海芋過氧化氫酶的分離純化及其性質(zhì)

海芋過氧化氫酶的分離純化及其性質(zhì)

李思瑩，黃卓烈，鄭華章，黃丹丹

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510642)

摘要：為了探索海芋(Alocasia macrorrhiza)過氧化氫酶的分子結(jié)構(gòu)和酶學(xué)性質(zhì)，提取海芋新鮮葉片、葉柄和塊莖的粗酶進(jìn)行活力比較和同工酶分析。用Sephadex G 200凝膠過濾層析法將粗酶分離純化，以PAGE電泳對(duì)酶純度鑒定。結(jié)果表明：海芋過氧化氫酶較單一，沒有同工酶。經(jīng)層析法進(jìn)行分離獲得電泳純的過氧化氫酶，其活力回收率為40.83%，純化倍數(shù)為8.88倍。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：該酶由5條肽鏈組成，全酶相對(duì)分子質(zhì)量為2.621 1×105。酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明：該酶最適反應(yīng)溫度40 ℃，最適pH為7.5。在25～45 ℃和pH 6.0～9.0下，該酶能保持較強(qiáng)的催化活力，穩(wěn)定性較好。在最適條件下，該酶的Km值為16.43 mmol/L，對(duì)底物的親和力較好。甲醇、乙醇和異丙醇對(duì)此酶活力有顯著的抑制作用。

關(guān)鍵詞：海芋過氧化氫酶；分離純化；酶活力；酶學(xué)性質(zhì)

doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2015.04.010

收稿日期：2014-04-29

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(10074016)

作者簡介：李思瑩(1991—)，女， 廣東化州人，研究方向：酶學(xué)與酶工程；黃卓烈(聯(lián)系人)，教授，E-mail:zhuolieh@scau.edu.cn

中圖分類號(hào)：Q55文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Isolation,purification and characterization ofAlocasiamacrorrhizacatalase

LI Siying,HUANG Zhuolie,ZHENG Huazhang，HUANG Dandan

(College of Life Science,South China Agricultural University,Guangdong 510642,China)

Abstract：In order to characterize catalase,crude enzyme was extracted from leaves,petioles,tuber of Alocasia macrorrhiza. The enzyme activities and isozymes were compared and analyzed among the organs. Sephadex G 200 gel chromatography was used to purify the enzyme. Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) was used to identify the enzyme purity. There was no isozyme of catalase in Alocasia macrorrhiza. The activity recovery was 40.83% and the purification multiple was 8.88 folds. It was indicated by SDS-PAGE that the catalase in Alocasia macrorrhiza was composed of 5 polypeptides. The molecular weight of this catalase was 2.621 1×105. The optimal reaction temperature was 40 ℃ and the optimal pH was 7.5. Under the optimal conditions,the Km of this catalase was 16.43 mmol/L. The enzyme activity was inhibited by methanol,ethanol and isopropanol.

Keywords：Alocasia macrorrhiza catalase；isolation and purification enzyme activity；enzymology properties

海芋(Alocasiamacrorrhiza(L.) Schott)又名野芋、狼毒、尖尾和野芋頭等,屬天南星科海芋屬植物，是一種民間中草藥,具有重要的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。國內(nèi)外在海芋的開發(fā)利用方面做了許多工作。隋亞光用海芋治療慢性萎縮性鼻炎，結(jié)果表明不僅能減輕癥狀，且有治愈的可能。亦有報(bào)道以海芋為主治療慢性支氣管炎37例。海芋還可以抗腫瘤。國外報(bào)道海芋可用于治療鉤端螺旋體病、毒蛇咬傷和毒蜂蟄傷。此外，海芋葉資源豐富,易于種植,營養(yǎng)價(jià)值較高，1 kg葉粉干物質(zhì)含粗蛋白質(zhì) 244.1 g，賴氨酸11.9 g，蛋氨酸4.4 g，代謝能4.92 MJ，是一種新的飼料資源。過氧化氫酶(catalase,CAT)是一類廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)的末端氧化酶。此酶分子結(jié)構(gòu)中含有鐵卟啉環(huán),1個(gè)分子酶蛋白中含有4個(gè)鐵原子。典型的CAT又稱單功能血紅素CAT,幾乎存在于所有真核生物和原核生物的呼吸組織中。過氧化氫酶是在生物演化過程中建立起來的生物防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶之一。

在生物體內(nèi)有些生物化學(xué)反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生大量的H2O2。這種H2O2可以轉(zhuǎn)變成為各種氧自由基。這些氧自由基能夠破壞DNA、RNA、蛋白質(zhì)和酶分子，使這些大分子斷裂，從而失去生物活性。而過氧化氫酶的生物學(xué)功能是催化細(xì)胞內(nèi)代謝過程形成的過氧化氫分解，防止氧自由基的形成，從而保護(hù)了生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能?，F(xiàn)在，過氧化氫酶已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)、乳制品業(yè)、造紙業(yè)和環(huán)保產(chǎn)業(yè)中有應(yīng)用價(jià)值的酶之一。筆者對(duì)海芋各器官的過氧化氫酶進(jìn)行分離和純化，并對(duì)其分子結(jié)構(gòu)、相對(duì)分子質(zhì)量、催化動(dòng)力學(xué)和酶學(xué)基本性質(zhì)等進(jìn)行探索，以便對(duì)其有較清楚的了解。

1材料與方法

1.1材料與試劑

材料：新鮮海芋的葉片、葉柄和塊莖采摘于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校園。

主要試劑：Sephadex G200、標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品和牛血清白蛋白，Sigma公司；Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、甲叉雙丙烯酰胺和H2O2等，國產(chǎn)分析純?cè)噭豢捡R斯亮藍(lán)G-250和考馬斯亮藍(lán)R-250，F(xiàn)luka公司。

1.2主要儀器與設(shè)備

5810R型冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；PB-10型酸度計(jì)，德國賽多利斯公司；磁力攪拌器、分光光度計(jì)、紫外檢測儀、垂直板電泳槽和電泳儀等為國產(chǎn)儀器。

1.3方法

1.3.1粗酶液的提取

新鮮海芋材料用蒸餾水洗干凈，擦干。分別稱取一定質(zhì)量的葉片、葉柄和塊莖，剪碎置研缽中，加入適量4 ℃下預(yù)冷的 pH 7.5磷酸緩沖液和少量石英砂研磨成勻漿后，置于4 ℃冰箱中靜置 10 min，用4層紗布過濾，取上清液在4 ℃下12 000 r/min離心15 min，上清液即為過氧化氫酶粗提液。4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2海芋各器官過氧化氫酶活力的比較

配制3 mL反應(yīng)體系(粗酶液0.2 mL、0.1 mol/L H2O20.3 mL和磷酸緩沖溶液2.5 mL)，在37 ℃、pH 7.5條件下，于波長240 nm處測定海芋各器官過氧化氫酶的活力。以每分鐘吸光值變化0.01所需要的酶量定義為1單位(U)。

1.3.3聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE) 分離過氧化氫酶同工酶

取粗酶液3 mL，濃縮至1 mL，加入等體積的40%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))蔗糖溶液混勻，并加入2滴0.5% (體積分?jǐn)?shù))溴酚藍(lán)作為電泳指示劑。聚丙烯酰胺凝膠的濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%。上樣量30 μL。樣品在濃縮膠時(shí)用120 V 電泳1 h，當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后用160 V 電泳3.5 h。電泳后脫膠，將凝膠用預(yù)冷的蒸餾水稍加沖洗，然后于體積分?jǐn)?shù)0.03% H2O2中浸泡20 min。傾去該浸泡液,用預(yù)冷的蒸餾水稍加沖洗后，將凝膠置于2% FeCl3與2% K3Fe(CN)6體積比為1∶4 的混合液中浸泡，直至在凝膠上的暗綠色背景下出現(xiàn)黃白色區(qū)帶[11]。

1.3.4Sephadex G-200凝膠過濾柱層析分離過氧化氫酶

用pH7.5磷酸緩沖液0.2 mol/L平衡Sephadex G200層析柱。取20 g葉片提取粗酶液，濃縮至10 mL，上樣1 mL。用pH7.5磷酸緩沖液0.2 mol/L洗脫，每6 min收集1管，每管收集4 mL；測定各管過氧化氫酶的活力和蛋白含量；收集活力最高的一管酶液，4 ℃冰箱保存。

1.3.5PAGE電泳鑒定純度

用PAGE電泳對(duì)該酶純度進(jìn)行鑒定，分離膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%，每孔加樣量為20 μL。電泳后用考馬斯亮藍(lán)R-250溶液染色。

1.3.6SDS-PAGE電泳測定酶的相對(duì)分子質(zhì)量

用十二烷硫酸鈉(SDS)-PAGE電泳測定該酶各肽鏈的相對(duì)分子質(zhì)量，計(jì)算全酶的相對(duì)分子質(zhì)量。分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%。

1.3.7蛋白質(zhì)濃度測定

蛋白質(zhì)濃度測定參照Bradford[12]的方法，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)樣品。

1.3.8過氧化氫酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

1)酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究配制濃度10、20、25、50、80和100 mmol/L的過氧化氫底物，分別取1 mL底物配制成3 mL反應(yīng)體系，在37 ℃、pH 7.5條件下測定CAT酶活力，采用Lineweaver-Burk的雙倒數(shù)作圖法[13]計(jì)算該酶的Km值和Vmax值。

2)酶的最適溫度和溫度穩(wěn)定性分別測定該酶在20～75 ℃、pH 7.5條件下酶的活力變化，以探索酶的最適pH。另外將酶液分別放置在25～75 ℃下孵育1 h后測定酶活力，計(jì)算相對(duì)酶活力并確定該酶的溫度穩(wěn)定性。

3)酶的最適pH和pH穩(wěn)定性分別測定pH 4.5～10.5、37 ℃條件下的酶活力變化，探索酶的最適pH。另外將酶液分別在pH 4.5～10.5的緩沖液中4 ℃下放置2 h，然后測定酶活力，研究其pH值穩(wěn)定性。

4)一些有機(jī)溶劑對(duì)酶活力的影響分別將甲醇、乙醇、異丙醇與磷酸緩沖液和酶液混勻，混勻后有機(jī)溶劑的體積分?jǐn)?shù)分別為0、10%、20%、30%、40%、50%和60%，在4 ℃下放置1 h，然后在37 ℃下測定該酶的活力，計(jì)算比活力。

2結(jié)果與討論

2.1海芋各器官過氧化氫酶活力的比較

海芋各器官過氧化氫酶活力見表1。由表1可知：海芋葉片、葉柄和塊莖均含有過氧化氫酶的活力，其中葉片的酶活力最高，其次是葉柄，塊莖的酶活力最低。但從比活力來看，則是葉柄的比活力最高，塊莖的比活力最低。

2.2海芋各器官的過氧化氫酶同工酶電泳分析結(jié)果

海芋各器官過氧化氫酶同工酶分離結(jié)果見圖1。由圖1可知：海芋葉片、葉柄和塊莖均顯示單一條帶，它們的過氧化氫酶均沒有同工酶。

2.3海芋葉片過氧化氫酶的分離純化及純度

圖2為用Sephadex G 200分離海芋葉片過氧化氫酶的洗脫曲線。由圖2可知：經(jīng)過Sephadex G 200凝膠過濾層析后，在第30管之前的分部液中，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度曲線出現(xiàn)明顯的2個(gè)峰。過氧化氫酶活力出現(xiàn)了1個(gè)明顯的主峰，該主峰與蛋白質(zhì)的第一個(gè)峰重合。

表1　海芋各器官的酶活力比較

圖1　 海芋各器官過氧化氫酶同工酶PAGE圖譜 Fig.1　 PAGE analysis of isozymes of Alocasia macrorrhiza catalase

表2為海芋葉片過氧化氫酶分離純化表。由表2可知：經(jīng)Sephadex G 200分離后，回收率為40.83%，過氧化氫酶被純化了8.88倍。

圖2　 海芋葉片過氧化氫酶Sephadex G 200凝膠過濾層析 Fig.2　 Purification of Alocasia macrorrhiza blade catalase by Sephadex G 200 gel chromatography

表2　海芋葉片過氧化氫酶的分離純化表

取第一峰的第5支管的分部液進(jìn)行濃縮后，作為樣品進(jìn)行PAGE電泳，用考馬斯亮藍(lán)R250溶液染色后，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知：樣品顯示為單一條帶，表明分離純化后第5管的過氧化氫酶已達(dá)到電泳純，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)可用此樣品進(jìn)行。

圖3　 分離后的海芋葉片過氧化氫酶的PAGE電泳圖譜 Fig.3　 PAGE electrophoretogram of separated catalase of Alocasia macrorrhiza blade

2.4海芋葉片過氧化氫酶的相對(duì)分子質(zhì)量

將達(dá)到電泳純的過氧化氫酶樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，測定其相對(duì)分子質(zhì)量，電泳結(jié)果見圖4。由圖4可知：海芋過氧化氫酶由5條肽鏈組成。經(jīng)過對(duì)5條肽鏈進(jìn)行計(jì)算分析，每條肽鏈的相對(duì)分子質(zhì)量分別為1.512×104、3.887×104、5.344×104、7.215×104和8.353×104，因此該酶分子的相對(duì)分子質(zhì)量為26.211×104。

M—標(biāo)準(zhǔn)品；S：海芋過氧化氫酶：a～e： 5條肽鏈 圖4　 海芋葉片過氧化氫酶的SDS-PAGE電泳 Fig.4　 SDS-PAGE electrophoretogram of Alocasia macrorrhiza catalase

2.5海芋葉片過氧化氫酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.5.1海芋葉片過氧化氫酶的催化動(dòng)力學(xué)

圖5為海芋葉片過氧化氫酶純酶雙倒數(shù)法的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)圖，根據(jù)圖5可以求得該酶的最大反應(yīng)速率(Vmax)為204.08 μmol/(mg ·min)，表觀米氏常數(shù)(Km)為16.43 mmol/L。

圖5　 雙倒數(shù)作圖法測定米氏常數(shù) Fig.5　 K m determination by double reciprocal method

2.5.2酶的最適溫度與溫度穩(wěn)定性

圖6為海芋葉片過氧化氫酶在不同溫度下的反應(yīng)活力。由圖6可知：海芋葉片過氧化氫酶的最適反應(yīng)溫度為40 ℃；在30～55 ℃范圍內(nèi)，該酶的相對(duì)酶活力均保持在最適溫度下反應(yīng)活力的80%以上。

圖6　 溫度對(duì)酶活力的影響 Fig.6　 Effects of temperature on enzyme activity

圖7為海芋葉片過氧化氫酶的熱穩(wěn)定性的曲線圖。由圖7可知：海芋葉片過氧化氫酶在25～45 ℃時(shí)的熱穩(wěn)定性較好，孵育1 h后，相對(duì)酶活力保持在75%以上；而60 ℃孵育1 h后，相對(duì)酶活力為10.71%，70 ℃孵育1 h后，該酶失去活力。

圖7　 海芋葉片過氧化氫酶的熱穩(wěn)定性 Fig.7　 Thermal stability of the catalase of Alocasia macrorrhiza blade

2.5.3海芋葉片過氧化氫酶的最適pH與pH穩(wěn)定性

圖8為不同pH對(duì)海芋葉片過氧化氫酶催化活力的影響。由圖8可知：海芋葉片過氧化氫酶的最適pH為7.5，在pH 6.0～8.5范圍內(nèi)，該酶的相對(duì)酶活力均保持在最適pH反應(yīng)活力的80%以上。

圖8　 pH對(duì)酶活力的影響 Fig.8　 Effects of pH on enzyme activity

圖9為海芋葉片過氧化氫酶的pH穩(wěn)定性。由圖9可知：海芋葉片過氧化氫酶在pH 6.0～9.0范圍內(nèi)，4 ℃條件下孵育2 h后，相對(duì)酶活力均保持在80%以上。在此范圍之外，其相對(duì)酶活力變化趨勢(shì)不大，均保持在50%以上，由此說明該酶的酸堿耐受性較好。

圖9　 海芋葉片過氧化氫酶的pH穩(wěn)定性 Fig.9　 The pH stability of catalase of Alocasia macrorrhiza blade

2.5.4一些有機(jī)溶劑對(duì)酶活力的影響

圖10為不同濃度的甲醇、乙醇和異丙醇對(duì)海芋葉片過氧化氫酶活力的影響曲線。由圖10可知：甲醇、乙醇和異丙醇對(duì)海芋葉片過氧化氫酶均有較強(qiáng)的抑制作用。其中，甲醇的抑制作用較乙醇、異丙醇的強(qiáng)，體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，酶活力完全喪失。

圖10　 有機(jī)溶劑對(duì)酶活力的影響 Fig.10　 Effects of some organic solvents on the enzyme activity

有機(jī)溶劑導(dǎo)致酶催化活力減少的因素主要概括為5個(gè)方面:①擴(kuò)散限制和立體障礙；②非水介質(zhì)中酶的結(jié)構(gòu)；③構(gòu)象的可變性；④底物解析和過渡態(tài)中間物的穩(wěn)定性；⑤pH狀態(tài)。其他有機(jī)溶劑對(duì)此酶活力的作用效果還有待進(jìn)一步的深入研究。

3結(jié)論

詳細(xì)地研究了海芋的過氧化氫酶。該酶的活力回收率為40.83%、純化倍數(shù)為8.88倍。該酶的相對(duì)分子質(zhì)量為2.621 1×105。該酶最適作用溫度為40 ℃，在25～45 ℃范圍內(nèi)孵育1 h后，相對(duì)酶活力保持在75%以上，熱穩(wěn)定性較低。最適作用pH為7.5，在pH 6.0～9.0范圍內(nèi)，4 ℃條件下孵育2 h后，相對(duì)酶活力均保持在80%以上。該酶的酸堿耐受性較好。最適條件下，Km值為16.43 mmol/L，說明海芋葉片的過氧化氫酶對(duì)過氧化氫的親和力較好。

甲醇、乙醇、異丙醇對(duì)海芋葉片過氧化氫酶均有較顯著的抑制作用，三者的體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，該酶的相對(duì)活力均降至80%以下。其中，甲醇的抑制作用較乙醇、異丙醇的強(qiáng)，體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，酶活力完全喪失。

參考文獻(xiàn)：

[1]中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會(huì).中國植物志：十三卷第二分冊(cè).北京:科學(xué)出版社,1979.

[2]隋亞光.慢性支氣管炎治療.中華耳鼻喉科雜志,1957(2):116.

[3]解放軍187醫(yī)院慢性支氣管炎防治隊(duì).慢性支氣管炎治療37例.廣東醫(yī)藥資料,1977(12):7.

[4]可燕，周秀佳，柏巧明.海芋抗腫瘤作用研究.中藥材，1999，22(5)：252-253.

[5]Kariyone T.Annual index of the Reports on plant chemistry .New York:Academic Press,1972.

[6]溫劉發(fā),蒲英遠(yuǎn),羅旭芳,等.海芋葉粉飼用價(jià)值的探討.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)報(bào),1997,18(1):70-74.

[7]黃永洪,花慧,沈國強(qiáng),等.豬肝過氧化氫酶提取條件的研究.生物技術(shù)通訊,2005,16(1):40-42.

[8]Marcel Zamocky,Franz Koller.Understanding the structure and function of catalase:clues from molecular evolution and in vitro mutagenesis .Progress in Biophysics and Molecular Biology,1999,72:19-66.

[9]張坤生，田薈琳.過氧化氫酶的功能及研究.食品科技,2007(1)：8-10.

[10]劉昌玲,王國慶.細(xì)菌過氧化氫酶的分離、結(jié)晶及性質(zhì).生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,1900,17(5):380-383.

[11]董泗建,劉昌玲.一種鑒定過氧化氫酶活性的鐵染色法.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,1996,23(1):86-88.

[12]Bradford R M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding .Anal Biochem,1976,72:248-254.

[13]黃熙泰，于自然，李翠鳳.現(xiàn)代生物化學(xué).2版.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005.

(責(zé)任編輯周曉薇)