聚維酮碘對(duì)褶皺臂尾輪蟲(chóng)的毒性效應(yīng)

劉青，崔延超，李雙宇，付泉潔，揣潔

(大連海洋大學(xué) 遼寧省水生生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023)

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聚維酮碘對(duì)褶皺臂尾輪蟲(chóng)的毒性效應(yīng)

劉青，崔延超，李雙宇，付泉潔，揣潔

(大連海洋大學(xué) 遼寧省水生生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023)

摘要:通過(guò)聚維酮碘對(duì)褶皺臂尾輪蟲(chóng)Brachionus plicatilis幼體的急性、慢性毒性試驗(yàn)，研究了聚維酮碘對(duì)輪蟲(chóng)存活、生長(zhǎng)和繁殖的影響。結(jié)果表明：聚維酮碘對(duì)褶皺臂尾輪蟲(chóng)幼體的24 h LC50為2.25 mg/L，48 h LC50為1.99 mg/L，應(yīng)用Turubell公式得出其安全濃度為0.47 mg/L；褶皺臂尾輪蟲(chóng)的平均存活時(shí)間、總生殖量、平均生殖次數(shù)和每次生殖個(gè)數(shù)均隨聚維酮碘濃度的升高而減少，產(chǎn)前發(fā)育期則隨濃度的升高而延長(zhǎng)，其中0.5 mg/L高濃度組的這些種群增長(zhǎng)參數(shù)與對(duì)照組及其他各濃度組間均有顯著性差異(P<0.05)；內(nèi)稟增長(zhǎng)率(rm)、凈增值率(R0)和周限增長(zhǎng)率(λ)隨濃度的升高而降低，世代周期(T)則隨濃度的升高而升高，其中0.5 mg/L高濃度組的rm、λ、T與對(duì)照組及其他各濃度組間有顯著性差異(P<0.05)。研究表明，0.1 mg/L低濃度聚維酮碘對(duì)褶皺臂尾輪蟲(chóng)的存活、產(chǎn)前發(fā)育時(shí)間影響不大，即與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P>0.05)， 但對(duì)其種群增長(zhǎng)、繁殖有顯著影響(P<0.05)。

關(guān)鍵詞:褶皺臂尾輪蟲(chóng)；聚維酮碘；毒性試驗(yàn)；安全濃度

聚維酮碘(povidone-iodine)為碘伏類殺菌劑，它是由分子碘與聚乙烯吡咯烷酮(PVP)結(jié)合而成的高分子化合物(PVP-I)[1]。其殺菌機(jī)理主要是遇組織中的還原物時(shí)，緩慢釋放出游離碘而氧化細(xì)菌、病毒等原漿蛋白的活性基團(tuán), 并與蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合而使其變性，從而殺滅細(xì)菌、真菌、病毒等病原體。聚維酮碘因其性能穩(wěn)定，并具有高效、低毒、無(wú)殘留、毒副作用小的特點(diǎn), 是目前國(guó)內(nèi)首選的皮膚黏膜和外科消毒劑，并已擴(kuò)大應(yīng)用到口腔、婦科等其他醫(yī)療領(lǐng)域[2]。

聚維酮碘還具有受水體pH、鹽度、溫度影響較小的特點(diǎn)，在水產(chǎn)養(yǎng)殖魚(yú)、蝦、蟹、貝、藻的殺菌消毒上已被廣泛使用，在水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物類的疾病防治中起到重要作用[3-4]。目前，有關(guān)聚維酮碘對(duì)水生生物的毒性效應(yīng)已有較多報(bào)道[5-16]，但研究?jī)?nèi)容主要是急性毒性試驗(yàn)方面，而對(duì)水域環(huán)境中生物的存活、種群增長(zhǎng)與繁殖的進(jìn)一步研究報(bào)道較少，因此，對(duì)于其使用后是否會(huì)對(duì)水體生態(tài)環(huán)境中其他生物的存活、種群繁殖造成影響，值得深入研究。

輪蟲(chóng)是水域環(huán)境中常見(jiàn)的一種浮游動(dòng)物，對(duì)環(huán)境變化較為敏感，本試驗(yàn)中以褶皺臂尾輪蟲(chóng)Brachionusplicatilis為受試生物，研究了不同濃度的聚維酮碘對(duì)其生存、生長(zhǎng)和繁殖的影響，以期為聚維酮碘在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的安全使用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

褶皺臂尾輪蟲(chóng)由大連海洋大學(xué)水生生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，以小球藻Chlorellasp.為餌料擴(kuò)大培養(yǎng)，試驗(yàn)所用輪蟲(chóng)均選用新生的同步輪蟲(chóng)幼體。輪蟲(chóng)培養(yǎng)液是用過(guò)濾煮沸海水和曝氣自來(lái)水配制而成，鹽度為15(鹽度計(jì)VR-211)。

聚維酮碘購(gòu)自東莞市中加消毒科技有限公司，用硫代硫酸鈉滴定后，測(cè)得有效碘濃度為2740 mg/L。本研究中提到的聚維酮碘濃度，均指有效碘濃度。為保證聚維酮碘的有效濃度，聚維酮碘試液均為每次使用前配制。

1.2方法

1.2.1聚維酮碘對(duì)褶皺臂尾輪蟲(chóng)的急性毒性試驗(yàn)首先進(jìn)行聚維酮碘對(duì)褶皺臂尾輪蟲(chóng)的毒性預(yù)試驗(yàn)，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，急性毒性試驗(yàn)按等對(duì)數(shù)間距設(shè)置1.35、1.80、2.40、3.20、4.20、5.60、7.50 7個(gè)濃度組，另設(shè)1個(gè)空白對(duì)照組。試驗(yàn)用12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入5 mL試液和5只新生輪蟲(chóng)幼體，每組設(shè)3個(gè)平行(即3個(gè)12孔細(xì)胞培養(yǎng)板)。試驗(yàn)在GXZ-380B型恒溫光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行，溫度為(25±1)℃，光照強(qiáng)度為1500 lx，光周期為12∶12(L∶D)，急性毒性試驗(yàn)不喂食。觀察記錄1、2、4、6、12、24、48 h輪蟲(chóng)個(gè)體的死亡情況。

1.2.2聚維酮碘對(duì)褶皺臂尾輪蟲(chóng)的慢性毒性試驗(yàn)依據(jù)急性試驗(yàn)結(jié)果求得聚維酮碘的安全濃度，根據(jù)安全濃度值，慢性試驗(yàn)設(shè)置0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L 5個(gè)濃度組，另設(shè)1個(gè)空白對(duì)照組。試驗(yàn)用24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔中加入3 mL試液和1只新生同步輪蟲(chóng)幼體，每組設(shè)3個(gè)平行(即3個(gè)24孔細(xì)胞培養(yǎng)板)。每24 h更換一次培養(yǎng)液，以小球藻為餌料，各試驗(yàn)組保持餌料藻密度為1.28 ×106ind./mL。每天觀察記錄輪蟲(chóng)的生長(zhǎng)、生殖情況，同時(shí)挑出新生輪蟲(chóng)個(gè)體，試驗(yàn)至輪蟲(chóng)全部死亡結(jié)束。其他試驗(yàn)條件同“1.2.1”節(jié)。

1.2.3半致死濃度的計(jì)算采用概率單位法[17]計(jì)算半致死濃度。即通過(guò)各組試驗(yàn)24 h和48 h的死亡率，計(jì)算平均死亡率，轉(zhuǎn)換成概率單位；再將各組試驗(yàn)聚維酮碘濃度轉(zhuǎn)換成濃度對(duì)數(shù)，以濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，概率單位為縱坐標(biāo)作圖，擬合概率單位-濃度對(duì)數(shù)回歸方程，從而計(jì)算24 h半致死濃度(24 h LC50)和48 h半致死濃度(48 h LC50)。

1.2.4安全濃度的計(jì)算安全濃度(SC，mg/L)通過(guò)Turubell公式[18]計(jì)算：

SC=0.3×48 h LC50/(24 h LC50/48 h LC50)2。

1.2.5生命表參數(shù)的計(jì)算根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)，計(jì)算內(nèi)稟增長(zhǎng)率(rm)、凈生殖率(R0)、世代周期(T)和周限增長(zhǎng)率(λ)并編制生命表，內(nèi)稟增長(zhǎng)率通過(guò)Lotka提出經(jīng)Birch和林昌善簡(jiǎn)化的公式[19]計(jì)算得出。

T=lnR0/rm，

λ=erm。

其中：x為日齡(d)；lx為x日齡時(shí)的存活率；mx為x日齡時(shí)的出生率。

1.3數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan法進(jìn)行多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2結(jié)果與分析

2.1聚維酮碘對(duì)褶皺臂尾輪蟲(chóng)的急性毒性試驗(yàn)

不同聚維酮碘濃度組褶皺臂尾輪蟲(chóng)的存活率如表1所示。從表1可見(jiàn)：在試驗(yàn)開(kāi)始的1 h內(nèi)，各濃度組均無(wú)死亡個(gè)體；2 h 后隨著聚維酮碘濃度的增加，褶皺臂尾輪蟲(chóng)的存活率呈下降趨勢(shì)；6 h后5.60 mg/L和7.50 mg/L兩個(gè)高濃度組的輪蟲(chóng)個(gè)體幾乎無(wú)存活個(gè)體；至24 h時(shí)，2.40、3.20、4.20 mg/L 3個(gè)中濃度組的輪蟲(chóng)存活率也不及50%；但1.35 mg/L和1.80 mg/L兩個(gè)低濃度組的存活率都保持較高值，48 h的存活率也達(dá)到近60%； 而對(duì)照組存活率始終穩(wěn)定在100%。

表1　不同聚維酮碘濃度下褶皺臂尾輪蟲(chóng)的存活率

通過(guò)概率單位法求得24 h濃度對(duì)數(shù)與概率單位的直線回歸方程為

y=3.9125x+3.6187，R2=0.9811,

計(jì)算得到24 h LC50為(2.250±0.093)mg/L。同樣求得48 h濃度對(duì)數(shù)與概率單位的直線回歸方程為

y=3.6773x+3.9018，R2=0.9809，

計(jì)算得到48 h LC50為(1.990±0.102)mg/L。再根據(jù)安全濃度計(jì)算公式，求得SC為0.47 mg/L。

圖1　24 h和48 h條件下概率單位與聚維酮碘濃度對(duì)數(shù)的線性關(guān)系Fig.1　Liner relationship of probit and logarithm of povidone-iodine concentrations in 24 h and 48 h

2.2聚維酮碘對(duì)褶皺臂尾輪蟲(chóng)生長(zhǎng)和繁殖的影響

各濃度組聚維酮碘對(duì)褶皺臂尾輪蟲(chóng)生長(zhǎng)和繁殖影響結(jié)果如表2所示。從表2可以看出，輪蟲(chóng)的平均存活時(shí)間、總生殖量、一生平均生殖次數(shù)、每次生殖個(gè)數(shù)均隨聚維酮碘濃度的升高而呈降低趨勢(shì)，產(chǎn)前發(fā)育期則隨濃度的升高而呈延長(zhǎng)趨勢(shì)。

方差分析和Duncan多重比較結(jié)果表明：平均存活時(shí)間以對(duì)照組最長(zhǎng)，為(11.875±0.355)d，除0.1 mg/L濃度組外，其他濃度組與對(duì)照組均存在顯著性差異(P<0.05)；總生殖量亦是對(duì)照組最高，為(31.833±2.499)ind./只，各濃度組與對(duì)照組均存在顯著性差異(P<0.05)；一生平均生殖次數(shù)和每次生殖個(gè)數(shù)亦是對(duì)照組最高，除0.1 mg/L濃度組的平均生殖次數(shù)外，其他濃度組與對(duì)照組均存在顯著性差異(P<0.05)；產(chǎn)前發(fā)育期亦是對(duì)照組最短，為(2.18±0.02)d，除0.1 mg/L濃度組外，其他濃度組與對(duì)照組均存在顯著性差異(P<0.05)。

表2　不同聚維酮碘濃度下褶皺臂尾輪蟲(chóng)的生長(zhǎng)、繁殖狀況

注：同列中標(biāo)有不同小寫(xiě)字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同小寫(xiě)字母者表示組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)，下同

Note:The means with different letters within the same column are significant differences at the 0.05 probability level,and the means with the same letters within the same column are not significant differences,et sequentia

2.3聚維酮碘對(duì)褶皺臂尾輪蟲(chóng)種群增長(zhǎng)參數(shù)的影響

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果編制如表3所示的生命表。由表3可以看出，各組均在第2日開(kāi)始有新個(gè)體出生，且第2日對(duì)照組出生率顯著高于試驗(yàn)組(P<0.05)，0.1 mg/L濃度組與其他各試驗(yàn)組均存在顯著差異(P<0.05)，至14日，0.1 mg/L濃度組出生率高于對(duì)照組。0.5 mg/L高濃度組在第7日開(kāi)始出現(xiàn)死亡個(gè)體,而0.1 mg/L和0.2 mg/L低濃度組則在第10日時(shí)才出現(xiàn)死亡個(gè)體。

不同聚維酮碘濃度組中褶皺臂尾輪蟲(chóng)種群增長(zhǎng)參數(shù)如表4所示。從表4可見(jiàn)：rm、R0和λ均隨濃度的升高而降低，T隨濃度的升高而延長(zhǎng)；對(duì)照組rm最高，約為0.59/(ind.-1·d-1)，各濃度組與對(duì)照組間均存在顯著性差異(P<0.05)；對(duì)照組R0也最高，約為29.82，0.1~0.3 mg/L低濃度組與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P>0.05)；對(duì)照組λ也最高，約為1.81/(ind.-1·d-1)，各濃度組與對(duì)照組均存在顯著性差異(P<0.05)；0.5 mg/L高濃度組T最長(zhǎng)，約為6.20 d，各濃度組與對(duì)照組均存在顯著性差異(P<0.05)。

表3　不同聚維酮碘濃度下褶皺臂尾輪蟲(chóng)的生命表

注：同行中標(biāo)有不同小寫(xiě)字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同小寫(xiě)字母者表示組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)

Note:The means with different letters within the same line are significant differences at the 0.05 probability level,and the means with the same letters within the same line are not significant differences

表4　不同聚維酮碘濃度下褶皺臂尾輪蟲(chóng)的種群增長(zhǎng)參數(shù)

3討論

3.1聚維酮碘對(duì)水生生物的急性毒性效應(yīng)

作為殺菌劑，聚維酮碘已經(jīng)在水產(chǎn)養(yǎng)殖魚(yú)、蝦、蟹的殺菌消毒方面得到廣泛應(yīng)用[3]。已有研究表明，各類水生生物對(duì)聚維酮碘的敏感性依種類不同而有很大差異。由表5可以看出，泥鰍Misgurnusanguillicaudatus、沙蠶Perinereisaibuhitensis等底棲生活種類對(duì)聚維酮碘最不敏感，扁吻魚(yú)Aspiorhynchuslaticeps幼魚(yú)、點(diǎn)籃子魚(yú)Siganusguttatus幼魚(yú)等次之。受試生物對(duì)毒物的敏感性，不僅各生物類群之間存在著很大差異，即使是同一類生物，不同種之間也存在明顯的差異。同是甲殼動(dòng)物的蝦類，聚維酮碘對(duì)青蝦Macrobrachiummipponensis幼蝦和斑節(jié)對(duì)蝦Penaeusmonodon仔蝦的安全濃度相差20倍以上。

從本研究的急性試驗(yàn)結(jié)果得出，聚維酮碘對(duì)褶皺臂尾輪蟲(chóng)的24 h LC50值為2.25 mg/L，48 h LC50值為1.99 mg/L，LC50值均低于個(gè)體較大的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，褶皺臂尾輪蟲(chóng)的安全濃度為0.47 mg/L，也大多低于表5中所列的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物。

表5不同水生動(dòng)物對(duì)聚維酮碘的半致死濃度和安全濃度

Tab.5Median lethal concentration and safety concentration of povidone iodine in different aquatic organisms

mg/L

3.2聚維酮碘對(duì)褶皺臂尾輪蟲(chóng)種群增長(zhǎng)的影響

輪蟲(chóng)是水域環(huán)境中常見(jiàn)的一種浮游動(dòng)物，其個(gè)體小、繁殖力強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)豐富，為水域環(huán)境中魚(yú)類及其他水生動(dòng)物的天然餌料。輪蟲(chóng)主要攝食水體中的浮游植物、細(xì)菌、有機(jī)碎屑等，其數(shù)量種群變動(dòng)影響著水域環(huán)境的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)。因其生殖量大、周期短，以輪蟲(chóng)作為受試生物的毒性研究多有報(bào)道。金解敏[20]研究表明，褶皺臂尾輪蟲(chóng)對(duì)Cu2+和 Zn2+的敏感性存在差異。謝欽銘等[21]研究表明，孔雀石綠、高錳酸鉀和甲醛對(duì)褶皺臂尾輪蟲(chóng)的24 h LC50分別為0.613、0.873、11.277 mg/L；謝志浩等[22]研究表明，百草枯對(duì)褶皺臂尾輪蟲(chóng)的24 h LC50為 9.17 mg/L；加上本試驗(yàn)的研究結(jié)果，綜合得到褶皺臂尾輪蟲(chóng)對(duì)5種消毒藥物的敏感性依次為孔雀石綠>高錳酸鉀>聚維酮碘>百草枯>甲醛，這說(shuō)明褶皺臂尾輪蟲(chóng)對(duì)各類藥物的耐受性也有較大差異。根據(jù)國(guó)家環(huán)境保護(hù)局1989年頒布的《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》[23]，參考溞類毒性標(biāo)準(zhǔn)，1.0 mg/L<48 h EC50≤10 mg/L為中毒性，推斷聚維酮碘對(duì)褶皺臂尾輪蟲(chóng)為中毒性藥物。

急性毒性試驗(yàn)是評(píng)價(jià)毒物最直接的方法，當(dāng)深入評(píng)價(jià)某一毒物的毒性強(qiáng)度時(shí)，急性毒性試驗(yàn)已不能滿足需求，需要做低濃度下的慢性毒性試驗(yàn)，以觀察毒物對(duì)受試生物的壽命、繁殖和種群增長(zhǎng)及其他生理指標(biāo)等的影響。目前，還缺乏聚維酮碘對(duì)受試生物的慢性毒性試驗(yàn)研究。本試驗(yàn)結(jié)果表明，濃度為0.2 mg/L以上的聚維酮碘對(duì)褶皺臂尾輪蟲(chóng)的壽命、繁殖和種群增長(zhǎng)有顯著影響，而與對(duì)照組相比，0.1 mg/L的聚維酮碘雖然對(duì)褶皺臂尾輪蟲(chóng)的存活、產(chǎn)前發(fā)育時(shí)間影響不大(P>0.05)，但總生殖量、每次生殖個(gè)數(shù)、內(nèi)稟增長(zhǎng)率、世代周期和周限增長(zhǎng)率均與對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05)，因此，濃度為0.1 mg/L的聚維酮碘對(duì)輪蟲(chóng)種群增長(zhǎng)和繁殖也有顯著影響。

聚維酮碘為環(huán)境外源性藥物，在魚(yú)、蝦、蟹、貝病害防治時(shí)作為消毒劑，有時(shí)會(huì)在養(yǎng)殖池塘中全池潑灑，使用劑量常為0.2～0.5 mg/L[3]，該劑量通常在經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)動(dòng)物的安全濃度范圍內(nèi)。在日常使用中，若只考慮到經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)動(dòng)物的安全性，而忽略了對(duì)輪蟲(chóng)等小型浮游動(dòng)物的影響，長(zhǎng)此以往，將會(huì)對(duì)養(yǎng)殖水環(huán)境中其他微小生物造成危害，進(jìn)而影響水域生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。因此，生產(chǎn)中要根據(jù)實(shí)際情況酌情使用聚維酮碘。

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Toxicity of povidone-iodine to rotiferBrachionusplicatilis

LIU Qing, CUI Yan-chao, LI Shuang-yu, FU Quan-jie, CHUAI Jie

(Key Laboratory of Hydrobiology in Liaoning Province, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China)

Abstract：The acute and chronic toxicity of povidone-iodine to rotifer Brachionus plicatilis was studied to evaluate influence of povidone-iodine on survival, growth and reproduction of the rotifer. The result showed that the LC50of this chemical was 2.25 mg/L in 24 h, and 1.99 mg/L in 48 h, with safe concentration of 0.47 mg/L by Turubell formula. The life-span, life-time fecundity, number of broods per female and number of young per brood of the rotifer were found to be decrease with the increase in povidone-iodine concentration, and the development of pre-reproduction was extended with the increase in povidone-iodine concentration, with significant difference between the high concentration group(0.5 mg/L) and the control group and between the other groups (P<0.05). The intrinsic rate of increase(rm)，net productive rate(R0) and finite rate of increase(λ) were shown to be decrease with the increase in povidone-iodine concentration, and the mean generation time(T) was increased with the increase in concentration. There were significant difference in rm,λ, and T between high povidone-iodine concentration group (0.5 mg/L) and the control group and between the other groups (P<0.05). The findings indicated that the low concentration of povidone-iodine (0.1 mg/L) showed no significant effect on survival and development of pre-reproduction of the rotifer (P>0.05), but had significant impact on growth and reproduction of the rotifer(P<0.05).

Key words：Brachionus plicatilis; povidone-iodine; toxicity test; safe concentration

作者簡(jiǎn)介：劉青(1965—), 女, 副教授。E-mail:liuqing@dlou.edu.cnmg/L

基金項(xiàng)目：國(guó)家海洋公益項(xiàng)目(201305005)；國(guó)家海洋局近岸海域生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目(201310)

收稿日期：2015-01-05

中圖分類號(hào)：Q179.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：2095-1388(2015)02-0149-06

DOI：10.3969/J.ISSN.2095-1388.2015.02.007