• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    體外高糖環(huán)境對H9C2心肌細胞增殖的影響及其機制探討

    2016-01-20 13:55:30盧海龍楊榮禮李雷徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院江蘇徐州221006
    山東醫(yī)藥 2015年28期
    關(guān)鍵詞:高糖

    盧海龍,楊榮禮,李雷(徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院,江蘇徐州221006)

    體外高糖環(huán)境對H9C2心肌細胞增殖的影響及其機制探討

    盧海龍,楊榮禮,李雷
    (徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院,江蘇徐州221006)

    摘要:目的觀察體外高糖環(huán)境對H9C2心肌細胞增殖的影響,并探討其作用機制。方法將體外培養(yǎng)鼠胚心肌細胞H9C2隨機分為四組,1組培養(yǎng)液中加入終濃度為5.5 mmol/L的D-葡萄糖,2組加入終濃度為27.5 mmol/L的甘露醇和5.5 mmol/L的D-葡萄糖,3組加入終濃度為33 mmol/L的D-葡萄糖,4組加入終濃度為2 μmol/L的經(jīng)典瞬時受體蛋白( TRPC)阻滯劑SKF96365和終濃度為33 mmol/L的D-葡萄糖。分別在培養(yǎng)24、48、72 h時,采用CCK8法測定細胞增殖率,實時定量PCR法測定經(jīng)典瞬時受體蛋白6( TRPC6)、活化T細胞核因子3( NFAT3) mRNA; 72 h時采用Western blotting法檢測TRPC6及NFAT3蛋白。結(jié)果培養(yǎng)72 h時1、2、3、4組細胞增殖率分別為105.88%±10.01%、98.67%±8.97%、28.55%±6.32%、49.18%±7.14%,3組較1、2組降低( P均<0.05),4組較3組增高( P<0.05) ; 3組TRPC6、NFAT3 mRNA及蛋白相對表達量較1、2組增加( P均<0.05),4組較3組下降( P均<0.05)。結(jié)論高糖抑制心肌細胞增殖;促進心肌細胞TRPC6表達,導致TRPC通道開放,啟動鈣調(diào)神經(jīng)素( CaN)/活化T細胞核因子( NFAT)通路,可能是其作用機制。

    關(guān)鍵詞:糖尿病心肌病;高糖;鼠胚心肌細胞株H9C2;經(jīng)典瞬時受體蛋白6;活化T細胞核因子3

    糖尿病心肌病( DCM)早期表現(xiàn)為舒張性左心功能不全,晚期容易并發(fā)惡性心律失常、心力衰竭、甚至猝死[1,2]。迄今為止,DCM發(fā)病機制仍不完全明確,治療未有實質(zhì)性突破[3]。研究發(fā)現(xiàn),心肌細胞內(nèi)鈣超載與DCM的發(fā)生有關(guān)[4]。高血糖是糖尿病患者的主要特征之一,能夠直接損傷心肌細胞,引起心肌病變[5]。但是,高血糖對心肌細胞內(nèi)鈣超載是否有促進作用及其可能機制,文獻報道較少。2012年9月~2013年7月,本研究以體外培養(yǎng)的鼠胚心肌細胞H9C2為研究對象,觀察體外高糖環(huán)境對細胞形態(tài)及增殖的影響,并探討其作用機制。

    1 材料與方法

    1.1材料鼠胚心肌細胞H9C2購自中國科學院上海生命科學研究院。DMEM培養(yǎng)基、D-葡萄糖、胎牛血清( FBS) (美國Gibco公司),細胞計數(shù)盒CCK-8(日本Dojindo Lab),細胞總RNA提取試劑盒、核蛋白提取試劑盒、經(jīng)典瞬時受體蛋白6( TRPC6)和GAPDH引物、DNA marker(上海生物工程有限公司),實時定量PCR試劑盒(大連TaKaRa公司),兔抗大鼠TRPC6單克隆抗體、兔抗大鼠活化T細胞核因子3 ( NFAT3)單克隆抗體、經(jīng)典瞬時受體通道蛋白( TRPC)通道阻滯劑SKF96365(以色列Alomone Labs公司)。

    1.2細胞培養(yǎng)及分組處理H9C2細胞在含10% FBS的低糖( 5 mmol/L) DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),待細胞生長85%左右培養(yǎng)面積后,0.25%胰酶消化,1∶2傳代,8~9代細胞用于實驗。待細胞成對數(shù)生長后,調(diào)整細胞數(shù)為1×105/L,接種于6孔培養(yǎng)板,培養(yǎng)24 h;待細胞成融合狀態(tài)換用無血清低糖DMEM培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,使細胞呈靜止狀態(tài),隨機分為四組。1組:培養(yǎng)液中加入終濃度為5.5 mmol/L 的D-葡萄糖; 2組:培養(yǎng)液中加入終濃度為27.5 mmol/L的甘露醇和終濃度為5.5 mmol/L的D-葡萄糖; 3組:培養(yǎng)液中加入終濃度為33 mmol/L的D-葡萄糖; 4組:培養(yǎng)液中加入終濃度為2 μmol/L的SKF96365和終濃度為33 mmol/L的D-葡萄糖。

    1.3細胞存活率檢測將各組細胞接種于96孔培養(yǎng)板,分別在培養(yǎng)24、48、72 h時每孔加入CCK-8 10 μL和DMEM 90 μL,37℃、5% CO2條件下孵育1 h,采用酶標儀(λ= 450 nm)記錄各孔光密度( OD)值,計算細胞增殖率。細胞增殖率( %) = (處理組OD450-空白孔OD450)/(對照組OD450-空白孔

    OD450)×100%,每組設(shè)3個復孔,實驗重復3次。空白孔為未加細胞懸液的DMEM培養(yǎng)液,1組即對照組。

    1.4 TRPC6、NFAT3 mRNA檢測采用實時定量PCR方法。各組細胞分別在處理24、48、72 h提取細胞總RNA,測定RNA濃度。TRPC6引物序列:上游: 5'-GTCGGTGGTCATCAACTACAATC-3',下游: 5'-CCACATCCGCATCATCCTCAATT-3'; NFAT3引物序列:上游: 5'-ACAGAAGAGGGGGCGTCTC-3',下游: 5'-ACCAATAGGGGCAGCACCATA-3'; GAPDH引物序列:上游: 5'-ACGGCAAATTCAACGGCACAGTCA-3',下游: 5'-TGGGGGCATCGGCAGAAGG-3'。PCR反應條件: 95℃變性5 min、95℃30 s、58℃30 s、70℃30 s,40個循環(huán)。實驗重復3次。以GAPDH為內(nèi)參照,2-ΔΔCt法計算各組TRPC6、NFAT3 mRNA相對表達量。

    1.5 TRPC6、NFAT3蛋白檢測各組細胞在培養(yǎng)72 h時(根據(jù)前期實驗結(jié)果確定時間點)采用0.25%胰酶常規(guī)消化并收集,采用Western blotting法檢測TRPC6( 1∶500)、NFAT3( 1∶2 000)蛋白。具體步驟參照試劑盒說明書。實驗重復3次,以GAPDH作為內(nèi)參照。采用Quantity-One軟件分析各組TRPC6、NFAT3蛋白的相對表達量。

    1.6統(tǒng)計學方法采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料采用珋x±s表示,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1各組細胞增殖率比較在培養(yǎng)72 h時,3組細胞增殖率較1、2組降低( P均<0.05),4組較3組增高( P<0.05) ; 3組72 h時細胞增殖率較48 h時降低( P<0.05) ; 1、2組細胞增殖率在各時間點均無明顯差異( P均>0.05) ;見表1。

    表1 四組不同時間點細胞增殖率比較( %,±s)

    表1 四組不同時間點細胞增殖率比較( %,±s)

    注:與同時間點1、2組比較,*P均<0.05;與同時間點3組比較,△P<0.05;與同組48 h比較,#P<0.05。

    組別 細胞增殖率24 h 48 h 72 h 1組25.72±1.89  65.77±6.87  105.88±10.01 2組 22.55±2.02  61.92±5.99  98.67±8.97 3組 16.78±1.36  43.22±4.59  28.55±6.32* #4組 18.79±2.65  55.43±6.01  49.18±7.14△

    2.2各組TRPC6、NFAT3 mRNA相對表達量比較

    在培養(yǎng)72 h時,3組TRPC6、NFAT3 mRNA相對表達量較1、2組增加( P均<0.05),4組較3組下降( P均<0.05) ; 3組各時間點比較,P均<0.05;見表2。

    表2 四組不同時間點TRPC6、NFAT3 mRNA相對表達量比較(±s)

    表2 四組不同時間點TRPC6、NFAT3 mRNA相對表達量比較(±s)

    注:與同時間點1、2組比較,*P均<0.05;與同時間點3組比較,△P<0.05;與同組各時間點比較,#P<0.05。

    組別TRPC6 mRNA 24 h 48 h 72 h NFAT3 mRNA 24 h 48 h 72 h 1組 1.03±0.13 0.96±0.09 1.02±0.11 0.97±0.17 0.99±0.13 1.06±0.19 2組 1.07±0.08 1.12±0.15 1.09±0.26 1.14±0.14 1.11±0.11 1.13±0.18 3組 7.23±0.52 11.39±1.17 16.15±1.49* # 5.23±1.43 9.88±1.96 14.44±2.09* #4組 4.64±0.35 6.79±0.44 10.13±0.69# 2.94±0.24 5.32±0.94 8.97±1.73△

    2.3各組TRPC6、NFAT3蛋白相對表達量比較在培養(yǎng)72 h時,1、2、3、4組TRPC6蛋白相對表達量分別為0.302±0.017、0.351±0.023、1.874± 0.124、1.214±0.097; NFAT3蛋白相對表達量分別為0.247±0.026、0.298±0.034、1.199±0.104、0.656±0.038; 3、4組均高于1、2組( P均<0.05),4組均低于3組( P均<0.05)。

    3 討論

    研究發(fā)現(xiàn),持續(xù)高血糖狀態(tài)會造成心肌細胞胞質(zhì)內(nèi)、線粒體內(nèi)Ca2 +濃度明顯升高,導致心肌細胞舒縮功能障礙及凋亡增加[5,6]。在病理狀態(tài)下,胞外鈣的內(nèi)流和胞內(nèi)鈣庫的釋放則造成細胞質(zhì)內(nèi)鈣超載[7]。細胞外鈣內(nèi)流主要通過電壓門控鈣信道( VOC)、受體門控鈣通道( ROC)和鈣庫操縱性鈣通道( SOC),其中VOC和ROC主要介導胞外鈣在短時間內(nèi)大量內(nèi)流,SOC則介導小量持續(xù)鈣內(nèi)流。但是,組成SOC及ROC的具體分子實體仍不十分明確。研究發(fā)現(xiàn),TRPC的同源異構(gòu)體是構(gòu)成細胞膜上SOC和ROC的分子實體,TRPC通道的啟動開放可引起心肌細胞內(nèi)Ca2 +濃度變化,通過鈣調(diào)神經(jīng)素( CaN)/NFAT信號通路在細胞內(nèi)Ca2 +增加誘導的心肌重構(gòu)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,進而觸發(fā)心肌肥大相關(guān)信號轉(zhuǎn)導,引起心肌重構(gòu)和病理性肥厚[8]。Onohara等[9]發(fā)現(xiàn),血管緊張素Ⅱ( AngⅡ)誘導的新生大鼠心肌細胞肥大模型TRPC3、TRPC6 mRNA表達均顯著上調(diào);而敲除TRPC3 或TRPC6中的任何一個,都會明顯抑制心肌細胞肥大效應; PLC介導的1,2-二酰甘油( DAG)的生成增多對上述過程有直接啟動作用。TRPC3與TPRC6均可直接受DAG的啟動開放,TRPC3與TRPC6通道之間有協(xié)同關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn),TRPC6表達程度與心肌細胞

    肥大密切相關(guān),并且證實這種促進心肌細胞肥大的效應是由TRPC介導的Ca2 +-NFAT信號通路完成[7]。在CaN被持續(xù)啟動后,小鼠心肌細胞膜TRPC6表達量明顯增加;在人類心力衰竭的心肌細胞中,TRPC6亦出現(xiàn)類似過表達。Nishida等[10]研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)皮素-1( ET-1)、AngⅡ刺激體外大鼠心肌細胞和心肌成纖維細胞,可以顯著提高TRPC6的表達水平;血小板凝結(jié)抑制劑Forskolin可以顯著下調(diào)TRPC6表達; ET-1的這種作用是由Gα12/13( G-12家族蛋白的亞單位)所介導的,并且這種作用通過NFAT的持續(xù)激活持續(xù)啟動。進一步研究發(fā)現(xiàn),過表達TRTRPC6的轉(zhuǎn)基因小鼠NFAT的轉(zhuǎn)錄活性增強,并參與Ca2 +-CaN/NFAT信號通路的正回饋機制,通過抑制5型磷酸二酯酶途徑抑制TRPC6表達活性增加造成的病理性心肌肥大[11]。高糖通過增加人類足突細胞黏連蛋白聚糖-4( SDC-4)和活性氧簇( ROS)的表達調(diào)節(jié)TRPC6的表達[12]。沒有基礎(chǔ)心臟病的Klotho基因缺陷小鼠會出現(xiàn)應激狀態(tài)下的心肌細胞肥大和心室重構(gòu);在健康成年小鼠的心肌細胞中,Klotho通過下調(diào)TRPC6而發(fā)揮心臟保護作用[13]。如果抑制Klotho基因缺陷小鼠TRPC6蛋白的表達,則可以阻止壓力誘導的心肌細胞重構(gòu)。進一步研究發(fā)現(xiàn),TRPC6高表達的小鼠會自發(fā)出現(xiàn)心肌重構(gòu);而Klotho過表達則可以明顯抑制TRPC6導致的心肌重構(gòu),延長小鼠生存期。Kinoshita等[14]證明,TPRC6蛋白是心鈉肽/腦鈉肽-鳥苷酸環(huán)化酶A ( ANP/BNP-GC-A)信號通路介導的心肌肥大作用的關(guān)鍵靶點。上述研究均證明,TRPC6在心肌肥厚的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的橋梁作用。

    高糖可使心肌細胞內(nèi)Na+-K+-ATP酶、Ca2 +-Mg2 +活性減低,使心肌細胞對鈣的攝取和輸送能力下降,導致心肌收縮功能受損。但高糖是否會通過上調(diào)TRPC蛋白的表達,導致胞內(nèi)鈣超載,從而啟動CaN/NFAT信號通路,目前國內(nèi)外尚無相關(guān)研究予以證實。

    H9C2細胞源于胚胎期大鼠心臟,具有心肌細胞的很多特性; 33 mmol/L葡萄糖作為研究心肌細胞高糖損傷的條件,已經(jīng)被廣泛證實并應用[15]。本研究將H9C2心肌細胞在33 mmol/L葡萄糖條件下培養(yǎng),細胞出現(xiàn)肥大、變性、壞死,增殖率降低,說明高糖造成細胞損傷。在培養(yǎng)72 h時,3組TRPC6、NFAT3 mRNA及蛋白相對表達量較1、2組增高;加用TRPC通道阻滯劑skf96365后,心肌細胞增殖率有所增加,TRPC6、NFAT3 mRNA及蛋白相對表達量下調(diào)。上述結(jié)果提示,在高糖條件下TRPC6可能通過CaN/NFAT3通路造成心肌細胞損傷。

    綜上所述,高糖抑制心肌細胞增殖,造成心肌細胞損傷;促進心肌細胞TRPC6表達,導致TRPC通道開放,引起心肌細胞內(nèi)鈣超載,啟動CaN/NFAT3通路,可能是其作用機制。

    參考文獻:

    [1]Hamby RI,Zoneraich S,Shrman L.Diabetic cardiomyopathy[J].JAMA,1974,229( 13) : 1749-1754.

    [2]Chavali V,Tyagi SC,Mishra PK.Predictors and prevention of diabetic cardiomyopathy[J].Diabetes Metab Syndr Obes,2013,( 6) : 151-160.

    [3]席曉慧,王福文,牟艷玲.糖尿病心肌病的藥物治療研究進展[J].山東醫(yī)藥,2014,54( 5) : 93-95.

    [4]簡春燕,吳鏗.糖尿病性心肌病發(fā)病機制和治療的研究現(xiàn)狀[J].中華臨床醫(yī)師雜志(電子版),2012,6( 1) : 164-167.

    [5]Kumar S,Kain V,Sitasawad SL.High glucose-induced Ca2 +overload and ox-idative stress contribute to apoptosis of cardiac cells through mitochondrial de-pendent and independent pathways[J].Biochim Biophys Acta,2012,1820( 7) : 907-920.

    [6]Dhalla NS,Takeda N,Rodriguez-Leyva D,et al.Mechanisms of subcellular remod-eling in heart failure due to diabetes[J].Heart Fail Rev,2014,19( 1) : 87-99.

    [7]Bugger H,Abel ED.Molecular mechanisms of diabetic cardiomyopathy[J].Diabetologia,2014,57( 4) : 660-671.

    [8]Eder P,Molkentin JD.TRPC channels as effectors of cardiac hypertrophy[J].Cire Res,2011,108( 2) : 265-272.

    [9]Onohara N,Nishida M,Inoue R,et al.TRPC3 and TRPC6 are essential for angiotensinⅡ-induce cardiac hypertrophy[J].EMBO,2006,25( 22) : 5305-5316.

    [10]Nishida M,Onohara N,Sato Y,et al.Gα12/13-mediated up-regulation of TRPC6 negatively regulates endothelin-1-induced cardiac myofibrob-last formation and collagen synthesis through nuclear factor of activated T cells activation[J].J Biol Chem,2007,282 ( 32) : 23117-23128.

    [11]Nishida M,Watanabe K,Sato Y,et al.Phosphorylation of TRPC6 channels at Thr69 is requered for anti-hypertrophic effects of phosphodiesterase 5 inhibiton[J].J Biol Chem,2010,285 ( 17) : 13244-13253.

    [12]Thilo F,Lee M,Xia S,et al.High glucose modifies transient receptor potential canonical type 6 channels via increased oxidative stress and syndecan-4 in human podocytes[J].Biochem Biophys Res Commun,2014,450( 1) : 312-317.

    [13]Xie J,Cha SK,An SW,et al.Cardioprotection by Klotho through downregulation of TRPC6 channels in the mouse heart[J].Nat Commun,2012( 3) : 1238.

    [14]Kinoshita H,Kuwahara K,Nishida M,et al.Inhibition of TRPC6 channel activity contributes to the antihypertrophic effects of natriuretic peptides-guanylyl cyclase-A signaling in the heart[J].Circ Res,2010,106( 12) : 1849-1860.

    [15]Yu T,Sheu SS,Robotham JL,et al.Mitochondrial fission mediates high glucose-induced cell death through elevated production of reactive oxygen species[J].Cardiovasc Res,2008,79( 2) :341-351.

    收稿日期:( 2014-12-30)

    通信作者:楊榮禮,E-mail: yrl6502@ sina.com

    基金項目:徐州市科技計劃項目( KC14SH110)。

    文章編號:1002-266X( 2015) 28-0024-03

    文獻標志碼:A

    中圖分類號:R541

    doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.28.008

    猜你喜歡
    高糖
    當歸多糖通過調(diào)控miR-148a-3p 抑制高糖誘導的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞氧化應激損傷及凋亡研究
    HMGB1基因?qū)Ω咛钦T導的血管內(nèi)皮細胞損傷的影響
    白藜蘆醇改善高糖引起腎小球系膜細胞損傷的作用研究
    葛根素對高糖誘導HUVEC-12細胞氧化損傷的保護作用
    中成藥(2018年6期)2018-07-11 03:01:04
    丹紅注射液對高糖引起腹膜間皮細胞損傷的作用
    中成藥(2017年8期)2017-11-22 03:18:21
    BMP-7對高糖環(huán)境下成骨細胞生物學性能的影響
    芝麻素對高糖損傷SH-SY5Y細胞的保護效果及機制
    中成藥(2016年8期)2016-05-17 06:08:13
    張掖市甜菜高產(chǎn)高糖栽培技術(shù)
    長江蔬菜(2015年3期)2015-03-11 15:10:29
    大黃素對高糖培養(yǎng)的GMC增殖、FN表達及p38MAPK的影響
    王不留行黃酮苷對過氧化氫和高糖誘導損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細胞的保護作用
    日日摸夜夜添夜夜爱| 99久久精品热视频| 最近手机中文字幕大全| 日韩欧美在线乱码| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 欧美激情在线99| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲国产精品sss在线观看| 精品欧美国产一区二区三| 内射极品少妇av片p| 天堂√8在线中文| 美女高潮的动态| 日本-黄色视频高清免费观看| 听说在线观看完整版免费高清| 成年av动漫网址| 久久精品人妻少妇| 精品久久久久久久末码| 免费一级毛片在线播放高清视频| av免费观看日本| 99在线视频只有这里精品首页| 国产精品乱码一区二三区的特点| 日韩欧美三级三区| 亚洲成a人片在线一区二区| 欧美区成人在线视频| 精品国内亚洲2022精品成人| 久久人人精品亚洲av| 国产淫片久久久久久久久| 内射极品少妇av片p| 国产男人的电影天堂91| 亚洲成a人片在线一区二区| 色哟哟哟哟哟哟| av在线播放精品| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 久久久久久伊人网av| 欧美丝袜亚洲另类| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产一区二区在线观看日韩| 精品国内亚洲2022精品成人| 国模一区二区三区四区视频| 午夜a级毛片| 国产一级毛片七仙女欲春2| 性插视频无遮挡在线免费观看| 国产成人一区二区在线| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 内地一区二区视频在线| 2021天堂中文幕一二区在线观| 男人和女人高潮做爰伦理| 99久久九九国产精品国产免费| 欧美一区二区国产精品久久精品| 国产伦精品一区二区三区四那| 国产精品伦人一区二区| 国产成人精品婷婷| 不卡一级毛片| 欧美一级a爱片免费观看看| 久久国内精品自在自线图片| 久久这里只有精品中国| 欧美色欧美亚洲另类二区| 日韩精品青青久久久久久| 免费大片18禁| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 波多野结衣高清作品| 日本一本二区三区精品| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 亚洲人成网站高清观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产中年淑女户外野战色| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 一级毛片电影观看 | 天堂√8在线中文| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产私拍福利视频在线观看| 免费黄网站久久成人精品| 亚洲精品成人久久久久久| 女人被狂操c到高潮| 2022亚洲国产成人精品| 成人av在线播放网站| 人体艺术视频欧美日本| 狠狠狠狠99中文字幕| 在线播放无遮挡| 成年女人永久免费观看视频| 免费观看精品视频网站| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 日韩欧美国产在线观看| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 嫩草影院新地址| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 国产伦精品一区二区三区四那| 国产一区二区在线av高清观看| 99久久精品一区二区三区| 亚洲av成人av| 国内精品久久久久精免费| 深夜精品福利| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 精品久久久久久久久av| 九九热线精品视视频播放| 久久久久久九九精品二区国产| 99久久精品国产国产毛片| 精品熟女少妇av免费看| 男插女下体视频免费在线播放| 国产高清不卡午夜福利| 午夜福利在线观看吧| 女同久久另类99精品国产91| 国产成人影院久久av| 欧美三级亚洲精品| 免费观看的影片在线观看| 欧美三级亚洲精品| 男人和女人高潮做爰伦理| 两个人的视频大全免费| 能在线免费观看的黄片| 大型黄色视频在线免费观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 亚洲成人久久性| 能在线免费观看的黄片| 日本五十路高清| 成人鲁丝片一二三区免费| 国产一区二区在线观看日韩| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 久久久久久伊人网av| 国产探花在线观看一区二区| a级毛片a级免费在线| 欧美日韩国产亚洲二区| а√天堂www在线а√下载| 三级经典国产精品| 国产精华一区二区三区| 日本免费一区二区三区高清不卡| 在线免费观看不下载黄p国产| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 久久久午夜欧美精品| 亚洲精品日韩av片在线观看| 亚洲av二区三区四区| 啦啦啦韩国在线观看视频| 美女高潮的动态| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 亚洲国产色片| 黄片无遮挡物在线观看| 真实男女啪啪啪动态图| 国产视频首页在线观看| 一个人看视频在线观看www免费| 免费观看a级毛片全部| 中文字幕久久专区| 人人妻人人看人人澡| 1000部很黄的大片| 久久久午夜欧美精品| 亚洲av免费在线观看| 一个人免费在线观看电影| 国产真实乱freesex| 中文字幕制服av| 国产激情偷乱视频一区二区| 成人特级黄色片久久久久久久| 免费观看a级毛片全部| 国产一区二区在线av高清观看| 一本久久精品| 亚洲国产精品国产精品| 人人妻人人看人人澡| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 性插视频无遮挡在线免费观看| 精品无人区乱码1区二区| 日本一本二区三区精品| 亚洲av二区三区四区| 日韩中字成人| 精品日产1卡2卡| 午夜爱爱视频在线播放| 亚洲天堂国产精品一区在线| 99精品在免费线老司机午夜| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 欧美三级亚洲精品| 婷婷色综合大香蕉| 乱人视频在线观看| 久久午夜亚洲精品久久| 欧美成人免费av一区二区三区| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 九草在线视频观看| 久久久久免费精品人妻一区二区| 不卡一级毛片| 亚洲欧洲国产日韩| 青青草视频在线视频观看| 99在线视频只有这里精品首页| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产成人freesex在线| 亚洲av中文av极速乱| 久久亚洲精品不卡| 美女大奶头视频| 国产成人精品婷婷| 国产精品一区二区三区四区久久| 卡戴珊不雅视频在线播放| 色视频www国产| 午夜免费男女啪啪视频观看| 伦理电影大哥的女人| 人人妻人人澡欧美一区二区| 亚洲av成人av| 亚洲精品国产av成人精品| 午夜精品国产一区二区电影 | 中文字幕精品亚洲无线码一区| 亚洲不卡免费看| 国产午夜精品论理片| 久久久久久久久中文| 国内精品美女久久久久久| 日韩制服骚丝袜av| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 一本久久中文字幕| 热99re8久久精品国产| 乱系列少妇在线播放| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产精品永久免费网站| 亚洲人成网站在线观看播放| 成人一区二区视频在线观看| 99久久精品一区二区三区| 国产精品久久电影中文字幕| 国产成人精品一,二区 | 亚洲无线在线观看| 亚洲av熟女| 久久午夜福利片| 久99久视频精品免费| 搡老妇女老女人老熟妇| 久久久色成人| 麻豆av噜噜一区二区三区| 精品久久久久久成人av| 亚洲丝袜综合中文字幕| 国产成人freesex在线| 国产免费一级a男人的天堂| 国产一区二区三区av在线 | 又爽又黄a免费视频| 少妇的逼水好多| 女同久久另类99精品国产91| 免费观看a级毛片全部| 亚洲国产欧美人成| 日韩高清综合在线| 男人狂女人下面高潮的视频| 尾随美女入室| 亚洲av男天堂| 久久久久性生活片| 亚洲色图av天堂| 久久久成人免费电影| 高清毛片免费观看视频网站| 色5月婷婷丁香| 黄片无遮挡物在线观看| 一本久久中文字幕| 国产伦一二天堂av在线观看| 高清日韩中文字幕在线| 国内精品宾馆在线| 国产伦精品一区二区三区四那| 日韩精品青青久久久久久| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 亚洲精品456在线播放app| av天堂中文字幕网| 亚洲内射少妇av| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产成人freesex在线| 国内揄拍国产精品人妻在线| 毛片女人毛片| 97超碰精品成人国产| 五月伊人婷婷丁香| 老司机影院成人| 午夜免费男女啪啪视频观看| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 好男人视频免费观看在线| 久久人妻av系列| 又粗又爽又猛毛片免费看| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲av不卡在线观看| 国产老妇女一区| 九色成人免费人妻av| 国产日本99.免费观看| 国产精品国产高清国产av| 亚洲av.av天堂| 国内精品宾馆在线| 亚洲成av人片在线播放无| 黄片wwwwww| 性插视频无遮挡在线免费观看| 国产 一区 欧美 日韩| 国产爱豆传媒在线观看| 搡老妇女老女人老熟妇| 丝袜喷水一区| 91aial.com中文字幕在线观看| 日日干狠狠操夜夜爽| 亚洲国产精品久久男人天堂| 欧美又色又爽又黄视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| 26uuu在线亚洲综合色| 美女高潮的动态| 婷婷亚洲欧美| 长腿黑丝高跟| 女人被狂操c到高潮| 亚洲国产高清在线一区二区三| 综合色av麻豆| 久久精品国产亚洲av天美| 久久精品91蜜桃| 亚洲无线在线观看| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 一本一本综合久久| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 青青草视频在线视频观看| 亚洲久久久久久中文字幕| .国产精品久久| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 97热精品久久久久久| 亚洲av成人精品一区久久| 插逼视频在线观看| 欧美一区二区亚洲| 国产av一区在线观看免费| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 欧美激情在线99| 精品人妻一区二区三区麻豆| 久久精品人妻少妇| 欧美成人a在线观看| 中文字幕免费在线视频6| 永久网站在线| 偷拍熟女少妇极品色| 国产av一区在线观看免费| 大型黄色视频在线免费观看| 亚洲五月天丁香| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产精品福利在线免费观看| 精品一区二区三区视频在线| 国产精品国产高清国产av| 哪里可以看免费的av片| 又爽又黄无遮挡网站| av天堂中文字幕网| 久久综合国产亚洲精品| 国产成人a区在线观看| 此物有八面人人有两片| 最后的刺客免费高清国语| 在线国产一区二区在线| 日韩欧美三级三区| 91精品国产九色| 亚洲成人av在线免费| 亚洲精品国产成人久久av| 久久草成人影院| 国产老妇女一区| 成人漫画全彩无遮挡| 国产色爽女视频免费观看| 久久人人精品亚洲av| 午夜精品在线福利| 国产成人freesex在线| 亚洲自偷自拍三级| 午夜精品国产一区二区电影 | 狠狠狠狠99中文字幕| 国产在线精品亚洲第一网站| 亚洲精品成人久久久久久| 国产精品嫩草影院av在线观看| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国产黄a三级三级三级人| 99久国产av精品| 日本黄大片高清| 精品免费久久久久久久清纯| 中文字幕av在线有码专区| 亚洲av.av天堂| 久久久国产成人精品二区| 色综合色国产| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 男人的好看免费观看在线视频| 亚洲精品久久国产高清桃花| 国产精品蜜桃在线观看 | 国产真实伦视频高清在线观看| 18禁在线播放成人免费| 婷婷色av中文字幕| 少妇高潮的动态图| 亚洲综合色惰| 男插女下体视频免费在线播放| 成人美女网站在线观看视频| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 亚洲av成人av| 久99久视频精品免费| 97超碰精品成人国产| av免费观看日本| 99国产精品一区二区蜜桃av| 97超碰精品成人国产| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 直男gayav资源| 神马国产精品三级电影在线观看| 久久久色成人| 全区人妻精品视频| 亚洲av第一区精品v没综合| 看片在线看免费视频| 丰满的人妻完整版| 中出人妻视频一区二区| 久久精品人妻少妇| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲精品影视一区二区三区av| 麻豆成人av视频| 久久精品影院6| 国产一级毛片在线| 男女啪啪激烈高潮av片| 国产片特级美女逼逼视频| 亚洲经典国产精华液单| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 可以在线观看毛片的网站| 国产精品,欧美在线| 久久99热6这里只有精品| 12—13女人毛片做爰片一| 国产成人a∨麻豆精品| 91精品一卡2卡3卡4卡| 国产成人91sexporn| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 草草在线视频免费看| 午夜激情欧美在线| 国产免费一级a男人的天堂| 男女视频在线观看网站免费| 欧美人与善性xxx| 成年女人永久免费观看视频| 老女人水多毛片| 村上凉子中文字幕在线| 最近的中文字幕免费完整| 亚洲第一区二区三区不卡| 综合色丁香网| 中国美白少妇内射xxxbb| 又粗又硬又长又爽又黄的视频 | 国产高潮美女av| 好男人视频免费观看在线| av在线亚洲专区| 天堂√8在线中文| 99久久人妻综合| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 男人和女人高潮做爰伦理| 久久鲁丝午夜福利片| 听说在线观看完整版免费高清| 中文字幕久久专区| 久久中文看片网| 成熟少妇高潮喷水视频| 最好的美女福利视频网| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲国产高清在线一区二区三| 亚洲国产精品成人综合色| 欧美日本视频| 国产三级中文精品| 99久国产av精品国产电影| h日本视频在线播放| 日本爱情动作片www.在线观看| 欧美变态另类bdsm刘玥| 长腿黑丝高跟| 乱码一卡2卡4卡精品| 五月伊人婷婷丁香| 晚上一个人看的免费电影| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 熟女人妻精品中文字幕| 永久网站在线| 禁无遮挡网站| 高清午夜精品一区二区三区 | 亚洲欧美精品自产自拍| 国产成人影院久久av| 国产精品99久久久久久久久| 亚洲国产欧美在线一区| 日本一本二区三区精品| 99久久精品热视频| 99久久成人亚洲精品观看| 少妇人妻一区二区三区视频| 好男人视频免费观看在线| 免费av观看视频| 麻豆国产97在线/欧美| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲美女视频黄频| 嘟嘟电影网在线观看| 亚洲av中文av极速乱| 国产真实乱freesex| 亚洲电影在线观看av| 日韩av在线大香蕉| 国内精品一区二区在线观看| 欧美激情在线99| 国产黄片美女视频| 久久6这里有精品| 免费看光身美女| 69人妻影院| 成人高潮视频无遮挡免费网站| av在线天堂中文字幕| kizo精华| 超碰av人人做人人爽久久| 伦精品一区二区三区| 亚洲欧洲日产国产| 久久久欧美国产精品| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国产在线男女| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 久久亚洲国产成人精品v| 一边亲一边摸免费视频| 亚洲三级黄色毛片| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 国产成人aa在线观看| ponron亚洲| 在线免费十八禁| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产人妻一区二区三区在| 日韩欧美 国产精品| 久久久久网色| 国产高潮美女av| 精品人妻熟女av久视频| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 午夜福利成人在线免费观看| 午夜a级毛片| 亚洲国产精品久久男人天堂| 日日撸夜夜添| 国产色婷婷99| 国产男人的电影天堂91| 看片在线看免费视频| 国产私拍福利视频在线观看| 麻豆av噜噜一区二区三区| 寂寞人妻少妇视频99o| 国产精品女同一区二区软件| av在线老鸭窝| 亚洲欧美精品专区久久| 久久国内精品自在自线图片| 国产成人freesex在线| 一边亲一边摸免费视频| 高清毛片免费看| 日本免费一区二区三区高清不卡| 青青草视频在线视频观看| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产精品一及| 国产一级毛片在线| 男人舔奶头视频| 亚洲最大成人手机在线| 国产高清不卡午夜福利| av在线播放精品| 在线国产一区二区在线| 久久精品影院6| 久久人妻av系列| 色综合亚洲欧美另类图片| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲美女视频黄频| 成熟少妇高潮喷水视频| 日韩中字成人| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 亚洲18禁久久av| 18+在线观看网站| 天美传媒精品一区二区| 一个人看的www免费观看视频| 最后的刺客免费高清国语| 一区二区三区高清视频在线| 亚洲一区高清亚洲精品| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 亚洲三级黄色毛片| 免费看美女性在线毛片视频| av福利片在线观看| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 91精品国产九色| 国产精品一及| 中文字幕av在线有码专区| 日日干狠狠操夜夜爽| 九九在线视频观看精品| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 少妇人妻一区二区三区视频| 一本精品99久久精品77| 丰满乱子伦码专区| 欧美+日韩+精品| 毛片一级片免费看久久久久| 亚洲成人久久性| 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲综合色惰| 赤兔流量卡办理| 亚洲av第一区精品v没综合| 99视频精品全部免费 在线| 国产精品一区www在线观看| 国产真实伦视频高清在线观看| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产成人精品婷婷| 国产免费男女视频| 久久久久九九精品影院| 日韩av不卡免费在线播放| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产精品,欧美在线| 人人妻人人看人人澡| 久久韩国三级中文字幕| 国产午夜福利久久久久久| 久久99热6这里只有精品| 久久99热这里只有精品18| 中文字幕久久专区| 日本av手机在线免费观看| 成人特级黄色片久久久久久久| 国产成人aa在线观看| 26uuu在线亚洲综合色| 日韩视频在线欧美| 我要搜黄色片| 欧美区成人在线视频| 熟女人妻精品中文字幕| 久久国产乱子免费精品| 色尼玛亚洲综合影院| 国产精品日韩av在线免费观看| 日本熟妇午夜| 男插女下体视频免费在线播放| 我的老师免费观看完整版| 国产高清视频在线观看网站| 亚洲五月天丁香| 亚洲av免费高清在线观看| 国产极品精品免费视频能看的| 性色avwww在线观看| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 麻豆成人午夜福利视频| 成人毛片60女人毛片免费| 国产69精品久久久久777片| 日本五十路高清| 亚洲天堂国产精品一区在线| 色哟哟·www| 啦啦啦韩国在线观看视频| av视频在线观看入口| 久久鲁丝午夜福利片| 午夜精品在线福利| 只有这里有精品99| 99热全是精品| 国产精品av视频在线免费观看| 国产色爽女视频免费观看| 国产亚洲91精品色在线| 日韩成人伦理影院| 免费大片18禁| 全区人妻精品视频| 热99re8久久精品国产| 一进一出抽搐gif免费好疼| 精品久久久久久成人av| 久久久久久伊人网av|