腸三葉因子與Wnt/β-Catenin信號(hào)通路在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其與患者預(yù)后的關(guān)系

李鳳玉　呂　洋　劉　博　李秀娟　任君旭

(中國(guó)人民解放軍第251醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河北　張家口　075000)

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腸三葉因子與Wnt/β-Catenin信號(hào)通路在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其與患者預(yù)后的關(guān)系

李鳳玉呂洋1劉博2李秀娟1任君旭1

(中國(guó)人民解放軍第251醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河北張家口075000)

〔摘要〕目的研究腸三葉因子(ITF/TFF3)與Wnt/β-Catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況及其與患者臨床病理及預(yù)后的關(guān)系。方法采用SP 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)68例結(jié)直腸癌、21例結(jié)直腸腺瘤及11例正常結(jié)直腸黏膜組織中TFF3、Wnt1a、β-Catenin的表達(dá)變化；分析TFF3、Wnt1a、β-Catenin與結(jié)直腸癌患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系；應(yīng)用 Cox 單因素及多因素回歸分析探討它們?cè)诮Y(jié)腸癌組織中的表達(dá)與結(jié)腸癌患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果①TFF3、Wnt1a、β-Catenin在結(jié)直腸癌和腺瘤組織中均有表達(dá)，Wnt1a、β-Catenin在正常結(jié)直腸黏膜組織中則均呈陰性或弱陽(yáng)性表達(dá)，而TFF3呈陽(yáng)性表達(dá)，各標(biāo)記物在不同結(jié)直腸黏膜組織中的表達(dá)差異顯著(P均<0.05)；②Wnt1a、β-Catenin的表達(dá)均與患者的TNM分期相關(guān)，TNM分期越高的患者Wnt1a、β-Catenin的表達(dá)越強(qiáng)；β-Catenin與TFF3的表達(dá)則均與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者二標(biāo)記物的陽(yáng)性率高；Wnt1a、TFF3的表達(dá)還與患者的肝轉(zhuǎn)移情況相關(guān)，伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者Wnt1a、TFF3的陽(yáng)性率高；③Wnt1a、β-Catenin在結(jié)直腸癌的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.308)。β-Catenin在Wnt1a陽(yáng)性組中的表達(dá)(陽(yáng)性率92.6%)明顯高于在Wnt1a陰性組中的表達(dá)(陽(yáng)性率65.9%)(P=0.010)；④Cox 單因素法分析TFF3、Wnt1a、β-Catenin的表達(dá)對(duì)患者腫瘤死亡的影響，結(jié)果顯示，TFF3、Wnt1a可影響患者的腫瘤死亡(P均<0.05)，陽(yáng)性患者生存時(shí)間短，而β-Catenin的表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌患者腫瘤死亡無(wú)影響(P>0.05)。結(jié)論TFF3與Wnt/β-Catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后相關(guān)，可作為較為理想的腫瘤標(biāo)志物輔助判斷患者預(yù)后并指導(dǎo)臨床治療。

〔關(guān)鍵詞〕結(jié)直腸癌;腸三葉因子;Wnt/β-catenin;信號(hào)通路

1河北北方學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組胚教研室

2河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院病理科

第一作者：李鳳玉(1978-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤的病理研究及臨床治療研究。

在胚胎發(fā)育中起著重要作用的一些信號(hào)通路常常在腫瘤細(xì)胞中亦表現(xiàn)異常，其中以Wnt信號(hào)通路最為典型〔1〕。Wnt通路是由一系列癌基因和抑癌基因編碼的蛋白質(zhì)組成，其在調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育與腫瘤發(fā)生、發(fā)展等關(guān)鍵的生理、病理過(guò)程中起重要作用，而Wnt1a、β-Catenin均是Wnt信號(hào)通路的成員。腸三葉因子(ITF/TFF3)是三葉因子家族的成員之一，主要在小腸及結(jié)腸杯狀細(xì)胞、胃竇黏膜〔2〕中表達(dá)，在胃腸道炎癥、潰瘍及胃癌等疾病中呈異常表達(dá)。本研究檢測(cè)TFF3、Wnt1a、β-Catenin在結(jié)直腸癌、腺瘤和正常結(jié)直腸黏膜組織中的表達(dá)情況，探討TFF3與Wnt/β-Catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的相互作用及其與臨床、病理及預(yù)后的關(guān)系。

1材料和方法

1.1研究對(duì)象本研究為回顧性研究。采用隨機(jī)法從河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院病理科2008年1月1日至2009年12月31日手術(shù)切除原發(fā)性結(jié)直腸腺癌215例石蠟包埋標(biāo)本中選取68例，所有患者術(shù)前均未經(jīng)過(guò)任何治療且均有完整的臨床病理及隨訪資料。入選病例有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明確，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例要求送檢淋巴結(jié)數(shù)目≥12枚，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例至少有1枚淋巴結(jié)被病理證實(shí)有癌轉(zhuǎn)移。同時(shí)選取結(jié)直腸腺瘤石蠟標(biāo)本21例，距癌組織>5cm的正常黏膜組織共11例作為對(duì)照，對(duì)照標(biāo)本經(jīng)病理證實(shí)無(wú)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)明顯炎癥，無(wú)明顯細(xì)胞增生等病變。68例結(jié)直腸癌標(biāo)本中，男39例，女29例，年齡22～78歲，中位年齡56.0歲，平均年齡為54.6歲。腫瘤直徑≤5 cm 的36例(52.9%)，> 5 cm的32例(47.1%)；分化程度為高分化的16例(23.5%)，中分化28例(41.2%)，低分化24例(35.3%)；TNM分期為Ⅰ期5例(7.4%)，Ⅱ期21例(30.9%)，Ⅲ期27例(39.7%)；Ⅳ期15例(22.1%)。對(duì)68例結(jié)直腸癌患者全部進(jìn)行隨訪，隨訪方式采取門診復(fù)查、電話和信訪相結(jié)合。隨訪時(shí)間為1～63個(gè)月，其中59例獲訪，9例失訪。

1.2試劑及方法兔抗人Wnt1a多克隆抗體(工作濃度為1∶100)、鼠抗人β-catenin單克隆抗體(工作濃度為1∶200)、兔抗人TFF3多克隆抗體(工作濃度為1∶100)均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；S-P試劑盒、檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液、 PBS緩沖液、抗體稀釋液、DAB顯色劑均購(gòu)自石家莊勃盛化學(xué)試劑有限公司。按照S-P免疫組化檢測(cè)試劑盒中的操作方法并用高壓鍋抗原修復(fù)技術(shù)檢測(cè)TFF3、Wnt1a、β-Catenin在結(jié)直腸癌中的表達(dá)。PBS 緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3結(jié)果判斷TFF3蛋白、Wnt1a蛋白陽(yáng)性產(chǎn)物均主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。以出現(xiàn)灰黃色、金黃色或棕黃色顆粒記為陽(yáng)性細(xì)胞，依陽(yáng)性細(xì)胞占所觀察細(xì)胞的百分比及著色強(qiáng)度綜合計(jì)分〔3〕。由2位病理醫(yī)師分別雙盲閱片，隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比的平均數(shù)，按腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量記為0～3分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目為<10%為0分，10%～49%為1分，50%～74%為2分，≥75%為3分；著色強(qiáng)度記為0～3分，無(wú)色為0分，灰黃色為1分，金黃色為2分，棕黃色為3分；將兩項(xiàng)指標(biāo)的評(píng)分相加，根據(jù)總的分?jǐn)?shù)分為2級(jí)，0～2分為陰性，≥3分為陽(yáng)性。

β-Catenin 蛋白陽(yáng)性產(chǎn)物定位于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核，染色結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)參照Maruyama 等〔4〕的方法，>70% 的細(xì)胞其細(xì)胞膜染色陽(yáng)性為正常表達(dá)，反之為膜表達(dá)缺失；>10% 的細(xì)胞其細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核染色陽(yáng)性為細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá)；細(xì)胞膜表達(dá)缺失及細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá)統(tǒng)稱為異常表達(dá)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，壽命表法計(jì)算生存率，生存分析比較采用Kaplan-Meier法，預(yù)后因素分析采用Cox成比例危險(xiǎn)率模型。

2結(jié)果

2.1TFF3、Wnt1a、β-Catenin在不同結(jié)直腸黏膜組織中的表達(dá)與陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比，Wnt1a、β-Catenin在正常結(jié)直腸黏膜組織中多呈陰性表達(dá)，在腺瘤組織中表達(dá)增強(qiáng)，在結(jié)直腸癌中表達(dá)明顯(圖1，圖2)。TFF3在正常結(jié)直腸黏膜表達(dá)位于細(xì)胞質(zhì)中，在腺瘤組織中表達(dá)下降，而在結(jié)直腸腺癌中表達(dá)又有所增高(圖3)。TFF3、Wnt1a、β-Catenin在結(jié)直腸癌的陽(yáng)性率分別為69.1%(47/68)、39.7%(27/68)和76.5%(52/68)，在結(jié)直腸腺瘤的陽(yáng)性率分別為47.6%(10/21)、23.8%(5/21)和19.0(4/21)，在正常結(jié)直腸黏膜組織中的陽(yáng)性率為90.9%(10/11)，9.1%(1/11)和0%(0/11)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，TFF3、Wnt1a、β-Catenin在結(jié)直腸腺癌、結(jié)直腸腺瘤及正常結(jié)直腸黏膜組織中的表達(dá)均具有顯著差異(χ2為6.550，15.704和42.563，P均<0.05)。

2.2TFF3、Wnt1a、β-Catenin的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系Wnt1a、β-Catenin的表達(dá)均與患者的TNM分期相關(guān)，TNM分期越高的患者Wnt1a、β-Catenin的表達(dá)越強(qiáng)；β-Catenin與TFF3的表達(dá)則均與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者二標(biāo)記物的陽(yáng)性率高；Wnt1a、TFF3的表達(dá)還與患者的肝轉(zhuǎn)移情況相關(guān)，伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者Wnt1a、TFF3的陽(yáng)性率高(P均<0.05)。而TFF3、Wnt1a、β-Catenin的陽(yáng)性表達(dá)與患者的性別、年齡、腫瘤大小、大體類型、病理類型及分化程度等均不相關(guān)(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

2.3TFF3、Wnt1a、β-Catenin在結(jié)直腸癌表達(dá)的相互關(guān)系Wnt1a、β-Catenin在結(jié)直腸癌的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.308)。β-Catenin在Wnt1a陽(yáng)性組中的表達(dá)(陽(yáng)性率92.6%)明顯高于在Wnt1a陰性組中的表達(dá)(陽(yáng)性率65.9%)(P=0.010)。而 TFF3、Wnt1a以及TFF3、β-Catenin在結(jié)直腸癌的表達(dá)則均不相關(guān)(P均>0.05)。

2.4TFF3、Wnt1a、β-Catenin的表達(dá)與患者腫瘤死亡單因素分析以死亡時(shí)間及死亡結(jié)局為應(yīng)變量，各因子表達(dá)為自變量，Cox 單因素法分析TFF3、Wnt1a、β-Catenin的表達(dá)對(duì)患者腫瘤死亡的影響，結(jié)果顯示，TFF3、Wnt1a可影響患者的腫瘤死亡(P均<0.05)，陽(yáng)性患者生存時(shí)間短，而β-Catenin的表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌患者腫瘤死亡無(wú)影響(P=0.073)。見(jiàn)表2。

結(jié)直腸腺癌(×100)

結(jié)直腸腺瘤(×200)

正常結(jié)直腸黏膜(×200)

結(jié)直腸腺癌(×100)

結(jié)直腸腺瘤(×100)

正常結(jié)直腸黏膜(×100)

正常結(jié)直腸黏膜(×200)

結(jié)直腸腺瘤(×200)

結(jié)直腸腺癌(×100)

nWnt1a陰性陽(yáng)性P值β-Catenin陰性陽(yáng)性P值TFF3陰性陽(yáng)性P值男/女39/2927/1412/150.0818/831/210.49612/927/200.981年齡分布≤30歲4310.804130.996130.22030～60歲3823159291523>60歲261511620521腫瘤大小分布(n)T≤5cm3621150.92811250.28010260.375510cm3120321大體類型(n)隆起型11470.230470.693290.527潰瘍型4027138321525浸潤(rùn)型7522525其他10552828病理類型(n)管狀腺癌4829190.9009390.30917310.443黏液腺癌16106610313其他4221313分化程度高/中/低16/28/2411/19/115/9/130.1986/6/410/22/200.2967/9/59/19/190.302TNM分期Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ5/21/27/154/15/18/41/6/9/110.0243/8/5/02/13/22/150.0113/9/8/12/12/19/140.057淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有/無(wú)42/2622/1920/70.0905/1137/150.0049/1233/140.032肝轉(zhuǎn)移情況有/無(wú)20/488/3312/150.0272/1418/340.0902/1918/290.016

表2　Cox 單因素分析各因子的表達(dá)與

3討論

TFF3主要是由杯狀細(xì)胞分泌的特異分布于腸黏膜表面的多肽物質(zhì)，在腸道內(nèi)相當(dāng)豐富。本研究結(jié)果印證了TFF3的這一特性。研究發(fā)現(xiàn)，TFF3在乳腺癌〔5〕、前列腺癌〔6〕、胃癌〔7〕、甲狀腺癌〔8〕等均有異常表達(dá)，且TFF3表現(xiàn)為抑癌基因和潛在促進(jìn)腫瘤發(fā)展的因素〔5〕。TFF3在結(jié)腸腺瘤性息肉中表達(dá)明顯降低，在腺瘤中表達(dá)量和正常黏膜基本相同，而在黏液癌和腺癌中呈高表達(dá)〔9〕。本研究結(jié)果顯示，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或肝轉(zhuǎn)移的患者其表達(dá)增強(qiáng)，隨訪結(jié)果顯示，TFF3還可影響患者的腫瘤死亡，陽(yáng)性患者生存時(shí)間短，均說(shuō)明TFF3參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后。

Wnt/β-Catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是一類重要的傳導(dǎo)生長(zhǎng)刺激信號(hào)的通路，通過(guò)Wnt蛋白結(jié)合到特異受體卷曲蛋白的表面受體，然后激活GSK3信號(hào)通路，導(dǎo)致GSK3與β-Catenin結(jié)合，阻礙β-Catenin降解，從而激發(fā)細(xì)胞增殖信號(hào)通路。 Wnt/β-Catenin信號(hào)通路無(wú)論是在胚胎發(fā)育還是在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等過(guò)程中均起著重要作用〔10〕。 研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌胞質(zhì)內(nèi)β-Catenin的增加和可能存在血行轉(zhuǎn)移有一定關(guān)系，β-Catenin的過(guò)表達(dá)與腫瘤的浸潤(rùn)深度及局部去分化有關(guān)〔4〕。本研究結(jié)果顯示，Wnt/β-Catenin信號(hào)通路參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展并與患者預(yù)后相關(guān)，這與朱月琴等〔11〕的結(jié)果一致。

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〔2013-12-29修回〕

(編輯曹夢(mèng)園)

〔中圖分類號(hào)〕R735.3

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2015)22-6441-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.060