用于檢測(cè)胃蛋白酶原、胃泌素-17的血漿樣本保存條件探討

姚麗娟，羅以勤，孫安源，卜國(guó)平，王力(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院，合肥230001)

用于檢測(cè)胃蛋白酶原、胃泌素-17的血漿樣本保存條件探討

姚麗娟，羅以勤，孫安源，卜國(guó)平，王力
(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院，合肥230001)

摘要:目的探討用于檢測(cè)胃蛋白酶原( PG)、胃泌素-17( G-17)的血漿樣本的保存條件。方法血漿樣本180例份，采用ELISA雙抗體夾心法定量檢測(cè)血漿PG-Ⅰ、PG-Ⅱ、G-17，作為第1天結(jié)果(對(duì)照)。將剩余血漿樣本隨機(jī)分為1、2組，每組90份;每組又分為血漿未分離組(離心后未分離血漿)、血漿分離組(離心后取血漿)和穩(wěn)定劑組(離心后取血漿，并加入穩(wěn)定劑)，每組各30份。將各組每個(gè)樣本平均分裝6管后分別置于室溫、4℃和－20℃環(huán)境下保存，每天固定時(shí)間取1組樣本檢測(cè)PG-Ⅰ、PG-Ⅱ，取2組樣本檢測(cè)G-17，均連續(xù)檢測(cè)7 d(包括第1天)。將室溫、4℃、－20℃溫度下保存不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)血漿PG-Ⅰ、PG-Ⅱ、G-17濃度與其保存第1天時(shí)濃度比較，將P＞0.05的天數(shù)作為穩(wěn)定性維續(xù)時(shí)間。結(jié)果血漿未分離組室溫下PG-Ⅰ穩(wěn)定性維持2 d，PG-Ⅱ?yàn)? d，G-17為1 d; 4℃時(shí)分別為5、7、3 d;－20℃時(shí)分別為4、3、2 d。血漿分離組室溫下PG-Ⅰ穩(wěn)定性維持7 d，PG-Ⅱ?yàn)? d，G-17為2 d; 4℃時(shí)分別為5、7、5 d;－20℃時(shí)分別為5、7、6 d。穩(wěn)定劑組室溫下PG-Ⅰ穩(wěn)定性維持7 d，PG-Ⅱ?yàn)? d，G-17為7 d; 4℃時(shí)分別為5、6、4 d;－20℃時(shí)分別為7、5、4 d。結(jié)論在臨床標(biāo)本7 d保存期內(nèi)，PG和G-17檢測(cè)樣本推薦使用血漿分離后低溫保存，如使用穩(wěn)定劑，推薦血漿分離后室溫保存。

關(guān)鍵詞:血漿;胃蛋白酶原;胃泌素-17;室溫;穩(wěn)定劑

Storage conditions for plasma samples of pepsinogen and gastrin-17

YAO Li-juan，LUO Yi-qin，SUN An-yuan，BU Guo-ping，WANG Li
( The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001，China)

Abstract:Objective To investigate the storage conditions for plasma samples of pepsinogen ( PG) and gastrin-17 ( G-17).Methods A total of 180 plasma samples were collected to detect PG-Ⅰ，PG-Ⅱand G-17 as the first day's consequence ( the control group) by ELISA double antibody sandwich method.The remaining samples were divided into group 1 and group 2 with 90 samples in each.Each group was equally divided into the non-separated group with upper layer which was plasma after centrifugation，the separated group with only plasma after centrifugation and the stabilizer group with plasma and stabilizer，30 cases in each group.Every sample in each group was packaged into 6 pipes which were separately stored at room temperature，4℃and－20℃，and we took the samples from group 1 to detect PG-Ⅰand PG-Ⅱ，or G-17 in the group 2 at the same time for 7 days.The concentrations of PG-Ⅰ，PG-Ⅱand G-17 from non-separated，separated and stabilizer groups in the different storage temperatures at different time were compared with the consequences of the first day，and the days of P＞0.05 was taken as the maintain time of stability.Results In the non-separated group，the plasma PG-Ⅰ，PG-Ⅱand G-17 maintained the levels for 2 days，7 days and 1 day at room temperature; 5 days，7days and 3 days at 4℃; and 4 days，3 days and 2 days at－20℃.In the separated group，the plasma PG-Ⅰ，PG-Ⅱand G-17 could maintain the levels for 7 days，6 days and 2 days at room temperature; 5 days，7days and 5 days at 4℃; and 5 days，7 days and 6 days at－20℃.The plasma PG-Ⅰ，PG-Ⅱand G-17 in the stabilizer group could maintain the levels for 7 days，7 days and 7 days at room temperature; 5 days，6 days and 4 days at 4℃; and 7 days，5 days and 4 days at －20℃.Conclusion In 7 days of storage for clinic detection，PG and G-17 detection samples are recommended to storage in low temperature after centrifugation，and are recommended to preserve at room temperature if we add stabilizer.

Key words:plasma; pepsinogen; gastrin-17; room temperature; stabilizer

胃蛋白酶原( PG)和胃泌素-17( G-17)在血中濃度的變化可以準(zhǔn)確反映胃黏膜消化腺分泌功能的改變，并與胃黏膜組織學(xué)變化和病變程度高度相關(guān)［1～4］，有望成為胃癌的早期診斷標(biāo)志物。目前，臨床上PG和G-17的檢測(cè)方法較為成熟，但有關(guān)樣本保存方式、時(shí)間和溫度等對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響報(bào)道較少。本研究分析用于檢測(cè)PG、G-17的血漿樣本的保存條件。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇2012年1月～2014年12月安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院體檢、門診或住院患者共180例，男104例、女76例，年齡22～87( 48.85± 13.85)歲。

1.2觀察方法研究對(duì)象均空腹10 h后采集靜脈血5 mL，即時(shí)上下顛倒試管5～6次，混勻，30 min內(nèi)離心分離出血漿，取部分血漿采用ELISA雙抗體夾心法定量檢測(cè)血漿PG-Ⅰ、PG-Ⅱ、G-17，作為第1天結(jié)果(對(duì)照)。將剩余血漿樣本隨機(jī)分為1、2組，每組90份;每組又分為血漿未分離組(離心后未分離出血漿)、血漿分離組(離心后吸取1 mL血漿裝入EP管)和穩(wěn)定劑組(離心后吸取1 mL血漿，并加入穩(wěn)定劑2滴)，每組各30例份。將各組樣本分別置于室溫、4℃和－20℃環(huán)境下保存，每天固定時(shí)間1組取5例份檢測(cè)PG-Ⅰ、PG-Ⅱ，2組取5例份檢測(cè)G-17，均連續(xù)檢測(cè)7 d(包括第1天)。PG-Ⅰ、PG-Ⅱ、G-17檢測(cè)嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后30 min內(nèi)450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)光密度( OD)值，根據(jù)已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算樣本濃度。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以珋x±s表示，組內(nèi)兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。將三組在室溫、4℃、－20℃溫度下保存不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)血漿PG-Ⅰ、PG-Ⅱ、G-17濃度與其保存第1天時(shí)濃度比較，P ＞0.05的天數(shù)作為穩(wěn)定性持續(xù)時(shí)間。

2　結(jié)果

三組在室溫、4℃、－20℃溫度下保存不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)血漿PG-Ⅰ、PG-Ⅱ、G-17濃度變化見表1;三組各溫度下穩(wěn)定性持續(xù)時(shí)間見表2。

表1　三組在室溫、4℃、－20℃溫度下保存不同時(shí)間時(shí)血漿PG-Ⅰ、PG-Ⅱ、G-17濃度變化(±s)

表1　三組在室溫、4℃、－20℃溫度下保存不同時(shí)間時(shí)血漿PG-Ⅰ、PG-Ⅱ、G-17濃度變化(±s)

注:與同組保存第1天比較，*P＜0.05。

組別　PG-Ⅰ(μg/L)室溫4℃　?。?0℃PG-Ⅱ(μg/L)室溫4℃　　－20℃G-17( pmol/L)室溫4℃　?。?0℃血漿未分離組1 d　127.74±47.89 127.74±47.89 127.74±47.89　 12.78±3.78 12.78±3.78 12.78±3.78　 21.08±4.44 21.08±5.44 21.08±5.44 2 d　137.96±51.72 132.71±49.83 132.71±49.83　 10.61±6.46 14.70±8.94 11.63±3.08　 11.55±3.71*16.57±4.60 16.68±4.56 3 d　160.95±40.34*136.38±31.19 121.36±35.50　 10.22±6.22 13.93±2.48 11.37±2.92　 6.48±1.51*15.81±3.83 12.03±3.50* 4 d　171.18±44.17*140.52±32.68 113.35±32.46　 9.97±2.07 12.14±3.39　 8.82±1.17*　3.56±0.23*12.65±2.06*9.08±2.93*5 d　183.82±38.80*148.18±35.56 102.19±28.31*9.71±3.91 11.12±2.77　 5.24±1.19*　2.07±0.09*9.91±1.67*6.54±1.71*6 d　189.06±30.88*157.12±28.90*91.97±34.48*9.33±3.68　 9.71±3.91　 4.09±0.49*　1.10±0.24*8.43±1.38*5.49±1.79*7 d　195.44±33.27*183.94±38.96*83.01±21.14*8.82±3.37*9.33±2.68　 1.40±0.86*　0.45±0.06*7.80±1.82*4.21±0.67*血漿分離組1 d　121.12±38.04 121.12±38.04 121.12±38.04　 10.39±2.65 10.39±2.65 10.39±3.65　 18.80±5.31 18.80±5.31 18.80±5.31 2 d　119.91±37.55 119.91±36.53 119.91±37.48　 16.11±3.86*11.64±3.57 12.78±3.41　 11.65±2.49 15.97±4.01 16.35±3.32 3 d　116.27±3.12　 115.06±3.63　 118.70±27.08　 13.51±2.95 11.22±3.27 11.53±2.50　 9.32±1.70*15.60±3.71 15.98±3.01 4 d　112.64±24.67 107.80±22.75 116.27±26.12　 12.16±2.95 11.01±2.11　 9.46±1.97　 7.89±1.43*13.91±3.33 15.60±2.71 5 d　109.01±23.23 102.95±30.83 105.37±31.79　 10.81±3.96 10.71±3.88　 8.63±1.35　 5.07±0.13*13.34±3.87 15.04±2.25 6 d　107.80±22.75 100.28±29.76*96.90±28.43*9.77±2.19　 9.98±2.35　 8.42±1.20　 4.32±0.52*12.59±3.25*13.34±3.87 7 d　105.40±21.83　 94.47±23.47*95.68±21.95*9.14±2.73　 9.67±2.12　 7.90±0.82　 3.95±0.21*12.22±3.95*12.77±2.42*穩(wěn)定劑組1 d　125.82±29.66 125.82±39.66 125.82±39.66　 10.56±2.25 10.56±2.25 10.56±2.25　 17.09±3.23 17.09±3.23 17.09±3.23 2 d　123.30±38.87 123.30±37.98 120.79±38.07　 10.88±2.47 10.46±2.18 14.37±3.86　 16.58±2.83 14.01±2.85 13.84±3.71 3 d　119.53±37.68 119.53±37.78 130.85±41.25　 10.35±2.10 10.14±2.96 12.78±2.77　 16.41±2.69 13.38±2.56 13.81±3.52 4 d　122.04±28.47 115.75±26.49 118.27±27.28　 11.30±2.76 11.83±2.12 10.35±2.10　 16.06±12.43 12.65±1.79 12.99±3.05 5 d　119.53±37.18 111.98±25.30 115.75±36.49　 10.77±2.39 13.31±3.13　 9.19±1.31　 15.72±2.17　 8.03±1.21*8.55±2.61*6 d　120.79±30.07 108.20±34.11*113.24±35.69　 12.47±4.55 14.05±3.64　 5.92±1.06*15.38±1.90　 5.64±0.36*7.00±1.42*7 d　129.59±20.85 103.17±32.52*111.98±35.30　 12.99±2.91 15.42±3.58*4.33±0.97*15.37±1.98　 3.76±0.91*6.49±1.03*

3　討論

血漿PG和G-17檢測(cè)可以提高早期胃癌的臨床診斷率，并能進(jìn)行胃癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估［5，6］。研究表明，低水平的血漿PG-Ⅰ、PG-Ⅰ/PG-Ⅱ( PGR)與萎縮性胃炎和胃癌的發(fā)生呈正相關(guān)［7］。血漿PG-Ⅰ、PG-Ⅱ、G-17升高與胃幽門螺桿菌( HP)感染和消化性潰瘍關(guān)聯(lián)密切。有文獻(xiàn)報(bào)道，可將血漿PG-Ⅱ＜9.47μg/L或治療后血漿PG-Ⅱ水平降低1/4作

為判斷HP感染治愈的標(biāo)準(zhǔn)［8］。當(dāng)內(nèi)窺鏡下切除十二指腸腫瘤后，PG-Ⅱ水平顯著降低［9］。但是，血漿樣本的轉(zhuǎn)運(yùn)和保存條件、問(wèn)題樣本的復(fù)檢以及集中批量檢測(cè)都可能對(duì)PG、G-17檢測(cè)數(shù)值造成影響［10］。

表2　三組在室溫、4℃、－20℃溫度下穩(wěn)定性持續(xù)時(shí)間( d)

一般來(lái)說(shuō)，隨著保存時(shí)間的增加，樣本中PG-Ⅰ和PG-Ⅱ抗原效價(jià)均會(huì)降低，但溶血導(dǎo)致血紅蛋白( Hb)溢出，Hb本身具有類似過(guò)氧化物酶的性質(zhì)，能非特異性結(jié)合固相使底物顯色加深，假性增加PG-Ⅰ、PG-Ⅱ濃度。本研究中血漿未分離組在血漿離心析出分層后，并沒(méi)有將上層的血漿和下層的血細(xì)胞分離，檢測(cè)時(shí)仍采用上層的血漿檢測(cè)，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，會(huì)出現(xiàn)溶血并逐漸加重。在室溫和4℃條件下，不同保存時(shí)間下血漿未分離組PG-Ⅰ呈現(xiàn)連續(xù)上升趨勢(shì)，可能是溶血后血細(xì)胞內(nèi)容物溢出，進(jìn)入血液的細(xì)菌繁殖代謝產(chǎn)生的非特異性吸附導(dǎo)致; 但PG-Ⅱ濃度變化卻較小，可能是因?yàn)榧词勾嬖诜翘禺愋晕降挠绊?，但其本身的基?shù)較低，因此影響也不明顯;－20℃溫度下PG-Ⅰ、PG-Ⅱ均呈下降趨勢(shì)，可能與低溫降低細(xì)菌繁殖代謝速度，延長(zhǎng)其穩(wěn)定性有關(guān)［11］。與血漿未分離組比較，不同保存溫度下血漿分離組的PG-Ⅰ、PG-Ⅱ水平變化幅度小，其穩(wěn)定性均能維持5～7 d，說(shuō)明分離血漿標(biāo)本可避免血細(xì)胞對(duì)結(jié)果的影響，且溫度對(duì)7 d內(nèi)血漿標(biāo)本內(nèi)PG濃度的影響不大。在血漿樣本中加入穩(wěn)定劑(酶抑制劑)，在室溫和4℃溫度下PG-Ⅰ和PG-Ⅱ濃度可保持5～7 d的穩(wěn)定，與穩(wěn)定劑抑制蛋白降解有關(guān); －20℃溫度下PG-Ⅱ在保存第2天出現(xiàn)短暫上升，可能與實(shí)驗(yàn)中所用試劑和固相板條產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差有關(guān)。

G-17是由胃竇和十二指腸的G細(xì)胞分泌的一種激素［10］，極易降解，血漿未分離條件下幾乎不能進(jìn)行樣本保存，即使低溫延長(zhǎng)其2～3 d的穩(wěn)定性，G-17水平仍然有較大幅度的降低。本研究觀察到，血漿未分離組G-17在室溫、4℃、－20℃溫度下僅維持1～3 d的穩(wěn)定性;血漿分離組G-17穩(wěn)定性仍較低，但4℃、－20℃溫度下可維持5～6 d的穩(wěn)定性，可能與低溫減緩G-17降解有關(guān)。穩(wěn)定劑組室溫條件下G-17濃度可穩(wěn)定維持7 d，與室溫條件下穩(wěn)定劑抑制G-17降解有關(guān); 4℃、－20℃溫度下僅維持4 d，原因可能是低溫使穩(wěn)定劑的成分改變，不利于G-17穩(wěn)定保存。

在本研究設(shè)計(jì)之初，曾考慮將穩(wěn)定劑直接加入到不分離的血漿中觀察其是否能更便捷地保存樣本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這樣會(huì)導(dǎo)致重度溶血，嚴(yán)重影響PG-Ⅰ、PG-Ⅱ、G-17檢測(cè)結(jié)果，甚至測(cè)不出數(shù)據(jù)。此外，還發(fā)現(xiàn)分離血漿加入穩(wěn)定劑后置于4℃或－20℃保存，第2天即出現(xiàn)少量白色絮狀沉淀，而室溫放置則沒(méi)有沉淀出現(xiàn)，可能穩(wěn)定劑的性狀不利于低溫保存。

總之，在臨床標(biāo)本7 d保存期內(nèi)，PG和G-17推薦使用血漿分離后低溫保存;如使用穩(wěn)定劑，推薦血漿分離后室溫保存。

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收稿日期:( 2015-03-25)

作者簡(jiǎn)介:第一姚麗娟( 1978-)，女，主管檢驗(yàn)師，主要研究方向?yàn)榕R床檢驗(yàn)、分子生物學(xué)診斷等。E-mail: chinavip166@163.com

基金項(xiàng)目:安徽省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目( 11040606M209)。

文章編號(hào):1002-266X( 2015) 28-0018-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號(hào):R446.11

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.28.006