八棱海棠莖段的組織培養(yǎng)*

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八棱海棠莖段的組織培養(yǎng)*

鄭志新1，張小紅1,李艷麗1,霍書新1,張麗娟2

(1.河北北方學院 園藝系，河北張家口075131；2.承德市平泉縣農(nóng)牧局，河北承德067500)

摘要：為了建立八棱海棠的組織培養(yǎng)快繁體系，以八棱海棠單芽莖段為外植體，以MS為基本培養(yǎng)基進行組織培養(yǎng)研究。結果表明，5月為單芽莖段外植體獲取的最佳時間，此時污染率低，死亡率低；最佳叢生芽誘導培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，誘導率為53.2 %； MS+6-BA 2.0 mg/L +NAA 0.2 mg/L為最佳增殖培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)2周，增殖系數(shù)為4.73；生根培養(yǎng)以1/2 MS+IBA 0.3 mg/L+NAA 0.2 mg/L較好，平均根長為5.2 cm，生根率為90.0 %。

關鍵詞：八棱海棠；單芽莖段；組織培養(yǎng)；暗培養(yǎng)

八棱海棠(Malusrobusta)又名懷來海棠，屬薔薇科蘋果屬，西府海棠種。落葉喬木，樹冠開張，樹高可達5～7 m，為蘋果的常用砧木。八棱海棠花5～12朵簇生，單個花體直徑2～2.5 cm，4月份開花，剛出的花骨朵呈紅色，慢慢地開展由紅色變粉紅色，漸漸地再由粉紅色變?yōu)榉郯咨?，樹上花朵密密層層，十分壯觀；八棱海棠自花授粉，坐果率極高，充分成熟后，色澤鮮紅奪目，紅里透紫，觀賞效果極佳。

八棱海棠一直采用實生繁殖，后代常發(fā)生變異，有眾多的具較強抗性或觀賞性的優(yōu)良單株急需篩選、培養(yǎng)，加速繁殖。組織培養(yǎng)技術可迅速建立無性繁殖體系，周年育苗，規(guī)模大、周期短，不受季節(jié)的限制，為優(yōu)良單株的快速繁殖提供了一條高效途徑[1]。迄今，八棱海棠主要作為蘋果屬植物的砧木存在，對其研究也主要集中在種子處理及嫁接育苗上[2～3]。李文然[4]、孫愛軍[5]等都對八棱海棠的組織培養(yǎng)進行過相關的研究，但都沒有形成完整的體系。因此研究八棱海棠組培快繁技術，對八棱海棠選優(yōu)、利用和發(fā)展有深遠的意義。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試材料為6年生八棱海棠實生苗的1年生枝條。將枝條切成5 cm莖段，流水沖洗2 h，在超凈工作臺上用75 %乙醇浸30 s，放入0.1 %升汞(HgCl2)溶液中，浸8-12 min，傾去升汞液，用無菌水沖洗5～6次，切成1～1.5 cm長的單芽莖段接種到誘導培養(yǎng)基上。培養(yǎng)室光強為2 000 Lx，光照16 h/d，溫度23±2℃。

1.2研究方法

取材時間的篩選分別于5月、6月、7月、8月和9月采集八棱海棠枝條，接種在誘導培養(yǎng)基上，調(diào)查污染率和死亡率，篩選八棱海棠單芽莖段組培適宜的外植體采集時間。

誘導培養(yǎng)誘導培養(yǎng)以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-BA(0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L)和NAA(0.1 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L)。每瓶接種3莖段，每處理接種10瓶，30天后統(tǒng)計各處理的芽誘導率。

增殖培養(yǎng)將誘導培養(yǎng)的幼芽接種在增殖培養(yǎng)基中，每瓶接種幼芽3個，每處理10瓶。增殖培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，處理A、B、C添加不同濃度的6-BA(1.0 mg/L、1.5 mg/L、2.0 mg/L)，NAA濃度為0.2 mg/L；處理D(6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L)為轉接后暗培養(yǎng)2周，然后正常光照培養(yǎng)，統(tǒng)計各處理芽的平均高度、增殖系數(shù)。

生根培養(yǎng)選取2～3 mm長的芽接種于生根培養(yǎng)基中，生根培養(yǎng)基選用1/2 MS培養(yǎng)基，蔗糖濃度為2.0 %，分別附加不同濃度的IBA(0 mg/L、0.3 mg/L)和NAA(0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L)。每瓶接種3塊，每處理接種10瓶。30天后統(tǒng)計各處理的平均根長和生根率。

2結果與分析

2.1取材時間的篩選

分別在5月、6月、7月、8月和9月采集八棱海棠新梢的單芽莖段進行誘導培養(yǎng)，隨著枝條木質(zhì)化程度增加，外植體上可能攜帶污染物也增加，HgCL2處理時間也隨之增加。接種30天后污染率和死亡率結果見表1。

表1　不同取材時間外植體污染率和死亡率比較

注：污染率=污染的外植體塊數(shù)∕接種外植體塊數(shù)×100%,死亡率=死亡的外植體塊數(shù)∕(接種外植體塊數(shù)-污染外植體塊數(shù))×100%。

由表1可知，死亡率最高的是9月采集的外植體(HgCl2處理12 min)，死亡率達100 %；污染率最高的是8月采集的外植體(HgCl2處理10 min)，污染率為27.8 %，其次是7月采集的外植體(HgCl2處理10 min)，污染率為26.6 %，這可能是外植體所攜帶的病菌增多而滅菌時間相對較短導致的。最佳外植體采集時間是5月(HgCl2處理8 min)，污染率和死亡率都最低，分別為13.3 %和7.6 %。八棱海棠外植體接種后培養(yǎng)基很快變褐色(圖1)，轉接1次后，未出現(xiàn)褐化現(xiàn)象(圖2)。6月和9月接種的外植體褐化嚴重，7-8月的褐化現(xiàn)象相對較輕，而5月培養(yǎng)的八棱海棠外植體褐化現(xiàn)象不明顯。

圖1　外植體褐化現(xiàn)象明顯

2.26-BA和NAA濃度對叢生芽誘導培養(yǎng)的影響

將沒有污染和死亡的八棱海棠單芽莖段轉接到誘導培養(yǎng)基上進行誘導培養(yǎng)，所設培養(yǎng)基及誘導結果見表2。由表2可知，6-BA濃度一定時，隨著生長素濃度的增大，芽誘導率下降，當NAA濃度達到1.0 mg/L時，沒有芽被誘導出來，但有大量愈傷組織形成(圖2)，可見高濃度生長素對八棱海棠的芽誘導起到了抑制作用，而對愈傷組織的誘導具有一定促進作用。細胞分裂素6-BA為1.0 mg/L，NAA為1.0 mg/L時，芽誘導效果最好，達到了53.2 %(D處理，圖3)，隨著6-BA濃度升高，芽誘導效果開始下降。叢生芽誘導培養(yǎng)結果表明，最適宜的八棱海棠叢生芽誘導培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。

表2　6-BA和NAA濃度對叢生芽誘導培養(yǎng)的影響

注：芽誘導率=(出芽外植體塊數(shù)/接種外植體總塊數(shù))×100%。

圖2　高濃度生長素形成的愈傷組織

圖3　低濃度生長素誘導形成的不定芽

2.36-BA濃度和暗培養(yǎng)對增殖培養(yǎng)的影響

提高生長素濃度(NAA 0.2 mg/L)進行增殖培養(yǎng),40天后統(tǒng)計結果(表3)。由表3可知，處理A的增殖系數(shù)最低，只有1.84，但是平均芽高卻達到了3.41 cm，處理D的增殖系數(shù)為4.73，平均芽高3.21 cm，與處理B、C之間存在顯著性差異。處理B、C二者之間的平均芽高和增殖系數(shù)之間均無顯著性差異，但其增殖系數(shù)均與處理A之間存在顯著性差異，其平均芽高顯著低于處理A，而增殖系數(shù)顯著優(yōu)于處理A。試驗結果表明，暗培養(yǎng)2周后，有大量愈傷組織出現(xiàn)，轉正常光照培養(yǎng)后，大量叢生芽出現(xiàn)(圖4)，說明一段時間的暗培養(yǎng)對于八棱海棠愈傷組織的增殖和叢生芽的誘導是極為有利的。

表3　6-BA濃度對增殖培養(yǎng)的影響

注：鄧肯氏新復極差測驗，表中同列數(shù)值后標記不同字母表示差異達0.05顯著水平。

圖4　暗培養(yǎng)轉光照培養(yǎng)后出現(xiàn)大量叢生芽

2.4生根培養(yǎng)

以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的生長素對八棱海棠叢生芽進行生根誘導。20天以后，開始在芽基部出現(xiàn)白色輻射狀不定根，30天后統(tǒng)計生根及根系生長情況(表4)。

表4　生長素種類和濃度對生根培養(yǎng)的影響

由表4可知，各處理之間的平均根長為4.2～6.6 cm，以處理4為最長，達到6.6 cm，處理3最短，為4.2 cm。處理1的生根率最低，為66.6 %，處理5的生根率最高，達到了90.0 %，可見八棱海棠叢生芽生根培養(yǎng)時，單一生長素生根效果較混合生長素生根效果相對較差，其中1/2 MS+IBA 0.3 mg/L+NAA 0.2 mg/L為八棱海棠較適宜的生根培養(yǎng)基。

3結論與討論

3.1結論

八棱海棠外植體的最佳獲得時間為5月(HgCL2消毒8 min)，此時新芽萌發(fā)，細胞分裂旺盛，所攜帶的污染物相對較少，處理相對容易。一定濃度的生長素和細胞分裂素對于八棱海棠的芽誘導有著明顯的促進作用，以MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L效果最佳，誘導率達到53.2 %。暗培養(yǎng)對于愈傷組織增殖和叢生芽誘導有明顯促進作用。生長素對于八棱海棠叢生芽的生根有著明顯的促進作用，組合生長素的促進作用優(yōu)于單一生長素，以1/2 MS+IBA 0.3 mg/L+NAA 0.2 mg/L效果最佳。

3.2討論

八棱海棠外植體接種后培養(yǎng)基很快變褐色，轉接1次后，未出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，6月和9月接種的外植體褐化現(xiàn)象嚴重，這與張慶田等研究結果相同[6]。張慶田等認為植物組織培養(yǎng)過程中，外植體的褐變程度受取材時期、外植體類型和消毒時間影響，隨著滅菌時間的延長，所受藥害越重，褐變死亡率增加，而存活率降低。

陳宗禮等認為植物芽的誘導取決于內(nèi)源激素的平衡，外源生長調(diào)節(jié)劑通過改變內(nèi)源激素的平衡而產(chǎn)生作用，外加的細胞分裂素及生長素要求達到一定的濃度和比例，才使器官發(fā)生達到預期目的[7]。孫愛君等研究發(fā)現(xiàn)，新喬納金(Malusdomestica)的葉片再生頻率均以6-BA/NAA的比值為20或10時最高[5]。本項試驗結果表明，當NAA濃度達到1.0 mg/L時，6-BA濃度無論為0.5 mg/L、1.0 mg/L或是1.5 mg/L，接種的外植體均不能誘導形成叢生芽，但形成大量愈傷組織；而當6-BA為1.0 mg/L、NAA為0.1 mg/L時，即當6-BA/NAA的比值為10時，八棱海棠外植體的叢生芽誘導率最高(53.2 %)，說明生長素與細胞分裂素之間的比例對叢生芽的誘導具有顯著的影響。

師校欣等研究表明，在繼代增殖階段，一段時間黑暗培養(yǎng)可使試管苗生長加快、節(jié)間伸長、葉片增長受抑，從而增加有效新梢數(shù)量，增加繁殖效率，并且，暗培養(yǎng)時間因品種不同而有所不同[8]。本試驗中，暗培養(yǎng)2周，增殖系數(shù)由1.84提高至4.73，但不同的黑暗培養(yǎng)時間對八棱海棠增殖系數(shù)影響有待進一步研究。

生長素的種類和濃度影響組培苗根系的誘導和生長。古西府海棠(Malusmicromalus)不定根最適誘導培養(yǎng)基為1/2 MS+IBA 0.6 mg/L，生根率為100 %[9]。日本圓葉海棠(M.prunifoliavar.ringo)生根的適宜培養(yǎng)基為1/ MS+ IAA 0.5 mg/L，生根率達93.3 %，而1/2 MS + NAA 0.5 mg/L，生根率僅為50.0 %。本項研究中，1/2 MS+IBA 0.3mg/L+NAA 0.2 mg/L為八棱海棠較適宜的生根培養(yǎng)基，生根率達90.0 %，其中混合生長素效果優(yōu)于單一生長素效果，其具體作用機理還有待于進一步研究。

本試驗研究的八棱海棠叢生芽誘導、增殖及生根培養(yǎng)所涉及的培養(yǎng)基配方僅在MS基本培養(yǎng)基添加不同濃度的6-BA和NAA、IBA，而其他種類和濃度的生長素和細胞分裂素、其他種類的基本培養(yǎng)基對于八棱海棠莖段組織培養(yǎng)再生體系建立的影響和作用，還需進行更加深入的研究。

參考文獻：

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Tissue Culture of Malus robusta Stalk Segment

ZHENG Zhi-xin1,ZHANG Xiao-hong1,LI Yan-li1,HUO Shu-xin1,Zhang Li-juan2

(1.Department of Horticulture， Hebei North University，Zhangjiakou Hebei 075131,P.R.China;

2.Pingquan Agriculture and Animal Husbandry Bureau of Chengde，Chengde Hebei 067500,P.R.China)

Abstract:In order to establish tissue culture rapid propagation for Malus robusta,relevant study was made by taking single-bud stalk segment as explant,and MS as the basic medium.The result shows that the May is the best time for obtaining explant,and both contamination rate and death rate are lowest at that time.MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1mg/L is the best culture medium for inducing,and the rate is 53.2 %.MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L is the best culture medium for multiplication,and the coefficient is 4.73 with two weeks dark culture.1/2 MS+IBA 0.3 mg/L+NAA 0.2 mg/L is appriopriate for rooting culture ,and the average root length is 5.2 cm,while rooting rate is 90.0 %.

Key words:Malus robusta；single-bud stalk segment；tissue culture；dark culture

中圖分類號：S 685.99

文獻標識碼：A

文章編號：1672-8246(2015)06-0038-04

作者簡介：第一鄭志新(1980-)，講師，主要從事園林樹木栽培及相關生物技術研究。E-mail：zjkzzxin@126.com

基金項目：張家口市科學技術研究與發(fā)展項目(1021019C)。

收稿日期：*2015-05-26

doi10.16473/j.cnki.xblykx1972.2015.06.008