紫蛇尾皂苷的初步純化和生物學(xué)活性研究

邵知揚(yáng)，李智博，董淑梅，趙前程，祁艷霞，李偉

(大連海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點實驗室，遼寧 大連 116023)

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紫蛇尾皂苷的初步純化和生物學(xué)活性研究

邵知揚(yáng)，李智博，董淑梅，趙前程，祁艷霞，李偉

(大連海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點實驗室，遼寧 大連 116023)

摘要:對紫蛇尾Ophiopholis mirabilis皂苷粗提物進(jìn)行初步純化，并對所得產(chǎn)物的抑菌活性、抑制α-葡萄糖苷酶活性和細(xì)胞毒活性進(jìn)行了研究。采用AB-8大孔吸附樹脂初步純化紫蛇尾皂苷粗提物，采用香草醛—高氯酸法測定總皂苷含量，采用濾紙片法測定抑菌活性，采用比色法和MTT法分別測定α-葡萄糖苷酶和MCF-7人乳腺癌細(xì)胞的抑制率。結(jié)果表明：純化后的紫蛇尾皂苷純度增加至48.57%；皂苷粗提物及純化物的抑菌活性表現(xiàn)一致，均對枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis具有明顯的抑制作用，且純化物的抑菌效果略強(qiáng)；皂苷粗提物對α-葡萄糖苷酶的抑制效果明顯，大孔樹脂95%乙醇洗脫所得純化物的抑制率達(dá)到94.62%；皂苷粗提物及純化物對MCF-7人乳腺癌細(xì)胞均表現(xiàn)出了很強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，其中大孔樹脂60%、75%、95%乙醇洗脫所得純化物的濃度為300 μg/mL時，細(xì)胞抑制率均高達(dá)97%以上。研究表明，紫蛇尾皂苷粗提物及純化物均表現(xiàn)出了很強(qiáng)的選擇性抑菌活性、α-葡萄糖苷酶抑制活性和對MCF-7人乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，且純化物的活性增強(qiáng)。

關(guān)鍵詞:紫蛇尾皂苷；抑菌；抑制α-葡萄糖苷酶；細(xì)胞毒活性

皂苷(saponins)又名皂素或皂草苷，是苷元為三萜或螺旋甾烷類化合物的一類糖苷，主要分布于陸地維管植物中，也少量存在于海星和海參等海洋生物中[1]。皂苷作為次級代謝產(chǎn)物之一，具有多種生物學(xué)活性。其中，海洋棘皮動物皂苷的活性表現(xiàn)在溶血、細(xì)胞毒性、抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多個方面[2-5]。

紫蛇尾Ophiopholismirabilis隸屬于棘皮動物門Echinodermata 、蛇尾綱Ophiuroidea、顎蛇尾壓目Gnathophiurina、輻蛇尾科Ophiactidae、紫蛇尾屬Ophiopholis，在黃海中部和北部、大連、旅順、海洋島、長島、煙臺和青島外海海域大量分布[6-7]。目前，有關(guān)紫蛇尾活性物質(zhì)的研究主要集中于多糖、膠原蛋白、皂苷的提取制備方面[8-10]，而關(guān)于紫蛇尾皂苷活性研究的報道較少。本研究中，以大連海域的紫蛇尾為原料，提取紫蛇尾皂苷并進(jìn)行初步純化，研究粗提物及純化物的抑菌作用及對α-糖苷酶的抑制作用和對MCF-7人乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，以期在充分利用蛇尾資源及海洋藥物先導(dǎo)化合物研究方面提供準(zhǔn)確的科學(xué)依據(jù)，為深入研究海洋棘皮動物活性成分奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

試驗用紫蛇尾產(chǎn)于黃海海域，采自大連獐子島附近海域。樣品采集后洗凈泥沙，自然風(fēng)干，陰涼處自然晾干，用高速萬能粉碎機(jī)粉碎后，過80目篩備用。

主要試劑主要有：齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品，購自大連博邁科技發(fā)展有限公司；AB-8型大孔樹脂,購自天津恒興化學(xué)試劑制造有限公司；α-葡萄糖苷酶、PNPG(4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷)，均購自美國Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清，由美國Thermo有限公司提供；四甲基偶氮唑鹽(MTT)，由美國AMRESCO有限公司提供；正丁醇、乙醇、高氯酸、甲醇、石油醚、乙酸乙酯等試劑均為分析純。

供試菌種為大腸桿菌Escherichiacoli、枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis、產(chǎn)氣桿菌Aerobacteraerogenes、金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus、變形桿菌Proteusbacillusvulgaris，由大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院微生物實驗室提供并鑒定。主要儀器與設(shè)備：721型分光光度計、JY92-IIDN型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)、RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、LDZX-45SC型蒸汽壓力滅菌器、酶標(biāo)儀、TS100倒置顯微鏡。

1.2方法

1.2.1紫蛇尾皂苷的初步純化及含量測定取一定量的紫蛇尾粉經(jīng)超聲細(xì)胞粉碎提取后(超聲條件：溶劑65%乙醇、時間20 min、功率400 W、料液比1 g∶20 mL)，70 ℃水浴回流2 h，取出后濾掉殘渣，濃縮濾液經(jīng)石油醚萃取脫脂(3次)后，再經(jīng)水飽和正丁醇萃取至上層無色，合并正丁醇部分，減壓濃縮得到濃縮液，即為紫蛇尾皂苷粗提物。

將80 g皂苷粗提物溶于蒸餾水中，上樣于AB-8型大孔吸附樹脂柱(規(guī)格為100 cm×8 cm)。上樣后先用水洗，除去極性大的雜質(zhì)，隨后再依次分別用4倍柱體積的蒸餾水、4倍柱體積的20%乙醇、4倍柱體積的40%乙醇、4倍柱體積的50%乙醇、5倍柱體積的60%乙醇、5倍柱體積的75%乙醇、6倍柱體積的95%乙醇進(jìn)行梯度洗脫，分別收集洗脫液并旋轉(zhuǎn)蒸干，得皂苷純化物。

采用香草醛-高氯酸法測定總皂苷含量[11]。

1.2.2紫蛇尾皂苷生物學(xué)活性的測定采用濾紙片法測定紫蛇尾皂苷粗提物及純化物的抑菌活性[12]，采用比色法測定抑制α-葡萄糖苷酶的活性[13]，采用MTT法測定MCF-7人乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，具體參照文獻(xiàn)[14]中的方法。

1.3數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.) 表示，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析，采用t檢驗進(jìn)行組間差異比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2結(jié)果與討論

2.1紫蛇尾皂苷的分離提純及皂苷含量的測定

紫蛇尾皂苷經(jīng)大孔樹脂初步純化后，各洗脫所得純化物皂苷純度如表1所示，隨乙醇濃度的升高，洗脫效率不斷提高。其中， 95%乙醇對皂苷的洗脫作用最強(qiáng)，洗下來的皂苷量較多，且純度最高，可達(dá)到48.57%，說明95%的乙醇與蛇尾皂苷的極性最為接近。

表1　不同濃度乙醇洗脫效率的比較

2.2紫蛇尾皂苷的抑菌活性

由表2可知，紫蛇尾皂苷粗提物對5種指示菌的抑制作用隨著皂苷粗提物濃度的增加而增大，濃度為45 mg/mL的皂苷粗提物對產(chǎn)氣桿菌有較強(qiáng)的抑制作用，對金黃色葡萄球菌的抑制作用較弱，說明紫蛇尾皂苷粗提物對不同供試菌種的抑制作用具有選擇性。統(tǒng)計結(jié)果顯示，各個濃度的皂苷粗提物的抑菌作用與對照組均無顯著性差異，說明皂苷粗提物整體抑菌活性較弱。

表3為皂苷純化物在濃度為45 mg/mL時的抑菌結(jié)果。從表3可見，大孔樹脂40%乙醇洗脫所得純化物幾乎沒有抑菌活性，50%、60%乙醇洗脫所得純化物對5種指示菌都有很強(qiáng)的抑制活性，以50%乙醇洗脫所得純化物的抑制活性最強(qiáng)。統(tǒng)計結(jié)果顯示，50%乙醇洗脫和60%乙醇洗脫所得純化物的抑菌圈直徑與陽性對照組均有極顯著或顯著性差異(P<0.01或P<0.05)。50%乙醇洗脫所得純化物對指示菌的抑菌圈直徑最高可達(dá)18.00 mm，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于皂苷粗提物的抑菌效果。此外，各個純化物對枯草芽孢桿菌的抑制作用普遍較好，這與皂苷粗提物的抑菌結(jié)果相吻合。李笑梅等[15]研究發(fā)現(xiàn)，菜豆皂苷也表現(xiàn)出選擇性的抑菌活性，即對枯草芽孢桿菌、白色葡萄球菌、大腸桿菌都有不同程度的抑制作用，但對黑曲霉菌沒有抑制作用。

表2　紫蛇尾皂苷粗提物的抑菌作用(n=3)

注：—代表無抑菌圈，*表示與陽性對照組有顯著性差異(P<0.05)；**表示與陽性對照組有極顯著性差異(P<0.01)，下同

Note：—indicates no inhibition circle； *means significant difference compared with the control (P<0.05)；**means very significant difference compared with the control(P<0.01)，et sequentia

表3　紫蛇尾皂苷純化物(濃度為45 mg/mL)的抑菌作用(n=3)

2.3紫蛇尾皂苷對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

從圖1可見，隨著紫蛇尾皂苷粗提物濃度的增加，其對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用逐漸增強(qiáng)。當(dāng)紫蛇尾皂苷粗提物濃度達(dá)到7 mg/mL時，酶抑制率為97.3%。

如表4所示，大孔樹脂95%乙醇洗脫所得純化物對酶的抑制作用較強(qiáng)，且濃度為2 mg/mL純化物的酶抑制率較同等濃度粗提物的抑制結(jié)果(89%)差異顯著(P<0.05)，說明經(jīng)過純化的皂苷提取物活性明顯增強(qiáng)。

2.4紫蛇尾皂苷對MCF-7人乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用

從圖2-A可以看出：當(dāng)皂苷粗提物濃度小于200 μg/mL時，紫蛇尾皂苷粗提物對MCF-7人乳

腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒活性隨樣品液濃度的增大而迅速升高；當(dāng)皂苷粗提物濃度為200 μg/mL時，細(xì)胞抑制率達(dá)到最大值，為97%。經(jīng)計算，其50%致死濃度(IC50)為 120 μg/mL。

圖1　紫蛇尾皂苷粗提物對-葡萄糖苷酶活性的抑制作用Fig.1　Inhibiting effect of crude saponin extract on -glucosidase activity

表4紫蛇尾皂苷純化物(濃度為2 mg/mL)對-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

Tab.4Inhibition effect of purified saponin extract from the brittle star(at concentration of 2 mg/mL) on-glucosidase activity

不同乙醇濃度的洗脫組分elutionfractionsatdifferentconcentrationsofethanol抑制率/%inhibitingrate40%乙醇洗脫73.60±4.1650%乙醇洗脫82.40±4.6160%乙醇洗脫89.65±5.3075%乙醇洗脫90.41±3.1595%乙醇洗脫94.62±3.75

圖2　紫蛇尾皂苷粗提物(A)和純化物(B)對MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用Fig.2　Inhibition effect of crude saponin (A)and purified saponin(B) extract from the brittle star on multiplication of MCF-7 human breast cancer cells

圖2-B為不同濃度乙醇洗脫所得純化物分別在低濃度100 μg/mL和高濃度300 μg/mL時對MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞毒活性作用。從圖2-B可以看出，高濃度的樣品均表現(xiàn)出更好的抑制作用。隨著乙醇濃度的增加，其細(xì)胞毒活性作用也明顯增加。其中，60%、75%、95%乙醇洗脫所得純化物在濃度為300 μg/mL時，抑制率均高達(dá)97%以上，這可能與純化物中所含皂苷含量相對較高有關(guān)。樊廷俊等[16]的研究表明，水溶性海參皂苷大孔樹脂柱的70%乙醇洗脫所得純化物對HeLa細(xì)胞、A-549肺癌細(xì)胞、SGC-7901胃癌細(xì)胞和Bel-7402肝癌細(xì)胞均具有顯著的抑制活性，且純化后活性明顯增強(qiáng)，這與本研究結(jié)果相似。

3結(jié)論

紫蛇尾皂苷粗提物及純化物對枯草芽孢桿菌、變形桿菌、大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌均有不同程度的抑制作用，而對金黃色葡萄球菌抑制作用較弱，說明其抑制作用具有選擇性。其中枯草芽孢桿菌對紫蛇尾皂苷樣品最為敏感。大孔樹脂50%和60%乙醇洗脫所得純化物對枯草芽孢桿菌、變形桿菌、大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌和金黃色葡萄球菌5種指示菌都有很強(qiáng)的抑制作用，皂苷純化物的抑菌活性明顯增強(qiáng)。紫蛇尾皂苷粗提物及純化物對α-葡萄糖苷酶活性和MCF-7細(xì)胞的增殖均表現(xiàn)出了很強(qiáng)的抑制作用，且純化物的抑制作用增強(qiáng)。

通過對紫蛇尾皂苷粗提物及純化物進(jìn)行生物活性檢測，可知其具體的生物學(xué)活性表現(xiàn)，這些都為充分利用蛇尾資源及海洋藥物的研究奠定了基礎(chǔ)。

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Purification and biological activity of saponins

in brittle starOphiopholismirabilis

SHAO Zhi-yang, LI Zhi-bo, DONG Shu-mei, ZHAO Qian-cheng, QI Yan-xia, LI Wei

(Key Laboratory of Fishery Product Processing and Utilization of Liaoning Province, College of Food Science and Engineering, Dalian Ocean University, Dalian 116023,China)

Abstract：Saponins in brittle star Ophiopholis mirabilis were preliminarily purified by AB-8 macroporous resin and total content of saponins were determined by vanillin-perchloric acid method. Antibacterial activity and inhibitory effect on alpha glucosidase activity, and cytotoxic activity were tested by filter paper method, colorimetric method and MTT method. The results showed that the purity of the saponins was increased to 48.57% after purification by AB-8 macro porous resin. The antibacterial manifestations of crude extracts and purified saponins showed the same antibacterial activity, especially strong inhibition on Bacillus subtilis. However, the purified saponins had higher antibacterial effects, significant inhibitory effect on alpha glucosidase activity, with inhibition rate of 94.62% in 95% ethanol elution fractions. Moreover, both crude extracts and purified saponins showed significant cytotoxic activity of MCF-7 human breast cancer cells. The inhibition rate of over 97% were observed in 60%, 75%, and 95% ethanol elution fractions at 300 μg/mL. Both of crude extracts and purified saponins showed strong alternative inhibition on Bacillus subtilis, strong inhibitory effect on alpha glucosidase activity and cytotoxic activity of MCF-7 human breast cancer cells.

Key words：Ophiopholis mirabilis saponin; antibacterial activity; inhibition of alpha glucosidase; cytotoxic activity

通信作者：李智博(1979—)， 女， 副教授。E-mail:lzb@dlou.edu.cn

作者簡介：邵知揚(yáng)(1990—)， 女， 碩士研究生。E-mail:932259199@qq.com

基金項目：國家海洋公益性行業(yè)科研專項(201205022-7)

收稿日期：2014-06-24

中圖分類號：TS218.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：2095-1388(2015)02-0221-05

DOI：10.3969/J.ISSN.2095-1388.2015.02.021