鼻咽癌組織中轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a、HIF-1α蛋白及mRNA表達(dá)及意義

壽鑄，何丹( 重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院，重慶400;重慶市第三人民醫(yī)院)

鼻咽癌組織中轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a、HIF-1α蛋白及mRNA表達(dá)及意義

壽鑄1，何丹2
( 1重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院，重慶401120;2重慶市第三人民醫(yī)院)

摘要:目的觀察鼻咽癌( NPC)組織中轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a、缺氧誘導(dǎo)因子1α( HIF-1α)蛋白及mRNA的表達(dá)，并探討其意義。方法選擇NPC患者48例，均留取NPC活檢組織( NPC組) ;健康體檢者15例，均留取正常鼻咽黏膜組織(對(duì)照組)。采用免疫組織化學(xué)方法觀察兩組轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a、HIF-1α蛋白陽(yáng)性表達(dá)，RT-PCR方法檢測(cè)FOXO3a、HIF-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量，分析FOXO3a、HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)與NPC患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。結(jié)果NPC組、對(duì)照組FOXO3a蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為50.0%、80.0% ( P＜0.05)，HIF-1α蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為75.0%、33.3%( P＜0.05)。NPC組FOXO3a mRNA、HIF-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.47±0.07、0.61±0.12，對(duì)照組分別為0.56±0.06、0.69±0.09;兩組比較，P均＞0.05。FOXO3a陽(yáng)性表達(dá)與NPC患者臨床分期、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)( P均＜0.05)，HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)與NPC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)( P均＜0.05)。結(jié)論NPC組織中HIF-1α蛋白陽(yáng)性表達(dá)率增加、FOXO3a蛋白陽(yáng)性表達(dá)率降低，二者表達(dá)變化可能與NPC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

關(guān)鍵詞:鼻咽腫瘤;鼻咽癌;轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a;缺氧誘導(dǎo)因子-1α

鼻咽癌( NPC)是中國(guó)南方地區(qū)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生與EB病毒、遺傳因素、多種癌基因和抑癌基因的相互作用以及環(huán)境和飲食等因素有關(guān)。FOXO3a是Forkhead轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，與細(xì)胞代謝、細(xì)胞周期、凋亡調(diào)控、腫瘤發(fā)生等相關(guān)。缺氧誘導(dǎo)因子1α( HIF-1α)高表達(dá)在人體惡性腫瘤中廣泛存在。本研究觀察NPC組織中轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a、HIF-1α蛋白及mRNA表達(dá)，并探討其意義。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇2012年6月～2014年7月重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院五官科與重慶市第三人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科收治NPC患者48例，均留取NPC活檢組織( NPC組)，病理檢查均證實(shí)為低分化鱗狀細(xì)胞癌，均未接受過任何放療和化療，均有完整的臨床和病理資料。其中男33例，女15例;年齡31～67歲，中位年齡47歲;參照“NPC 2008分期標(biāo)準(zhǔn)”進(jìn)行臨床分期:Ⅰ期7例，Ⅱ期7例，Ⅲ期14例，Ⅳ期20例。健康體檢者15例，均留取正常鼻咽黏膜組織標(biāo)本作為對(duì)照組，男10例，女5例;年齡34～63歲，中位年齡44歲。兩組性別、年齡具有可比性。

1.2 FOXO3a與HIF-1α蛋白表達(dá)檢測(cè)采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)兩組FOXO3a、HIF-1α表達(dá)，步驟參照試劑盒說明書。已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。FOXO3a蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)，HIF-1α蛋白定位于細(xì)胞核，陽(yáng)性表達(dá)均呈棕黃色。無陽(yáng)性細(xì)胞為－，陽(yáng)性細(xì)胞比例＜25%為+，陽(yáng)性細(xì)胞比例25%～75%為++，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例＞75%為+ + +。+、+ +、+ + +均記為陽(yáng)性表達(dá)。

1.3 FOXO3a、HIF-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)采用RT-PCR方法。使用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物: FOXO3a上游引物為5'-CTTCAAGGATAAGGGCGACAG-3'，下游引物為5'-CGTCCTGGACTTCATCCAAC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為437 bp; HIF-1α上游引物為5'-TATGACCTGCTTGGTGCTGA-3'，下游引物為5'-GGGAGAAAATCAAGTCGTGC-3'，擴(kuò)增大小為413 bp。內(nèi)參GAPDH上游引物為5'-ATGACCCCTTCATTGACCTCA-3'，下游引物為5'-GAGATGATGACCCTTTTGGCT-3'，擴(kuò)增大小為265 bp。使用RT-PCR試劑盒(寶生物工程有限公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為: 95℃預(yù)變性5 min; 95℃變性45 s，57℃退火50 s，72℃延伸1 min，40個(gè)

循環(huán); 72℃延伸7 min。取5 μL PCR產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像儀分析圖像。表達(dá)量以相對(duì)表達(dá)水平表示，即目的基因條帶光密度值與相應(yīng)GAPDH條帶光密度值的比值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以珋x±s表示，比較采用方差分析;等級(jí)資料比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn);相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1兩組FOXO3a、HIF-1α蛋白陽(yáng)性表達(dá)比較對(duì)照組FOXO3a陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞核，NPC組主要定位于細(xì)胞質(zhì);兩組HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)均主要定位于細(xì)胞核(插頁(yè)Ⅰ圖5)。NPC組、對(duì)照組FOXO3a蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為50.0%、80.0% ( P ＜0.05)，HIF-1α蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為75.0%、33.3%( P＜0.05)。

2.2 FOXO3a、HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)與NPC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系FOXO3a陽(yáng)性表達(dá)與NPC患者臨床分期、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)( P均＜0.05)，與性別、年齡無關(guān)( P均＞0.05) ; HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)與NPC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)( P均＜0.05)，與性別、年齡、臨床分期和T分期無關(guān)( P均＞0.05)。見表1。

表1　 FOXO3a、HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)與NPC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

2.3兩組FOXO3a mRNA、HIF-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量比較NPC組FOXO3a mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.47 ±0.07，對(duì)照組為0.56±0.06;兩組比較，P＞0.05。NPC組HIF-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.61±0.12，對(duì)照組為0.69±0.09;兩組比較，P＞0.05。

2.4 NPC組織中FOXO3a與HIF-1α蛋白陽(yáng)性表達(dá)的關(guān)系NPC組織中FOXO3a與HIF-1α蛋白陽(yáng)性表達(dá)呈負(fù)相關(guān)( r =－0.667，P＜0.01)。

3　討論

FOXO3a是Forkhead轉(zhuǎn)錄因子家族中的重要一員，與細(xì)胞凋亡、周期調(diào)控，腫瘤的發(fā)生發(fā)展及血管生成等密切相關(guān)［1～3］。FOXO3a在正常情況下定位于細(xì)胞核內(nèi)，在生長(zhǎng)因子等各種刺激下，F(xiàn)OXO3a可發(fā)生磷酸化，促使其從細(xì)胞核移位至細(xì)胞質(zhì)，導(dǎo)致FOXO3a轉(zhuǎn)錄活性受到抑制［4］。研究發(fā)現(xiàn)，許多人類腫瘤中普遍存在FOXO3a活性缺失［5］。FOXO3a在卵巢腫瘤中呈低表達(dá)［6］，在前列腺癌細(xì)胞中主要存在于細(xì)胞質(zhì)，高等級(jí)前列腺癌組織中FOXO3a表達(dá)水平明顯低于低等級(jí)前列腺癌組織［7］;通過FOXO3a-siRNA干擾下調(diào)乳腺癌MDAMB細(xì)胞系FOXO3a表達(dá)，可引起癌細(xì)胞增殖和裸鼠腫瘤生成［4］;在口腔鱗狀細(xì)胞癌中轉(zhuǎn)染FOXO3a可導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)G1期阻滯和凋亡［8］。本研究顯示，F(xiàn)OXO3a在正常鼻咽黏膜組織主要定位于細(xì)胞核，在NPC組織中主要定位于細(xì)胞質(zhì)，NPC組織中FOXO3a陽(yáng)性表達(dá)率低于正常鼻咽黏膜組織，由此推測(cè)FOXO3a細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)位及表達(dá)下調(diào)可能促進(jìn)NPC的發(fā)生。但是，本研究中NPC和鼻咽正常黏膜組織中FOXO3a mRNA表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測(cè)NPC發(fā)生過程中FOXO3a在轉(zhuǎn)錄水平無明顯變化，其主要在蛋白質(zhì)水平對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)功能發(fā)揮調(diào)控作用。研究表明，F(xiàn)OXO3a的活性調(diào)節(jié)主要通過磷酸化、乙酰化、泛素化等轉(zhuǎn)錄后修飾，蛋白質(zhì)水平是其主要調(diào)節(jié)路徑，而其基因水平并無明顯變化［1～3］。但是，Karger等［9］發(fā)現(xiàn)，甲狀腺癌組織FOXO3a mRNA水平較正常對(duì)照組織降低;可能與腫瘤類型及樣本量不同有關(guān)。Fei等［6］研究發(fā)現(xiàn)，卵巢組織中FOXO3a表達(dá)與腫瘤等級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)OXO3a表達(dá)與NPC臨床分期、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān);提示FOXO3a可能與NPC的發(fā)生、發(fā)展有一定聯(lián)系。

細(xì)胞缺氧已經(jīng)被證明與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、預(yù)后密切相關(guān)。缺氧誘導(dǎo)因子1( HIF-1)由HIF-1α、HIF-1α亞基組成，其中HIF-1α為結(jié)構(gòu)亞基，持續(xù)表達(dá); HIF-1α是調(diào)節(jié)亞基，受氧的調(diào)節(jié)，決定HIF-1活性［10］。研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α是一些腫瘤相關(guān)基因的重要調(diào)控點(diǎn)［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α蛋白在NPC組織中表達(dá)高于正常鼻咽黏膜組織，與其他研究結(jié)果一致［12，13］;此外，HIF-1α mRNA在NPC組織與正

常鼻咽黏膜組織中的表達(dá)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;可能原因?yàn)镠IF-1α的維持和降解由泛素蛋白酶體系統(tǒng)控制，蛋白質(zhì)水平是其主要調(diào)控方式［14］。研究指出，HIF-1α表達(dá)與NPC臨床分期、T分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)［13］。但本研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)與NPC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)。造成結(jié)果差異的原因可能是標(biāo)本獲取方式或免疫組化分析方法不同。

Bakker等［15］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO3a可通過刺激CITED2，抑制HIF-1α引導(dǎo)的凋亡; Emerling等［16］研究結(jié)果顯示，PTEN缺失可通過抑制FOXO3a活性，增加HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性;抑制P38α可以通過調(diào)節(jié)FOXO3a、HIF-1α表達(dá)而抑制結(jié)腸癌的腫瘤生成［17］。本研究觀察到NPC組織中FOXO3a與HIF-1α表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，但二者相關(guān)的具體機(jī)制還不清楚。

總之，NPC組織中HIF-1α蛋白陽(yáng)性表達(dá)率升高、FOXO3a蛋白陽(yáng)性表達(dá)率降低，二者表達(dá)變化可能與NPC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

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收稿日期:( 2014-11-04)

通信作者:何丹，E-mail: 414011266@ qq.com

文章編號(hào):1002-266X( 2015) 28-0073-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:B

中圖分類號(hào):R739.63

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.28.031