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    體外高糖環(huán)境對H9C2心肌細胞增殖的影響及其機制探討

    2016-01-20 13:55:30盧海龍楊榮禮李雷徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院江蘇徐州221006
    山東醫(yī)藥 2015年28期
    關(guān)鍵詞:高糖

    盧海龍,楊榮禮,李雷(徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院,江蘇徐州221006)

    體外高糖環(huán)境對H9C2心肌細胞增殖的影響及其機制探討

    盧海龍,楊榮禮,李雷
    (徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院,江蘇徐州221006)

    摘要:目的觀察體外高糖環(huán)境對H9C2心肌細胞增殖的影響,并探討其作用機制。方法將體外培養(yǎng)鼠胚心肌細胞H9C2隨機分為四組,1組培養(yǎng)液中加入終濃度為5.5 mmol/L的D-葡萄糖,2組加入終濃度為27.5 mmol/L的甘露醇和5.5 mmol/L的D-葡萄糖,3組加入終濃度為33 mmol/L的D-葡萄糖,4組加入終濃度為2 μmol/L的經(jīng)典瞬時受體蛋白( TRPC)阻滯劑SKF96365和終濃度為33 mmol/L的D-葡萄糖。分別在培養(yǎng)24、48、72 h時,采用CCK8法測定細胞增殖率,實時定量PCR法測定經(jīng)典瞬時受體蛋白6( TRPC6)、活化T細胞核因子3( NFAT3) mRNA; 72 h時采用Western blotting法檢測TRPC6及NFAT3蛋白。結(jié)果培養(yǎng)72 h時1、2、3、4組細胞增殖率分別為105.88%±10.01%、98.67%±8.97%、28.55%±6.32%、49.18%±7.14%,3組較1、2組降低( P均<0.05),4組較3組增高( P<0.05) ; 3組TRPC6、NFAT3 mRNA及蛋白相對表達量較1、2組增加( P均<0.05),4組較3組下降( P均<0.05)。結(jié)論高糖抑制心肌細胞增殖;促進心肌細胞TRPC6表達,導致TRPC通道開放,啟動鈣調(diào)神經(jīng)素( CaN)/活化T細胞核因子( NFAT)通路,可能是其作用機制。

    關(guān)鍵詞:糖尿病心肌病;高糖;鼠胚心肌細胞株H9C2;經(jīng)典瞬時受體蛋白6;活化T細胞核因子3

    糖尿病心肌病( DCM)早期表現(xiàn)為舒張性左心功能不全,晚期容易并發(fā)惡性心律失常、心力衰竭、甚至猝死[1,2]。迄今為止,DCM發(fā)病機制仍不完全明確,治療未有實質(zhì)性突破[3]。研究發(fā)現(xiàn),心肌細胞內(nèi)鈣超載與DCM的發(fā)生有關(guān)[4]。高血糖是糖尿病患者的主要特征之一,能夠直接損傷心肌細胞,引起心肌病變[5]。但是,高血糖對心肌細胞內(nèi)鈣超載是否有促進作用及其可能機制,文獻報道較少。2012年9月~2013年7月,本研究以體外培養(yǎng)的鼠胚心肌細胞H9C2為研究對象,觀察體外高糖環(huán)境對細胞形態(tài)及增殖的影響,并探討其作用機制。

    1 材料與方法

    1.1材料鼠胚心肌細胞H9C2購自中國科學院上海生命科學研究院。DMEM培養(yǎng)基、D-葡萄糖、胎牛血清( FBS) (美國Gibco公司),細胞計數(shù)盒CCK-8(日本Dojindo Lab),細胞總RNA提取試劑盒、核蛋白提取試劑盒、經(jīng)典瞬時受體蛋白6( TRPC6)和GAPDH引物、DNA marker(上海生物工程有限公司),實時定量PCR試劑盒(大連TaKaRa公司),兔抗大鼠TRPC6單克隆抗體、兔抗大鼠活化T細胞核因子3 ( NFAT3)單克隆抗體、經(jīng)典瞬時受體通道蛋白( TRPC)通道阻滯劑SKF96365(以色列Alomone Labs公司)。

    1.2細胞培養(yǎng)及分組處理H9C2細胞在含10% FBS的低糖( 5 mmol/L) DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),待細胞生長85%左右培養(yǎng)面積后,0.25%胰酶消化,1∶2傳代,8~9代細胞用于實驗。待細胞成對數(shù)生長后,調(diào)整細胞數(shù)為1×105/L,接種于6孔培養(yǎng)板,培養(yǎng)24 h;待細胞成融合狀態(tài)換用無血清低糖DMEM培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,使細胞呈靜止狀態(tài),隨機分為四組。1組:培養(yǎng)液中加入終濃度為5.5 mmol/L 的D-葡萄糖; 2組:培養(yǎng)液中加入終濃度為27.5 mmol/L的甘露醇和終濃度為5.5 mmol/L的D-葡萄糖; 3組:培養(yǎng)液中加入終濃度為33 mmol/L的D-葡萄糖; 4組:培養(yǎng)液中加入終濃度為2 μmol/L的SKF96365和終濃度為33 mmol/L的D-葡萄糖。

    1.3細胞存活率檢測將各組細胞接種于96孔培養(yǎng)板,分別在培養(yǎng)24、48、72 h時每孔加入CCK-8 10 μL和DMEM 90 μL,37℃、5% CO2條件下孵育1 h,采用酶標儀(λ= 450 nm)記錄各孔光密度( OD)值,計算細胞增殖率。細胞增殖率( %) = (處理組OD450-空白孔OD450)/(對照組OD450-空白孔

    OD450)×100%,每組設(shè)3個復孔,實驗重復3次。空白孔為未加細胞懸液的DMEM培養(yǎng)液,1組即對照組。

    1.4 TRPC6、NFAT3 mRNA檢測采用實時定量PCR方法。各組細胞分別在處理24、48、72 h提取細胞總RNA,測定RNA濃度。TRPC6引物序列:上游: 5'-GTCGGTGGTCATCAACTACAATC-3',下游: 5'-CCACATCCGCATCATCCTCAATT-3'; NFAT3引物序列:上游: 5'-ACAGAAGAGGGGGCGTCTC-3',下游: 5'-ACCAATAGGGGCAGCACCATA-3'; GAPDH引物序列:上游: 5'-ACGGCAAATTCAACGGCACAGTCA-3',下游: 5'-TGGGGGCATCGGCAGAAGG-3'。PCR反應條件: 95℃變性5 min、95℃30 s、58℃30 s、70℃30 s,40個循環(huán)。實驗重復3次。以GAPDH為內(nèi)參照,2-ΔΔCt法計算各組TRPC6、NFAT3 mRNA相對表達量。

    1.5 TRPC6、NFAT3蛋白檢測各組細胞在培養(yǎng)72 h時(根據(jù)前期實驗結(jié)果確定時間點)采用0.25%胰酶常規(guī)消化并收集,采用Western blotting法檢測TRPC6( 1∶500)、NFAT3( 1∶2 000)蛋白。具體步驟參照試劑盒說明書。實驗重復3次,以GAPDH作為內(nèi)參照。采用Quantity-One軟件分析各組TRPC6、NFAT3蛋白的相對表達量。

    1.6統(tǒng)計學方法采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料采用珋x±s表示,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1各組細胞增殖率比較在培養(yǎng)72 h時,3組細胞增殖率較1、2組降低( P均<0.05),4組較3組增高( P<0.05) ; 3組72 h時細胞增殖率較48 h時降低( P<0.05) ; 1、2組細胞增殖率在各時間點均無明顯差異( P均>0.05) ;見表1。

    表1 四組不同時間點細胞增殖率比較( %,±s)

    表1 四組不同時間點細胞增殖率比較( %,±s)

    注:與同時間點1、2組比較,*P均<0.05;與同時間點3組比較,△P<0.05;與同組48 h比較,#P<0.05。

    組別 細胞增殖率24 h 48 h 72 h 1組25.72±1.89  65.77±6.87  105.88±10.01 2組 22.55±2.02  61.92±5.99  98.67±8.97 3組 16.78±1.36  43.22±4.59  28.55±6.32* #4組 18.79±2.65  55.43±6.01  49.18±7.14△

    2.2各組TRPC6、NFAT3 mRNA相對表達量比較

    在培養(yǎng)72 h時,3組TRPC6、NFAT3 mRNA相對表達量較1、2組增加( P均<0.05),4組較3組下降( P均<0.05) ; 3組各時間點比較,P均<0.05;見表2。

    表2 四組不同時間點TRPC6、NFAT3 mRNA相對表達量比較(±s)

    表2 四組不同時間點TRPC6、NFAT3 mRNA相對表達量比較(±s)

    注:與同時間點1、2組比較,*P均<0.05;與同時間點3組比較,△P<0.05;與同組各時間點比較,#P<0.05。

    組別TRPC6 mRNA 24 h 48 h 72 h NFAT3 mRNA 24 h 48 h 72 h 1組 1.03±0.13 0.96±0.09 1.02±0.11 0.97±0.17 0.99±0.13 1.06±0.19 2組 1.07±0.08 1.12±0.15 1.09±0.26 1.14±0.14 1.11±0.11 1.13±0.18 3組 7.23±0.52 11.39±1.17 16.15±1.49* # 5.23±1.43 9.88±1.96 14.44±2.09* #4組 4.64±0.35 6.79±0.44 10.13±0.69# 2.94±0.24 5.32±0.94 8.97±1.73△

    2.3各組TRPC6、NFAT3蛋白相對表達量比較在培養(yǎng)72 h時,1、2、3、4組TRPC6蛋白相對表達量分別為0.302±0.017、0.351±0.023、1.874± 0.124、1.214±0.097; NFAT3蛋白相對表達量分別為0.247±0.026、0.298±0.034、1.199±0.104、0.656±0.038; 3、4組均高于1、2組( P均<0.05),4組均低于3組( P均<0.05)。

    3 討論

    研究發(fā)現(xiàn),持續(xù)高血糖狀態(tài)會造成心肌細胞胞質(zhì)內(nèi)、線粒體內(nèi)Ca2 +濃度明顯升高,導致心肌細胞舒縮功能障礙及凋亡增加[5,6]。在病理狀態(tài)下,胞外鈣的內(nèi)流和胞內(nèi)鈣庫的釋放則造成細胞質(zhì)內(nèi)鈣超載[7]。細胞外鈣內(nèi)流主要通過電壓門控鈣信道( VOC)、受體門控鈣通道( ROC)和鈣庫操縱性鈣通道( SOC),其中VOC和ROC主要介導胞外鈣在短時間內(nèi)大量內(nèi)流,SOC則介導小量持續(xù)鈣內(nèi)流。但是,組成SOC及ROC的具體分子實體仍不十分明確。研究發(fā)現(xiàn),TRPC的同源異構(gòu)體是構(gòu)成細胞膜上SOC和ROC的分子實體,TRPC通道的啟動開放可引起心肌細胞內(nèi)Ca2 +濃度變化,通過鈣調(diào)神經(jīng)素( CaN)/NFAT信號通路在細胞內(nèi)Ca2 +增加誘導的心肌重構(gòu)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,進而觸發(fā)心肌肥大相關(guān)信號轉(zhuǎn)導,引起心肌重構(gòu)和病理性肥厚[8]。Onohara等[9]發(fā)現(xiàn),血管緊張素Ⅱ( AngⅡ)誘導的新生大鼠心肌細胞肥大模型TRPC3、TRPC6 mRNA表達均顯著上調(diào);而敲除TRPC3 或TRPC6中的任何一個,都會明顯抑制心肌細胞肥大效應; PLC介導的1,2-二酰甘油( DAG)的生成增多對上述過程有直接啟動作用。TRPC3與TPRC6均可直接受DAG的啟動開放,TRPC3與TRPC6通道之間有協(xié)同關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn),TRPC6表達程度與心肌細胞

    肥大密切相關(guān),并且證實這種促進心肌細胞肥大的效應是由TRPC介導的Ca2 +-NFAT信號通路完成[7]。在CaN被持續(xù)啟動后,小鼠心肌細胞膜TRPC6表達量明顯增加;在人類心力衰竭的心肌細胞中,TRPC6亦出現(xiàn)類似過表達。Nishida等[10]研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)皮素-1( ET-1)、AngⅡ刺激體外大鼠心肌細胞和心肌成纖維細胞,可以顯著提高TRPC6的表達水平;血小板凝結(jié)抑制劑Forskolin可以顯著下調(diào)TRPC6表達; ET-1的這種作用是由Gα12/13( G-12家族蛋白的亞單位)所介導的,并且這種作用通過NFAT的持續(xù)激活持續(xù)啟動。進一步研究發(fā)現(xiàn),過表達TRTRPC6的轉(zhuǎn)基因小鼠NFAT的轉(zhuǎn)錄活性增強,并參與Ca2 +-CaN/NFAT信號通路的正回饋機制,通過抑制5型磷酸二酯酶途徑抑制TRPC6表達活性增加造成的病理性心肌肥大[11]。高糖通過增加人類足突細胞黏連蛋白聚糖-4( SDC-4)和活性氧簇( ROS)的表達調(diào)節(jié)TRPC6的表達[12]。沒有基礎(chǔ)心臟病的Klotho基因缺陷小鼠會出現(xiàn)應激狀態(tài)下的心肌細胞肥大和心室重構(gòu);在健康成年小鼠的心肌細胞中,Klotho通過下調(diào)TRPC6而發(fā)揮心臟保護作用[13]。如果抑制Klotho基因缺陷小鼠TRPC6蛋白的表達,則可以阻止壓力誘導的心肌細胞重構(gòu)。進一步研究發(fā)現(xiàn),TRPC6高表達的小鼠會自發(fā)出現(xiàn)心肌重構(gòu);而Klotho過表達則可以明顯抑制TRPC6導致的心肌重構(gòu),延長小鼠生存期。Kinoshita等[14]證明,TPRC6蛋白是心鈉肽/腦鈉肽-鳥苷酸環(huán)化酶A ( ANP/BNP-GC-A)信號通路介導的心肌肥大作用的關(guān)鍵靶點。上述研究均證明,TRPC6在心肌肥厚的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的橋梁作用。

    高糖可使心肌細胞內(nèi)Na+-K+-ATP酶、Ca2 +-Mg2 +活性減低,使心肌細胞對鈣的攝取和輸送能力下降,導致心肌收縮功能受損。但高糖是否會通過上調(diào)TRPC蛋白的表達,導致胞內(nèi)鈣超載,從而啟動CaN/NFAT信號通路,目前國內(nèi)外尚無相關(guān)研究予以證實。

    H9C2細胞源于胚胎期大鼠心臟,具有心肌細胞的很多特性; 33 mmol/L葡萄糖作為研究心肌細胞高糖損傷的條件,已經(jīng)被廣泛證實并應用[15]。本研究將H9C2心肌細胞在33 mmol/L葡萄糖條件下培養(yǎng),細胞出現(xiàn)肥大、變性、壞死,增殖率降低,說明高糖造成細胞損傷。在培養(yǎng)72 h時,3組TRPC6、NFAT3 mRNA及蛋白相對表達量較1、2組增高;加用TRPC通道阻滯劑skf96365后,心肌細胞增殖率有所增加,TRPC6、NFAT3 mRNA及蛋白相對表達量下調(diào)。上述結(jié)果提示,在高糖條件下TRPC6可能通過CaN/NFAT3通路造成心肌細胞損傷。

    綜上所述,高糖抑制心肌細胞增殖,造成心肌細胞損傷;促進心肌細胞TRPC6表達,導致TRPC通道開放,引起心肌細胞內(nèi)鈣超載,啟動CaN/NFAT3通路,可能是其作用機制。

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    收稿日期:( 2014-12-30)

    通信作者:楊榮禮,E-mail: yrl6502@ sina.com

    基金項目:徐州市科技計劃項目( KC14SH110)。

    文章編號:1002-266X( 2015) 28-0024-03

    文獻標志碼:A

    中圖分類號:R541

    doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.28.008

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