秋、冬季刺參養(yǎng)殖池塘菌群的多樣性分析

竇妍，丁君， 曲凌云，劉志敏，王軼南，穆曉虎，常亞青

(1.大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧 大連 116023；2.國家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島 266061)

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秋、冬季刺參養(yǎng)殖池塘菌群的多樣性分析

竇妍1，丁君1， 曲凌云2，劉志敏1，王軼南1，穆曉虎1，常亞青1

(1.大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧 大連 116023；2.國家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島 266061)

摘要:以黃海和渤海代表性刺參養(yǎng)殖池塘秋、冬季海水和沉積物基因組DNA為模板，以細菌16S rDNA通用引物進行PCR擴增，構(gòu)建16S rDNA文庫并進行測序分析，研究了秋、冬季刺參養(yǎng)殖池塘菌群的多樣性。結(jié)果表明：海水和沉積物中主要包括11個門類的細菌，即變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、厚壁菌門(Firmicutes)、梭桿菌門(Fusobacteria)、藍細菌門(Cyanobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)、脫鐵桿菌門(Deferribacteres)、綠彎菌門(Chloroflexi)；黃海和渤海刺參養(yǎng)殖池塘海水和沉積物中優(yōu)勢類群均為變形菌(變形菌比例>48%)；用Shannon指數(shù)及Simpson優(yōu)勢度指數(shù)分析細菌的多樣性，黃、渤海刺參養(yǎng)殖池塘中，冬季沉積物細菌Simpson優(yōu)勢度指數(shù)均最低，分別為0.014 89和0.016 50，Shannon指數(shù)均最高，分別為6.312和5.695。研究表明，黃海和渤海刺參養(yǎng)殖池塘中，冬季沉積物細菌多樣性均最高。

關(guān)鍵詞:刺參；養(yǎng)殖池塘；16S rDNA；變形菌門

自20世紀80年代中國刺參人工育苗技術(shù)取得成功后，刺參的增養(yǎng)殖在北方沿海逐漸實現(xiàn)規(guī)?；痆1-3]。然而，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，刺參病害也日益增加。良好的環(huán)境是刺參健康生長的必備條件，而養(yǎng)殖池塘生物群落的重要組成部分——水體及沉積物中的微生物，可以作為衡量環(huán)境優(yōu)劣的指標[4]。因此，考察養(yǎng)殖環(huán)境中細菌的多樣性，可以為微生物生態(tài)變化與刺參病害發(fā)生的關(guān)系提供一定的科學(xué)依據(jù)[5]。

環(huán)境中可培養(yǎng)細菌的多樣性占微生物總數(shù)的量極低，基于培養(yǎng)的研究方面很難全面了解環(huán)境微生物的多樣性[6]。隨著DNA測序技術(shù)的發(fā)展，以環(huán)境總DNA為模板進行微生物群落組成和多樣性的研究，已成為分析微生物多樣性的一種有效手段[7-9]。目前，有關(guān)刺參及養(yǎng)殖環(huán)境微生物方面的研究已經(jīng)逐漸開展。李彬等[10]運用傳統(tǒng)細菌分離培養(yǎng)與分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的方法研究了冬季刺參養(yǎng)殖環(huán)境及其腸道內(nèi)的細菌菌群。關(guān)曉燕等[5]采用16S rDNA的PCR-DGGE基因指紋技術(shù)研究了不同鹽度的仿刺參養(yǎng)殖水環(huán)境中的菌群多樣性。張文姬等[11]利用16S rDNA-RFLP法分析了大連地區(qū)仿刺參腸道可培養(yǎng)微生物的多樣性。

本研究中，采用16S rDNA文庫法，通過系統(tǒng)發(fā)育分析和多樣性分析，對黃、渤海刺參養(yǎng)殖池塘海水和沉積物的菌群結(jié)構(gòu)及多樣性進行了研究，并分析了其中潛在的條件致病菌，旨在了解黃、渤海刺參養(yǎng)殖池塘細菌群落結(jié)構(gòu)，為構(gòu)建中國北方刺參養(yǎng)殖池塘菌庫奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

黃海秋、冬季刺參養(yǎng)殖池塘沉積物和海水樣品于2011年11月和2012年2月采集自大連力源水產(chǎn)有限公司養(yǎng)殖池塘，渤海秋、冬季刺參養(yǎng)殖池塘沉積物和海水樣品自2011年11月和2012年2月采集自興城菊花島海產(chǎn)品有限公司養(yǎng)殖池塘。2個池塘均為泥沙底，用無菌瓶分別取刺參養(yǎng)殖池塘水面下40 cm左右處海水500 mL和池底5 cm左右處沉積物100 g。將采集的樣品置于冰盒中運回至大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室。黃海秋、冬季海水和沉積物樣品，分別標記為YAW、YAS、YWW、YWS，渤海秋、冬季海水和沉積物樣品，分別標記為BAW、BAS、BWW、BWS。

1.2方法

1.2.1DNA提取海水和沉積物樣品的DNA提取參照王軼南等[12]的方法。

1.2.216S rDNA基因片段克隆文庫的構(gòu)建采用16S rDNA通用引物27F(5′ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′)和1492R(5′ GGTTACCTTGTTACGA-CTT 3′)擴增16S rDNA全長序列。PCR反應(yīng)體系(共25 μL)：MasterMix 12.5 μL、上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O 9.5 μL，模板 1 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃下預(yù)變性2 min；94 ℃下變性30 s，52 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸90 s，共進行30個循環(huán)；最后在72 ℃下延伸10 min，用10 g/L瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物經(jīng)割膠純化連接到pMD19-T載體，于16 ℃下連接30 min后將連接產(chǎn)物注入感受態(tài)細胞中，在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 h后，涂布于含有X-gal、IPTG和Amp的LB培養(yǎng)基上。從各文庫中隨機挑選100個左右的陽性克隆子送上海英俊生物技術(shù)有限公司進行測序。

1.2.3細菌16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育分析用VecScreen程序去除載體序列，用Mallard 1.02軟件進行嵌合體檢驗。應(yīng)用Mothur 1.31.2軟件[13]對所得有效序列進行分析，以97%相似性為標準，劃分操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)，將每個OUT中的代表序列利用GenBank數(shù)據(jù)庫中的Blast程序進行相似性比對，并挑選相近序列。采用Neighbor-joining法[14]，應(yīng)用Mega 5.22軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展值設(shè)為1000[15]。

1.2.4多樣性分析基于OTU豐度，用SPADE[16]軟件計算8個克隆文庫的覆蓋率(coverage)、香農(nóng)指數(shù)(Shannon index)和辛普森指數(shù)(Simpson index)。

2結(jié)果與分析

2.116S rDNA文庫的多樣性分析

根據(jù)OTU豐度，采用SPADE 軟件計算得到8個克隆文庫的覆蓋率、香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)分別為10.9%~92.0%、1.508~6.312、0.014 89~0.406 22(表1)。利用Shannon指數(shù)及Simpson優(yōu)勢度指數(shù)分析細菌的多樣性，結(jié)果表明：黃海刺參養(yǎng)殖池塘中，冬季沉積物細菌Simpson優(yōu)勢度指數(shù)(0.014 89)最低，且Shannon指數(shù)(6.312)最高，表明黃海刺參養(yǎng)殖池塘冬季沉積物細菌多樣性最高；渤海刺參養(yǎng)殖池塘中，冬季沉積物細菌Simpson優(yōu)勢度指數(shù)(0.016 50)最低，且Shannon指數(shù)(5.695)最高，表明渤海養(yǎng)殖池塘也是冬季沉積物細菌多樣性最高。

表1黃、渤海刺參養(yǎng)殖池塘秋、冬季海水和沉積物細菌的多樣性

Tab.1 Bacterial diversity in the seawater and sediments of the sea cucumberApostichopusjaponicusculture ponds from Yellow Sea and Bohai Sea in autumn and winter

樣品sample克隆子clone分類單元數(shù)numberofOTUs覆蓋率/%coverage香濃指數(shù)Shannonsindex辛普森指數(shù)SimpsonindexYAW832388.02.9210.08869YWW772780.53.1070.09732YAS646010.96.2800.01807YWS767113.26.3120.01489BAW692775.43.1580.10145BWW812277.82.4350.24737BAS751092.01.5080.40622BWS796922.85.6950.01650

2.2刺參養(yǎng)殖池塘的菌群結(jié)構(gòu)分析

對測序片段去除嵌合體序列后，所有8個文庫共得到604個有效序列，其中黃海刺參養(yǎng)殖池塘秋、冬季海水和沉積物樣品有效克隆序列分別為83、64、77、76，渤海刺參養(yǎng)殖池塘秋、冬季海水和沉積物樣品有效克隆序列分別為69、75、81、79(表1)。將相似性大于97%的序列歸為一個OUT后，將每個OUT中代表序列利用GenBank數(shù)據(jù)庫中的Blast程序進行相似性比對，并挑選與之相近序列(相似性為84%~100%)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。由于數(shù)據(jù)量較大，本研究中隨機挑選每個門類的一條克隆序列及其與數(shù)據(jù)庫中相似性較高的序列進行發(fā)育樹構(gòu)建，結(jié)果如圖1所示。

黃、渤海刺參養(yǎng)殖池塘菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果見表2，黃、渤海刺參養(yǎng)殖池塘海水和沉積物樣品中16S rDNA序列共分11個門類，即變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、厚壁菌門(Firmicutes)、梭桿菌門(Fusobacteria)、藍細菌門(Cyanobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)、脫鐵桿菌門黃海養(yǎng)殖池塘秋季海水樣品中16S rDNA序列分為4個門類，變形菌門為優(yōu)勢類群(占48.1%)，其次為藍細菌門(38.6%)、擬桿菌門(9.6%)、放線菌門(3.6%)；在變形菌所含亞門(α-、β-、γ-)中，α-變形菌為優(yōu)勢亞門。冬季海水樣品中16S rDNA序列分為3個門類，變形菌門為優(yōu)勢類群(92.2%)，其次為放線菌門(3.9%)、擬桿菌門(2.6%)；在變形菌門所含亞門(α-、β-、γ-、δ-)中，α-變形菌為優(yōu)勢亞門(58.4%)；部分序列(1.3%)未能確定其分類地位。結(jié)果顯示，黃海養(yǎng)殖池塘秋、冬季海水菌群結(jié)構(gòu)差別不大，優(yōu)勢菌群均為變形菌門，在變形菌門中優(yōu)勢亞門均為α-變形菌。

表2黃海和渤海秋、冬季刺參養(yǎng)殖池塘海水和沉積物的菌群結(jié)構(gòu)

Tab.2Community structure of bacteria in the seawater and sediments of the sea cucumberApostichopusjaponicusculture ponds from Yellow Sea and Bohai Sea in autumn and winter

%

注：“—”代表未發(fā)現(xiàn)

Note:“—” represents not found(Deferribacteres)、綠彎菌門(Chloroflexi)。其中，變形菌門占優(yōu)勢(>48%)，在變形菌門所含亞門(α-、β-、γ-、δ-、ε-、ζ-)中，γ-變形菌為優(yōu)勢類群；另有部分序列分類地位尚未明確。

黃海養(yǎng)殖池塘秋季沉積物樣品中16S rDNA序列除部分(3.1%)未能確定其分類地位外，其余序列分為6個門類，變形菌門為優(yōu)勢類群(76.6%)，其次為擬桿菌門(10.9%)、酸桿菌門(3.1%)、藍細菌門(3.1%)、疣微菌門(1.6%)、浮霉菌門(1.6%)；在變形菌門所含亞門(β-、γ-、δ-、ε-、ζ-)中，δ-變形菌為優(yōu)勢亞門。冬季沉積物樣品中除部分序列(2.6%)未能確定其分類地位外，其余序列分為7個門類，優(yōu)勢類群為變形菌門(72.4%)，其次為擬桿菌門(6.6%)、藍細菌門(6.6%)、浮霉菌門(5.3%)、酸桿菌門(2.6%)、疣微菌門(2.6%)、梭桿菌門(1.3%)；在變形菌門所含亞門(α-、β-、γ-、δ-、ε-)中，γ-變形菌(23.7%)、δ-變形菌(23.7%)為優(yōu)勢類群。結(jié)果顯示，黃海養(yǎng)殖池塘秋、冬季沉積物菌群結(jié)構(gòu)相差不大，優(yōu)勢菌群門均為變形菌，在變形菌亞門中γ-變形菌、δ-變形菌較為優(yōu)勢。

渤海養(yǎng)殖池塘秋季海水16S rDNA序列可分為4個門類，變形菌門為優(yōu)勢類群(84.1%)，其次為藍細菌門(13.0%)、放線菌門(1.4%)、擬桿菌門(1.4%)；在變形菌門所含亞門(α-、β-、γ-)中，γ-變形菌為優(yōu)勢亞門。渤海養(yǎng)殖池塘冬季海水16S rDNA序列可分為5個門類，變形菌門(90.0%)為優(yōu)勢類群，其次為放線菌門(4.9%)、擬桿菌門(2.5%)、厚壁菌門(Firmicutes)(1.2%)、藍細菌門(1.2%)；在變形菌所含亞門(α-、β-、γ-)中，α-變形菌為優(yōu)勢亞門；其中，單克隆子BWW13與GenBank中的燦爛弧菌Vibriosplendidus(EU091328.1)相似性達99%。結(jié)果顯示，渤海養(yǎng)殖池塘秋、冬季海水菌群結(jié)構(gòu)差別不大，均以變形菌門為優(yōu)勢類群，但在秋季海水中的優(yōu)勢亞門為γ-變形菌，而冬季海水中的優(yōu)勢亞門為α-變形菌。

圖1　黃、渤海刺參養(yǎng)殖池塘秋、冬季海水和沉積物細菌16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1　Phylogenetic tree of bacterial 16S rDNA sequences from the seawater and sediments of the sea cucumber Apostichopus japonicus culture ponds from Yellow Sea and Bohai Sea in autumn and winter

渤海養(yǎng)殖池塘秋季沉積物16S rDNA序列均為變形菌門；在變形菌門所含的4個亞門(α-、β-、γ-、δ-)中，γ-變形菌為優(yōu)勢亞門；其中，單克隆子BAS12與GenBank中的哈維氏弧菌Vibrioharveyi(HM008702.1)相似性達99%。渤海養(yǎng)殖池塘冬季沉積物16S rDNA序列除部分(1.3%)未能確定其分類地位外，其余可分為9門類，變形菌門占優(yōu)勢(75.9%)，其次為酸桿菌門(8.9%)、擬桿菌門(3.8%)、疣微菌門(2.5%)、浮霉菌門(2.5%)、厚壁菌門(1.3%)、梭桿菌門(1.3%)、脫鐵桿菌門(1.3%)、綠彎菌門(1.3%)；在變形菌門所含亞門(α-、γ-、δ-、ε-、ζ-)中，γ-變形菌(43.0%)為優(yōu)勢亞門。結(jié)果顯示，渤海養(yǎng)殖池塘秋、冬季沉積物菌群結(jié)構(gòu)變化較大，優(yōu)勢菌均為變形菌門，優(yōu)勢亞門均為γ-變形菌。

3討論

3.1刺參養(yǎng)殖池塘秋、冬季海水和沉積物細菌的多樣性

本研中究發(fā)現(xiàn)，黃、渤海刺參養(yǎng)殖池塘海水和沉積物樣品中16S rDNA序列的8個克隆文庫覆蓋率為10.9%~92.0%。利用Shannon指數(shù)及Simpson優(yōu)勢度指數(shù)分析細菌的多樣性，黃、渤海刺參養(yǎng)殖池塘秋、冬季海水和沉積物中，皆以冬季沉積物細菌多樣性最高。

關(guān)曉燕等[5]在研究不同鹽度仿刺參養(yǎng)殖水環(huán)境中的菌群多樣性時發(fā)現(xiàn)，其中所含的優(yōu)勢菌有變形菌門；白潔等[17]在研究黃海北部不同站位海洋細菌群落分布特征時發(fā)現(xiàn)，各站位中優(yōu)勢菌為變形菌門。黃海和渤海刺參養(yǎng)殖池塘海水中的優(yōu)勢菌群均為變形菌門，本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致。在變形菌門的4個亞門(α-、β-、γ-、δ-)中，黃海秋、冬季海水及渤海冬季海水均以α-變形菌亞門較為優(yōu)勢，這與González等[18]的研究結(jié)果一致；渤海刺參養(yǎng)殖池塘秋季和冬季海水中略有不同，秋季海水中γ-變形菌為優(yōu)勢亞門，α-變形菌為次優(yōu)勢亞門，而冬季海水中α-變形菌為優(yōu)勢亞門，γ-變形菌為次優(yōu)勢亞門?？傮w而言，黃海和渤海刺參養(yǎng)殖池塘海水中菌群結(jié)構(gòu)在秋、冬兩季變化不大。

變形菌門是海洋沉積物中的主要類群[19]，該類群的代謝是深海沉積物中最主要的微生物活動。本研究表明，黃海和渤海刺參養(yǎng)殖池塘沉積物樣品中的主要優(yōu)勢類群為變形菌，這與肖慧等[20]和白潔等[21]對海洋沉積物的研究結(jié)果一致。在研究海洋沉積物厭氧條件下氨的代謝情況時，F(xiàn)reitag等[22]發(fā)現(xiàn)，γ-變形菌亞門中的細菌在厭氧氨氧化過程中發(fā)揮著重要的作用。Urakawa等[23]發(fā)現(xiàn)，δ-變形菌中的細菌在海洋沉積物中主要以硫還原細菌(SRB)為主。本研究中，黃海養(yǎng)殖池塘沉積物樣品中γ-變形菌和δ-變形菌為優(yōu)勢類群，渤海養(yǎng)殖池塘沉積物樣品中γ-變形菌較為優(yōu)勢，因此，黃、渤海養(yǎng)殖池塘沉積物中存在大量的γ-變形菌和δ-變形菌，可能與沉積物中的碳、氮、硫循環(huán)密切相關(guān)。總體而言，黃海刺參養(yǎng)殖池塘沉積物秋、冬季菌群結(jié)構(gòu)變化不顯著，但是渤海刺參養(yǎng)殖池塘秋、冬季菌群結(jié)構(gòu)差異較大。Nelson等[24]對Steel Lake沉積物中細菌群落的分布進行研究時也發(fā)現(xiàn)，不同時期形成的沉積物其細菌群落結(jié)構(gòu)不同，主要原因可能是有機質(zhì)含量不同造成的。本研究中，也推測渤海刺參養(yǎng)殖池塘秋季和冬季沉積物中菌群結(jié)構(gòu)差異較大是由于不同季節(jié)沉積物中有機質(zhì)的含量不同造成的。

3.2刺參養(yǎng)殖環(huán)境中的條件致病菌

Stackebrandt等[25]研究發(fā)現(xiàn)，同菌種的菌株其16S rDNA序列相似性不低于97%，但是16S rDNA序列相似性達到97%或是更高的菌株卻不一定屬于同一菌種。目前，將具有97%~99%16S rDNA全序列相似性的菌株判定為一個屬，具有99%~100%的16S rDNA全序列相似性的菌株判定為一個種[26]。本研究中發(fā)現(xiàn)，渤海冬季海水中克隆子BWW13與燦爛弧菌(EU091328.1)相似性達99%，渤海養(yǎng)殖池塘秋季沉積物克隆子BAS12與哈維氏弧菌(HM008702.1)相似性達99%，可以確定，渤海秋季海水和秋季沉積物中分別含有燦爛弧菌和哈維氏弧菌。 張春云等[27]報道，2003年春季，山東省青島地區(qū)刺參養(yǎng)殖場暴發(fā)的較為嚴重的腐皮綜合征的致病菌為燦爛弧菌；Deng等[28]從刺參皮膚潰爛處分離得到6株主要菌株，其中04101和04103菌株為哈維氏弧菌；Becker等[29]在研究糙海參幼體培育過程中暴發(fā)的流行性皮膚潰爛病時推測，弧菌屬Vibriosp.的哈維氏弧菌或溶藻弧菌V.alginolyticus可能是引發(fā)此病的病原菌。雖然本研究中的刺參養(yǎng)殖池塘沒有病害發(fā)生，但是刺參養(yǎng)殖池塘中有致病菌的存在，應(yīng)引起關(guān)注。

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Flora diversity in sea cucumberApostichopusjaponicusculture

ponds in autumn and winter

DOU Yan1, DING Jun1, QU Ling-yun2, LIU Zhi-min1,

WANG Yi-nan1， MU Xiao-hu1, CHANG Ya-qing1

(1.Key Laboratory of Mariculture & Stock Enhancement in North China’s Sea, Ministry of Agriculture, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China; 2.First Institute of Oceanography, State Oceanic Administration, Qingdao 266061, China)

Abstract：Flora diversity was studied in seawater and sediments in sea cucumber Apostichopus japonicus culture ponds from Yellow Sea and Bohai Sea in autumn and winter based on total DNA extract. The 16S rDNA genes of bacteria were amplified and 16S rDNA gene libraries were constructed. The results showed that 11 known Phyla of bacteria were found in seawater and sediments: Proteobacteria, Acidobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Verrucomicrobia, Firmicutes, Fusobacteria, Cyanobacteria, Planctomycetes, Deferribacteres, and Chloroflexi, with dominant Proteobacteria(>48%). The bacterial diversity in seawater and sediments in sea cucumber culture ponds was evaluated by Simpson index and Shannon index, with the minimum (0.014 89 in Yellow Sea and 0.016 50 in Bohai Sea) in winter by Simpson index, and the maximum (6.312 in Yellow Sea and 5.695 in Bohai Sea) by Shannon index. The findings indicated that there was the maximal bacterial diversity in sediments of sea cucumber culture ponds from Yellow Sea libraries and Bohai Sea libraries in winter.

Key words：Apostichopus japonicus; culture pond; 16S rDNA; Proteobacteria

通信作者：丁君(1973—)， 女， 研究員。E-mail:dingjun1119@dlou.edu.cn

作者簡介：竇妍(1989 —)， 女， 碩士研究生。E-mail:yandou1989@126.com

基金項目：國家海洋局科研項目(201105007-2)；遼寧省教育廳優(yōu)秀人才支持計劃項目(LJQ2011073)

收稿日期：2014-06-19

中圖分類號：Q954.4

文獻標志碼：A

文章編號：2095-1388(2015)02-0143-06

DOI：10.3969/J.ISSN.2095-1388.2015.02.006