（P<0.05），BrdU和βⅢ微管蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞的數(shù)量明顯減少（P<0.05）。結(jié)論 CPF 10和30 μmol·L-1染毒撤除后對大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞毒性具有延遲效應(yīng)。

有機(jī)磷殺蟲劑；氯吡硫磷；海馬；神經(jīng)元，培養(yǎng)的

目前，有機(jī)磷殺蟲劑（organophosphorus pes?ticides，OP）在世界范圍內(nèi)仍廣泛使用，環(huán)境中的低劑量OP持續(xù)暴露給人類健康帶來危害［1］。流行病學(xué)研究資料顯示，OP暴露后能誘發(fā)慢性神經(jīng)毒性，其中最為常見的是與學(xué)習(xí)記憶和注意力下降相關(guān)的認(rèn)知功能障礙［2-5］，而該癥狀一般在脫離OP暴露的一段時(shí)間后才出現(xiàn)［6］。這種現(xiàn)象在人類和動(dòng)物中均有發(fā)生［7-10］。這種OP撤除誘導(dǎo)的遲發(fā)性中樞神經(jīng)毒性作用機(jī)制尚不明確。氯吡硫磷（毒死蜱，chlorpyrifos，CPF）自2007年之后成為我國對硫磷和甲胺磷等高毒性O(shè)P的替代品。在我國的農(nóng)副產(chǎn)品中，CPF是能被檢測出的主要?dú)埩舫煞趾统瑯?biāo)成分。因此，CPF中樞神經(jīng)毒性的研究對于農(nóng)藥引起的健康風(fēng)險(xiǎn)評估具有重要意義。本研究觀察CPF染毒撤除后原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元的細(xì)胞毒性反應(yīng)，探討OP對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

B-27添加劑〔B-27 Supplement（50×）〕、N-2添加劑〔N-2 Supplement（50×）〕、馬血清、DMEM/ F12、神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基及PBS購自美國Gibco公司；DHanks液、多聚賴氨酸和FUDR購自美國Sigma公司；胎牛血清購于四季青公司；CCK-8試劑盒購自日本DOjinDO株式會(huì)社；牛血清白蛋白由瑞士Roche公司提供；兔抗神經(jīng)元核（neuronal nuclei，NeuN）、兔抗βⅢ微管蛋白和大鼠抗5-溴脫氧尿苷（5-bromodeoxyuridine，BrdU）一抗以及山羊抗大鼠熒光標(biāo)記二抗（Alexa Fluor?488）和山羊抗兔熒光標(biāo)記二抗（Alexa Fluor?594）均購自美國Abcam公司；大鼠神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）由美國Pepro Tech公司提供；臺盼藍(lán)購自北京索來寶公司；DAPI購自美國Molecular Probes公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。CKX41倒置顯微鏡和IX70倒置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯株式會(huì)社），MCO-175 CO2培養(yǎng)箱（日本三洋電器集團(tuán)），Ti-A1倒置共聚焦顯微鏡和SMZ745T解剖顯微鏡（日本尼康公司），Victor3 1420型多標(biāo)記酶標(biāo)儀（芬蘭鉑金埃爾默儀器有限公司）。

1.2 胎鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)和鑒定

胎鼠海馬神經(jīng)元制備參照Tan等［11］和Zhang等［12］方法并略加修改。在無菌條件下取胎齡16~ 18 d胎鼠，短暫浸泡乙醇消毒后，剪下頭部置于裝有預(yù)冷D-Hanks液的培養(yǎng)皿中，迅速解剖大腦，分離海馬，仔細(xì)剝離微血管和血管膜后將海馬組織剪成0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm碎片。胰蛋白酶37℃消化8 min，馬血清終止消化。分步吹打法收集單細(xì)胞懸液，800×g離心10 min后棄上清，加入含胎牛血清的DMEM/F12接種培養(yǎng)液重懸，計(jì)數(shù)后按照一定數(shù)量接種至經(jīng)多聚賴氨酸包被的不同規(guī)格培養(yǎng)板中。6 h后全量更換無血清維持培養(yǎng)液，以后2~3 d半量更換1次培養(yǎng)液。配制接種培養(yǎng)液：DMEM/F12培養(yǎng)液、10%馬血清（熱滅活）、10%胎牛血清（熱滅活，過濾）、青霉素100 kU·L-1和鏈霉素100 mg·L-1。配制維持培養(yǎng)液：①DMEM/F12培養(yǎng)液含10%馬血清（熱滅活）、2%B-27、1%N-2、青霉素50 kU·L-1和鏈霉素100 mg·L-1；②神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基含2%B-27、青霉素50 kU·L-1和鏈霉素100 mg·L-1。在培養(yǎng)第7天采用抗NeuN抗體進(jìn)行免疫組化染色鑒別神經(jīng)元純度，純度>90%時(shí)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞形態(tài)觀察

細(xì)胞接種后，分別在不同時(shí)間將細(xì)胞培養(yǎng)板放在倒置顯微鏡下觀察神經(jīng)元形態(tài)，并拍照標(biāo)記。細(xì)胞培養(yǎng)第7天，進(jìn)行CPF染毒。CPF經(jīng)DMSO溶解后，用培養(yǎng)液稀釋至10和30 μmol·L-1，DMSO終濃度為0.5%。吸除舊培養(yǎng)液，加入含CPF的培養(yǎng)液。持續(xù)染毒組在染毒72 h后觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照標(biāo)記；染毒撤除組在CPF染毒48 h后，更換不含CPF的常規(guī)神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，與持續(xù)染毒組一起觀察細(xì)胞形態(tài)，并拍照標(biāo)記。同時(shí)設(shè)正常對照組和溶劑對照組，正常對照組為正常完全神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)的神經(jīng)元，溶劑對照組為含0.5%DMSO的神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)的神經(jīng)元。

1.4 CCK-8檢測細(xì)胞存活

使用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞存活。細(xì)胞培養(yǎng)第7天，持續(xù)染毒組經(jīng)CPF染毒72 h，吸除所有培養(yǎng)液，將CCK-8試劑以1∶10比例與新鮮的神經(jīng)基礎(chǔ)細(xì)胞維持培養(yǎng)液混合均勻，每孔中加入110 μL該混合液，避免產(chǎn)生氣泡。將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中孵育一定時(shí)間。使用酶標(biāo)儀測定吸光度值。染毒撤除組在CPF染毒48 h，吸除所有上清液，PBS清洗3次后，補(bǔ)充新鮮的不含CPF的常規(guī)神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，與持續(xù)染毒組一起進(jìn)行吸光度值（A450nm）測定。存活率（%）=（A實(shí)驗(yàn)孔-A空白孔）/（A對照孔-A空白孔）×100%，其中，實(shí)驗(yàn)孔含細(xì)胞培養(yǎng)液、CCK-8和CPF；對照孔含細(xì)胞培養(yǎng)液和CCK-8，無CPF；空白孔含細(xì)胞培養(yǎng)液，無細(xì)胞、CPF和CCK。

1.5 免疫熒光法檢測細(xì)胞活性

染毒流程同1.4。持續(xù)染毒組在染毒72 h后，染毒撤除組在持續(xù)染毒48 h撤除CPF再正常培養(yǎng)24 h后，一并進(jìn)行免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)。具體操作步驟如下：吸除培養(yǎng)液，用PBS漂洗細(xì)胞3次后，每孔中加入4%多聚甲醛350 μL固定細(xì)胞25 min；棄去多聚甲醛，加入甘氨酸0.1 mol·L-1，每孔400 μL，室溫孵育7 min；棄甘氨酸，每孔加入500 μL預(yù)冷PBS，洗3次；0.5%Triton X-100室溫通透20 min，每孔加入500 μL預(yù)冷PBS，洗3次；棄PBS，加入相應(yīng)一抗（抗NeuN、BrdU或βⅢ微管蛋白一抗），4℃濕盒過夜；PBS浸洗爬片3次，每次3 min，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加已稀釋的熒光二抗，避光，濕盒中20~37℃孵育1 h；每孔500 μL預(yù)冷PBS浸洗3次，每次3 min；滴加DAPI避光孵育5 min，對標(biāo)本進(jìn)行染核，PBS 5 min洗4次洗去多余DAPI；用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在激光共聚焦顯微鏡下觀察采集圖像。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)均以x±s，表示，應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用單因素方差分析及Dunnettt檢驗(yàn)。P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CPF持續(xù)染毒48 h后和染毒撤除對海馬神經(jīng)元形態(tài)的影響

普通光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)（圖1），正常對照組和溶劑對照組神經(jīng)元生長狀況均良好。CPF 10和30 μmol·L-1連續(xù)染毒72 h后，神經(jīng)元生長與正常對照組相比無明顯變化，神經(jīng)元胞體飽滿，突觸網(wǎng)絡(luò)清晰可見，無死亡細(xì)胞碎片。持續(xù)暴露48 h后撤除CPF繼續(xù)培養(yǎng)24 h，CPF 10 μmol·L-1染毒撤除組與正常培養(yǎng)組和溶劑對照組相比，顯示神經(jīng)元數(shù)目減少，并出現(xiàn)細(xì)胞碎片、突觸斷裂；CPF 30 μmol·L-1染毒撤除組上述情況更加嚴(yán)重。由此提示，CPF 10 μmol·L-1撤除染毒條件下，原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的細(xì)胞毒性反應(yīng)明顯大于相同劑量的持續(xù)染毒組。

2.2 CPF持續(xù)染毒和染毒48 h后撤除對海馬神經(jīng)元存活率的影響

Fig.1 Morphological changes in rat primary hippocampal neurons treated with chlorpyrifos（CPF）for 72 h or CPF exposure for 48 h followed by CPF withdrawal for 24 h（200×）.Hippocampal neurons were prepared from SD rat fetuses on the 17thday of gestation.Seven days after culture，neurons were treated with CPF for the indicated time.A1：normal control；A2：vehicle control；B1 and B2：CPF 10 and 30 μmol·L-1，respectively，continuous exposure for 72 h；C1 and C2：CPF 10 and 30 μmol·L-1，respectively，exposure for 48 h followed by CPF withdrawal for 24 h.Arrows show broken synapse or cell debris.

CCK-8檢測結(jié)果顯示（圖2），CPF 10 μmol·L-1持續(xù)染毒72 h神經(jīng)細(xì)胞存活率為（100.9±18.6）%；而CPF處理48 h后撤除繼續(xù)培養(yǎng)24 h，神經(jīng)細(xì)胞存活率降低為（69±14）%（P<0.01）。同樣，CPF 30 μmol·L-1持續(xù)染毒72 h后神經(jīng)細(xì)胞存活率為（91±12）%，而CPF撤除組細(xì)胞存活率降低為（37± 5）%（P<0.01）。由此表明，CPF 10和30 μmol·L-1持續(xù)暴露72 h對神經(jīng)細(xì)胞存活率未見明顯影響；而染毒48 h后撤除繼續(xù)培養(yǎng)24 h，神經(jīng)細(xì)胞存活率明顯降低，提示CPF暴露對海馬神經(jīng)元存在延遲性細(xì)胞毒性作用。

Fig.2 Changes of survival of rat primary hippocampal neurons after CPF continuous exposure for 72 h（A）and CPF exposure for 48 h followed by CPF with?drawal for 24 h（B）.See Fig.1 for the treatment.x±s，n=5. *P<0.05，compared with corresponding A group.

2.3 CPF持續(xù)染毒和染毒48后撤除對海馬神經(jīng)元活性的影響

經(jīng)BrdU和NeuN免疫熒光雙染色（圖3，表1），以及BrdU和βⅢ微管蛋白免疫熒光雙染色（圖4，表2），海馬神經(jīng)元在含有CPF 10和30 μmol·L-1的培養(yǎng)液中持續(xù)培養(yǎng)72 h，僅βⅢ微管蛋白陽性表達(dá)的神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目與正常對照組相比減少（P<0.05），BrdU和NeuN陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)目與正常對照組相比無明顯差異；而CPF撤除組BrdU和βⅢ微管蛋白陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)目與正常對照組和等濃度CPF持續(xù)培養(yǎng)組相比顯著減少（P<0.05），提示海馬神經(jīng)元BrdU和βⅢ微管蛋白的表達(dá)活性均降低。

Tab.1 Changes in amount of 5-bromodeoxyuridine（BrdU）positive cells and neuronal nuclei（NeuN）positive cells in rat primary hippocampal neurons after CPF continuous exposure for72 h and CPF exposure for 48 h followed by CPF withdrawal for 24 h

Tab.2 Amount of BrdU and βⅢ tubulin positive cells in rat primary hippocampal neurons decreased after CPF withdrawal

Fig.3 Changes in amount of BrdU positive cells and NeuN positive cells in rat primary hippocampal neurons after CPF continuous exposure for 72 h and CPF exposure for 48 h followed by CPF withdrawal for 24 h.See Fig.1 for the treatment.A：NeuN negative control；B：BrdU negative control；C：normal control；D and E：CPF 10 and 30 μmol·L-1，respectively，continuous exposure for 72 h；F and G：CPF 10 and 30 μmol·L-1，respectively，exposure for 48 h followed by CPF with?drawal for 24 h.

Fig.4 BrdU positive cells and βⅢ tubulin positive cells in rat primary hippocampal neurons decreased after CPF withdrawal.See Fig.1 for the treatment.A：βⅢ tubulin negative control；B：BrdU negative control；C：normal control；D and E：CPF 10 and 30 μmol·L-1，respectively，continuous exposure for 72 h；F and G：CPF 10 and 30 μmol·L-1，respectively，expo?sure for 48 h followed by CPF withdrawal for 24 h.

3 討論

近年來，不斷有研究發(fā)現(xiàn)CPF暴露會(huì)引起學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能的減退［13-14］。但CPF暴露所致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害多見于流行病學(xué)調(diào)查報(bào)告，直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)比較缺乏。低劑量CPF長期暴露會(huì)導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙和其他神經(jīng)學(xué)異常癥狀，其機(jī)制尚不明確，但可以明確的是非膽堿能機(jī)制在其中起著重要作用。迄今為止，國際上對于CPF神經(jīng)毒性作用機(jī)制的研究主要包括：①谷氨酸鹽介導(dǎo)的興奮性毒性；②改變與分化相關(guān)的生物標(biāo)志基因的表達(dá)；③改變海馬中神經(jīng)營養(yǎng)素和神經(jīng)遞質(zhì)的表達(dá)及影響軸突中線粒體輸運(yùn)等［15-18］。然而這些推測仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

本課題組前期研究了CPF濃度與時(shí)間的效應(yīng)。結(jié)果表明，CPF 10和30 μmol·L-1持續(xù)染毒72 h對原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元無明顯的毒性作用［11，20］。故本研究在此基礎(chǔ)上確定CPF對海馬神經(jīng)元的染毒濃度和時(shí)間。結(jié)果表明，CPF 10和30 μmol·L-1連續(xù)染毒72 h未見海馬神經(jīng)元明顯的細(xì)胞毒性，而在CPF 48 h連續(xù)染毒并撤除24 h后，卻誘發(fā)海馬神經(jīng)元明顯的細(xì)胞毒性，表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)明顯改變（胞碎片、突觸斷裂增加）、細(xì)胞數(shù)目減少及細(xì)胞活性降低。

NeuN，BrdU和βⅢ微管蛋白分別為成熟神經(jīng)元、神經(jīng)前體細(xì)胞和新生神經(jīng)元的特異性標(biāo)志物。本研究用免疫熒光染色對NeuN、BrdU和βⅢ微管蛋白陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，BrdU陽性表達(dá)細(xì)胞和βⅢ微管蛋白陽性表達(dá)細(xì)胞均顯著減少，說明不同發(fā)育階段神經(jīng)元數(shù)目減少，表明CPF撤除能夠引起神經(jīng)細(xì)胞的減少，細(xì)胞活性降低。CCK-8法檢測細(xì)胞存活率，結(jié)果亦表明，CPF 10和30 μmol·L-1持續(xù)染毒72 h細(xì)胞存活率未見明顯降低，CPF撤除后細(xì)胞存活率明顯降低。結(jié)合以上3種檢測方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示CPF持續(xù)暴露并不會(huì)立即引起神經(jīng)元細(xì)胞的死亡，而是在藥物撤除后24 h才出現(xiàn)神經(jīng)元死亡，CPF撤除誘發(fā)原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞毒性反應(yīng)可能并不是由CPF直接毒性作用引起的。

由于大腦中執(zhí)行空間學(xué)習(xí)記憶功能的主要部位為海馬，海馬對于學(xué)習(xí)記憶起重要作用并可影響自主神經(jīng)系統(tǒng)，海馬的損傷將導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙與情緒改變［18］。我們前期的研究結(jié)果也證實(shí)，CPF染毒后大鼠出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶障礙及自發(fā)行為改變［19-20］。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，低濃度CPF連續(xù)染毒后撤除可以誘發(fā)明顯的細(xì)胞毒性。這種CPF撤除導(dǎo)致的細(xì)胞毒性延遲作用可能與CPF的直接毒性作用無關(guān)，其具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。本研究為揭示以CPF為例的OP神經(jīng)毒性作用機(jī)制提供了新的思路。

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Chlorpyrifos exposure withdrawal induces delayed cytotoxicity in rat primary hippocampal neurons

WU Chun-yan1，2*，YAN Chang-hui2*，F(xiàn)U Feng-hua1，GUAN Yong-biao2
（1.School of Pharmacy，Yantai University，Yantai 264005，China；2.State Key Laboratory of Toxicology and Medical Countermeasures，National Beijing Center for Drug Safety Evaluation and Research，Institute of Pharmacology of Toxicology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China）

OBJECTIVE To investigate the delayed cytotoxicity effect of chlorpyrifos（CPF）with?drawal on primary hippocampal neurons.METHODS Hippocampal neurons were prepared from SD rat fetuses on the 17thday of gestation.Seven days after culture，neurons were exposed to CPF 10 and 30 μmol·L-1，respectively，for 72 h or for 48 h followed by CPF withdrawal for 24 h.CCK-8 kit and neuronal nuclei（NeuN），5-bromodeoxyuridine（BrdU）and βⅢ tubulin immunofluorescence expression methods were used to evaluate the cell viability.RESULTS Compared with normal control，no significant cytotoxicity was found after CPF 72 h continuous exposure.However，CPF 48 h expo?sure followed by CPF withdrawal for 24 h induced evident cytotoxicity.The amount of BrdU positiveand βⅢ tubulin positive hippocampal neurons were both decreased significantly（P<0.05），and cell survival and viability reduced after CPF withdrawal.CONCLUSION CPF exposure withdrawal can induce more seriously delayed cytotoxicity than continuous exposure in rat primary hippocampal neurons.

organophosphorus insecticides；chlorpyrifos；hippocampus；neurons，cultured

FU Feng-hua，E-mail：fenghua@luye.cn；GUAN Yong-biao，E-mail：guanyb@hotmail.com，Tel：（010）66931630

R996

A

1000-3002-（2016）09-0941-08

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.09.006

Foundation item：The project supported by National Natural Science Foundation of China（81373035）

2016-05-25接受日期：2016-08-08）

（本文編輯：齊春會(huì)）

國家自然科學(xué)基金（81373035）

吳春燕，女，碩士研究生，主要從事藥理毒理研究，E-mail：xiaomao411@126.com；閆長會(huì)，女，助理研究員，E-mail：yanchanghui2002@163.com，主要從事藥物毒性研究。

傅風(fēng)華，E-mail：fenghua@luye.cn；關(guān)勇彪，E-mail：guanyb@hotmail.com,Tel:(010)66931630

*共同第一作者。

*Co-first author.