重組大腸桿菌共表達(dá)亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶發(fā)酵條件優(yōu)化

重組大腸桿菌共表達(dá)亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶發(fā)酵條件優(yōu)化

劉維明1，楊震炯2，羅積杏3，壯曉健3，沈文和3，胡燚1，黃和1

(1.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇南京211800；2.浙江省永康市質(zhì)量監(jiān)督檢測中心，

浙江永康321300；3.浙江九洲藥業(yè)股份有限公司，浙江臺(tái)州318000)

摘要：在搖瓶中對(duì)共表達(dá)亮氨酸脫氫酶(LeuDH)和甲酸脫氫酶(FDH)的重組大腸桿菌(E.coli)的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。首先考察基礎(chǔ)培養(yǎng)基中碳、氮源種類和濃度及初始pH等因素對(duì)重組大腸桿菌生長和產(chǎn)酶的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明甘油和酵母膏為最佳碳源和氮源，最適質(zhì)量濃度均為10 g/L，培養(yǎng)基最適初始pH為8.0。然后對(duì)誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最適的誘導(dǎo)時(shí)機(jī)為菌體密度(OD600)達(dá)到0.6時(shí)，最適的誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間分別為25 ℃、0.2 mmol/L和20 h。在優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下，菌體密度(OD600)可達(dá)8.6，LeuDH和FDH酶比酶活分別達(dá)1 543.3和2 572.4 U/L，是優(yōu)化前的2.0和3.1倍。

關(guān)鍵詞：重組大腸桿菌；亮氨酸脫氫酶；甲酸脫氫酶；誘導(dǎo)

doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2015.04.005

收稿日期：2014-06-16

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金杰出青年基金(21225626)；國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(2011AA02A209)；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程

作者簡介：劉維明(1987—)，山東郯城人，博士研究生，研究方向：生物催化；黃和(聯(lián)系人)，教授，E-mail:biotech@njtech.edu.cn

中圖分類號(hào)：Q554文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Optimization of fermentation conditions of recombinantE.coliforcoexpression of leucine dehydrogenase and formate dehydrogenase

LIU Weiming1,YANG Zhenjiong2,LUO Jixing3,ZHUANG Xiaojian3,SHEN Wenhe3,HU Yi1,HUANG He1

(1.College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China;

2.Quality Supervision and Inspection Center of Yongkang,Yongkang 321300,China;

3.Zhejiang Jiuzhou Pharmaceutical Co.,Ltd.,Taizhou 318000,China)

Abstract：The fermentation conditions of recombinant E.coli for coexpression of leucine dehydrogenase and formate dehydrogenase were optimized in shake flasks. The effects of carbon and nitrogen source and their concentrations, as well as initial pH of medium on the cell growth and enzyme production were studied. The optimal carbon source was glycerol (10 g/L) and nitrogen source was yeast extract(10 g/L). The optimal initial pH of fermentation medium was 8.0. The induction conditions were further optimized as follows:induction occasion OD600 0.6,induction temperature 25 ℃,IPTG concentration 0.2 mmol/L and induction time 20 h. Under the optimized conditions,a high cell density(OD600)of 8.6 was obtained. The enzyme activity of LeuDH reached 1 543.3 U/L and that of FDH reached 2 572.4 U/L,which were 2.0-fold and 3.1-fold as that before optimization.

Keywords：recombinant E.coli; leucine dehydrogenase; formate dehydrogenase; induction

亮氨酸脫氫酶(leucine dehydrogenase，LeuDH，EC 1.4.1.9)是一種NAD+依賴型的氧化還原酶，在芽胞桿菌屬(Bacillus)中具有較高的表達(dá)水平，首先于Bacilluscereus中被發(fā)現(xiàn)并純化，此后Bacillusspec.、B.sphaerius、B.stearothermophlius、Clostridiumthermoaceticum等產(chǎn)LeuDH菌株相繼被篩選出來[2-5]。LeuDH能夠可逆地催化L-亮氨酸和支鏈L-氨基酸反應(yīng)生成相應(yīng)的α-酮酸及其類似物，可用于測定支鏈脂肪酸及其酮酸類似物，同時(shí)可以催化α-酮酸還原制備L-亮氨酸及L-叔亮氨酸等氨基酸[7-10]。

近年來，不同來源的LeuDH基因工程菌已成功構(gòu)建[11-13]，實(shí)現(xiàn)了LeuDH的高密度表達(dá)和規(guī)?；苽?，并對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了相關(guān)研究，為LeuDH的工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。LeuDH的大規(guī)模應(yīng)用需要添加NADH作為輔酶，而NADH價(jià)格昂貴，不適合工業(yè)上大量使用。因此，構(gòu)建高效的輔酶再生系統(tǒng)是解決LeuDH規(guī)?；瘧?yīng)用難題的關(guān)鍵。NAD+依賴型的甲酸脫氫酶(formate dehydrogenase，F(xiàn)DH，EC 1.2.1.2)屬于D-2-羥基酸脫氫酶類，可以在將甲酸氧化為CO2的同時(shí)將NAD+還原為NADH，因此廣泛應(yīng)用于輔酶NADH的再生中[14-15]。FDH耦聯(lián)的輔酶再生體系具有諸多優(yōu)勢，如反應(yīng)不可逆且生成的副產(chǎn)物CO2易從反應(yīng)體系中逃逸，甲酸或甲酸鹽價(jià)格低廉且對(duì)酶無抑制作用，因此甲酸/FDH輔酶再生體系是目前最成功的輔酶再生系統(tǒng)[16]，且已應(yīng)用到手性化合物的工業(yè)化生產(chǎn)，如Degussa公司采用LeuDH催化三甲基丙酮酸不對(duì)稱還原并與FDH催化的NAD+-NADH再生體系耦聯(lián)，實(shí)現(xiàn)了L-叔亮氨酸的工業(yè)生產(chǎn)。

對(duì)于雙酶耦聯(lián)的生物催化反應(yīng)體系，構(gòu)建雙酶共表達(dá)的基因工程菌不僅可以降低酶制備的成本，還可以提高生產(chǎn)效率，因此近年來相關(guān)研究報(bào)道也越來越多[9,17-19]。本實(shí)驗(yàn)室成員前期從Lysinibacillussphaericus基因組中擴(kuò)增獲得了編碼LeuDH的基因leudh，并將其與來自Candidaboidinii的編碼FDH的基因fdh共表達(dá)，構(gòu)建了基因工程菌E.coliBL21-(LeuDH-FDH)。本文中，筆者在搖瓶中考察影響該重組菌生長和酶蛋白表達(dá)的因素，主要研究碳、氮源種類及其濃度、初始pH、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間等因素對(duì)重組E.coli菌體生長和產(chǎn)酶的影響，優(yōu)化發(fā)酵誘導(dǎo)條件，以期為進(jìn)一步發(fā)酵放大提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1菌種

共表達(dá)LeuDH和FDH的基因工程菌E.coliBL21-(LeuDH-FDH)由筆者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏。

1.2培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10、酵母提取物5，NaCl 10；pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：甘油10、酵母膏10、Na2HPO45.08、KH2PO43、K2SO42、檸檬酸三鈉0.5、MgCl2·6H2O 0.4、CaCl20.011；pH 7.0。其中MgCl2·6H2O 和CaCl2單獨(dú)滅菌，接種時(shí)加入至所需濃度。

當(dāng)考察碳、氮源種類對(duì)發(fā)酵的影響時(shí)，將甘油和酵母膏替換為相應(yīng)的營養(yǎng)組分即可。以上培養(yǎng)基滅菌均在121 ℃滅菌 20 min，接種時(shí)添加過濾除菌的氨芐青霉素(Amp)和卡那霉素(Kana)至終質(zhì)量濃度50 mg/L。

1.3培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：將甘油管保存的菌種按0.1%接種量接種至含Kana和Amp的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)20 h。

發(fā)酵培養(yǎng)及誘導(dǎo)：將種子液按1%接種量接種至含Kana和Amp的發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度0.2 mmol/L，降低培養(yǎng)溫度至25 ℃，200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)16 h。發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液于4 ℃、12 000 r/min離心5 min，收集菌體，生理鹽水(8.5%)洗滌2次，-20 ℃保存，備用。

種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)在250 mL搖瓶中進(jìn)行，裝液量為50 mL。HYL-A型全溫?fù)u瓶柜(太倉市強(qiáng)樂實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，偏心距30 mm。

1.4分析方法

菌體密度測定：菌體密度以O(shè)D600表示，將發(fā)酵液稀釋一定倍數(shù)后用紫外分光光度計(jì)于600 nm處測定吸光值。

菌體破碎液的制備：發(fā)酵所得菌體用0.1 mol/L、pH 8.5磷酸鹽緩沖液懸浮，置于超聲破碎儀中破碎。超聲工作條件：200 W，工作5 s，間歇5 s，99個(gè)循環(huán)。破碎液于4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液用于酶活測定。

LeuDH酶活測定：NADH在340 nm處有最大吸光值，LeuDH活力通過檢測反應(yīng)過程中NADH在340 nm處吸光值的變化計(jì)算。于1.0 mL 磷酸鹽緩沖液(100 mmol/L,pH 8.5)中加入2 mmol/L三甲基丙酮酸、0.1 mmol/L NADH和100 mmol/L NH4Cl，30 ℃保溫3 min后加入10 μL酶液，迅速搖勻后記錄2 min內(nèi)吸光值的變化。酶活單位(U)的定義為在上述反應(yīng)條件下每分鐘催化1 μmol NADH氧化所需的酶量，其計(jì)算見式(1)。

(1)

式中：ΔOD為每分鐘吸光值的變化，V為反應(yīng)體積(L)，6 220為NADH的摩爾消光系數(shù)(L/(mol·cm))，l為光程距離(cm)。

FDH酶活測定：測定原理同LeuDH酶活測定。于1.0 mL磷酸鹽緩沖液(100 mmol/L,pH 8.5)中加入1.67 mmol/L NAD+和167 mmol/L甲酸銨，30 ℃保溫3 min后加入10 μL 酶液，迅速搖勻后記錄2 min內(nèi)吸光值的變化。酶活單位(U)的定義為在上述反應(yīng)條件下每分鐘催化1 μmol NAD+還原所需的酶量，計(jì)算公式同上。

2結(jié)果與討論

2.1碳源對(duì)重組E.coli生長和產(chǎn)酶的影響

2.1.1碳源種類對(duì)重組E.coli生長和產(chǎn)酶的影響

當(dāng)采用野生菌發(fā)酵產(chǎn)LeuDH時(shí)，葡萄糖為最常用的碳源，如Schütte等[20]研究了在10 L發(fā)酵罐中Bacilluscereus產(chǎn)LeuDH的發(fā)酵工藝，當(dāng)添加2%葡萄糖為碳源時(shí)，LeuDH比酶活可達(dá)1 400 U/L。但E.coli對(duì)不同碳源的利用能力不同，進(jìn)而會(huì)影響重組菌的生長和產(chǎn)酶能力。Zhang等[21]研究了碳源種類對(duì)重組E.coli表達(dá)葡聚糖蔗糖酶的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用甘油為碳源時(shí)，葡聚糖蔗糖酶酶活力最高。筆者通過改變發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源的種類(均為5 g/L)，研究不同碳源對(duì)重組E.coli生長及表達(dá)LeuDH和FDH的影響，結(jié)果見表1。由表1可知：蔗糖作為碳源時(shí)不利于E.coli的生長和酶蛋白的表達(dá)；采用葡萄糖、甘露糖和甘油為碳源時(shí)可以促進(jìn)菌體生長，其中以甘油為碳源時(shí)生長狀況最好，LeuDH和FDH活力最高。因此，確定甘油為最適碳源。

2.1.2甘油質(zhì)量濃度對(duì)重組E.coli生長和產(chǎn)酶的影響

確定甘油為最適碳源后，進(jìn)一步考察甘油濃度對(duì)菌體生長和產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知隨著甘油濃度的升高，菌體密度先升高再降低。甘油質(zhì)量濃度為10 g/L時(shí)菌體生長量最高；酶活力隨甘油濃度的變化趨勢與菌體密度相似。因此確定10 g/L的甘油為最適的碳源添加量。

表1　碳源種類對(duì)菌體生長和產(chǎn)酶的影響

圖1　 甘油質(zhì)量濃度對(duì)菌體生長和產(chǎn)酶的影響 Fig.1　 Effects of glycerol concentration on cell growth and enzyme production

2.2氮源對(duì)重組E.coli生長和產(chǎn)酶的影響

2.2.1氮源種類對(duì)重組E.coli生長和產(chǎn)酶的影響

氮源是微生物合成細(xì)胞結(jié)構(gòu)和含氮代謝產(chǎn)物的原料，因此對(duì)菌體生長和酶蛋白的合成具有明顯的影響。Hummel等[22]考察不同氮源對(duì)Bacillussphaericus生長及產(chǎn)LeuDH的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有機(jī)氮源效果明顯好于無機(jī)氮源，如采用酵母膏為氮源時(shí)，菌體OD600可達(dá)51，LeuDH比酶活達(dá)410 U/g。筆者考察不同氮源(均為10 g/L)對(duì)重組E.coli生長和產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如表2所示。由表2可知：無機(jī)氮源不利于重組E.coli生長，而有機(jī)氮源可明顯促進(jìn)菌體生長和蛋白表達(dá)，這一結(jié)果與Hummel等[22]的研究結(jié)果一致，這可能是因?yàn)橛袡C(jī)氮源中含有其他營養(yǎng)組分和生長促進(jìn)劑[21]。由表2中數(shù)據(jù)可知，當(dāng)采用酵母膏為氮源時(shí)，菌體密度和酶活力均明顯高于采用其他氮源時(shí)，因此確定酵母膏為最適氮源。

表2　氮源種類對(duì)菌體生長和產(chǎn)酶的影響

2.2.2酵母膏質(zhì)量濃度對(duì)重組E.coli生長和產(chǎn)酶的影響

進(jìn)一步考察酵母膏用量對(duì)重組E.coli生長和產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知：隨著酵母膏濃度的提高，菌體密度逐漸升高，當(dāng)酵母膏質(zhì)量濃度達(dá)到10 g/L后，菌體生長量基本穩(wěn)定。酶活方面，酵母膏質(zhì)量濃度為10 g/L時(shí)，F(xiàn)DH酶活力最高，而LeuDH酶活在酵母膏濃度為15 g/L時(shí)達(dá)到最高。綜合考慮菌體生長和產(chǎn)酶以及成本等因素，確定最佳的酵母膏質(zhì)量濃度為10 g/L。

圖2　 酵母膏質(zhì)量濃度對(duì)菌體生長和產(chǎn)酶的影響 Fig.2　 Effects of yeast extract concentration on cell growth and enzyme production

2.3初始pH對(duì)重組E.coli生長和產(chǎn)酶的影響

培養(yǎng)基的pH對(duì)微生物的生長代謝和酶蛋白的表達(dá)都有很大的影響，因此考察不同培養(yǎng)基初始pH，對(duì)測定發(fā)酵后重組菌的菌體密度和酶活力的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知：隨著pH的上升，生物量和酶活力均呈上升趨勢，當(dāng)pH達(dá)到 8.0時(shí)，生物量和酶活力均最高，說明培養(yǎng)基初始pH為8.0時(shí)最適合于重組菌的生長和酶表達(dá)。一般大腸桿菌在中性條件下生長情況最好，但因搖瓶發(fā)酵不能自動(dòng)控制發(fā)酵液pH，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，酸性代謝產(chǎn)物的積累會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液pH逐漸下降，因此初始pH略呈堿性時(shí)有利于重組菌的生長和產(chǎn)酶。

圖3　 培養(yǎng)基初始pH對(duì)菌體生長和產(chǎn)酶的影響 Fig.3　 Effects of medium initial pH on cell growth and enzyme production

2.4最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的確定

2.4.1菌株生長曲線的測定

為確定誘導(dǎo)劑加入的最佳時(shí)機(jī)，首先測定不同時(shí)間下的菌液OD600，并繪制菌株生長曲線，結(jié)果見圖4。由圖4可知：在1%接種量下，重組菌在經(jīng)過2 h的延滯期后即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，8 h后生長速率開始下降，10 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。

圖4　 重組大腸桿菌的生長曲線 Fig.4　 Cell growth curve of recombinant E.coli coexpressing LeuDH and FDH

2.4.2誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)重組E.coli生長和產(chǎn)酶的影響

考察誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)菌體生長和產(chǎn)酶的影響，分別在接種后不同時(shí)間取菌液測定OD600，并加入IPTG開始誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時(shí)間均為16 h，結(jié)果見圖5。由圖5可知：延遲期(OD600，0～0.25)加入誘導(dǎo)劑不利于菌體生長，發(fā)酵結(jié)束后菌體密度較低。這主要是因?yàn)镮PTG對(duì)菌體生長有抑制作用，過早誘導(dǎo)不利于菌體的生長[23]，雖然此時(shí)LeuDH酶活較高，但FDH酶活很低；在對(duì)數(shù)前期(OD600，0.4～0.8)進(jìn)行誘導(dǎo)則有利于菌體的生長，其中當(dāng)OD600達(dá)到0.6時(shí)加入誘導(dǎo)劑最利于菌體生長，發(fā)酵結(jié)束后菌體密度最高，且此時(shí)LeuDH和FDH酶活相當(dāng)；而在對(duì)數(shù)中期(OD600，1.0～1.5)進(jìn)行誘導(dǎo)雖有利于FDH酶活提高，但菌體密度和LeuDH酶活則有一定程度地下降。因此確定OD600達(dá)到0.6時(shí)為最佳的誘導(dǎo)時(shí)期，此時(shí)誘導(dǎo)最有利于菌體生長，同時(shí)LeuDH和FDH酶活相當(dāng)。

圖5　 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)菌體生長和產(chǎn)酶的影響 Fig.5　 Effects of adding time of IPTG on cell growth and enzyme production

2.5誘導(dǎo)溫度對(duì)重組E.coli生長和產(chǎn)酶的影響

圖6　 誘導(dǎo)溫度對(duì)菌體生長和產(chǎn)酶的影響 Fig.6　 Effects of induction temperature on cell growth and enzyme production

溫度對(duì)菌體生長、質(zhì)粒穩(wěn)定性和產(chǎn)物蛋白合成等都有重要影響。E.coli最適生長溫度為37 ℃，但過高的誘導(dǎo)溫度可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成速率過快，進(jìn)一步導(dǎo)致蛋白因無法正確折疊而形成無活性的包涵體[24]，因此在進(jìn)行重組菌誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)常常控制誘導(dǎo)溫度在35 ℃以下，以提高可溶性蛋白的表達(dá)。林日輝等[25]考察了誘導(dǎo)溫度對(duì)重組菌表達(dá)FDH的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)30 ℃時(shí)，F(xiàn)DH比酶活最高(170 U/L)，酶活隨溫度升高呈下降趨勢。接種后將重組E.coli在37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.6，加入IPTG并控制至特定溫度開始誘導(dǎo)，考察誘導(dǎo)溫度對(duì)重組E.coli生長和產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖6。由圖6可知：FDH酶活對(duì)高溫敏感，當(dāng)誘導(dǎo)溫度高于30 ℃時(shí)，F(xiàn)DH酶活急劇下降。雖然35 ℃誘導(dǎo)有利于菌體生長，但此時(shí)LeuDH和FDH酶活均較低。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果,確定25 ℃為最佳的誘導(dǎo)溫度。

2.6IPTG濃度對(duì)重組E.coli生長和產(chǎn)酶的影響

考察了IPTG濃度對(duì)重組E.coli生長和產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖7。由圖7可知：對(duì)照組實(shí)驗(yàn)表明，不加IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)，LeuDH和FDH基本不表達(dá)(數(shù)據(jù)未列出)。由圖7可知，當(dāng)加入0.05 mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)，F(xiàn)DH酶活最高，此后FDH酶活隨IPTG濃度的升高而持續(xù)下降，說明高濃度IPTG不利于FDH的表達(dá)。菌體密度和LeuDH酶活則隨IPTG濃度升高呈現(xiàn)先升高再下降的趨勢，這是因?yàn)楦呙芏鹊腎PTG對(duì)重組菌的生長具有抑制作用，同時(shí)也抑制了目的蛋白的誘導(dǎo)合成。綜合菌體生長和酶活力情況，確定最適的IPTG濃度為0.2 mmol/L。

圖7　 IPTG濃度對(duì)菌體生長和產(chǎn)酶的影響 Fig.7　 Effects of IPTG concentration on cell growth and enzyme production

圖8　 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)菌體生長和產(chǎn)酶的影響 Fig.8　 Effects of induction time on cell growth and enzyme production

2.7誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組E.coli生長和產(chǎn)酶的影響

加入IPTG繼續(xù)誘導(dǎo)，考察誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)菌體密度和LeuDH及FDH酶活的影響。由圖8可知，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，菌體密度和酶活均逐漸升高，誘導(dǎo)14 h后,LeuDH酶活基本達(dá)到穩(wěn)定。誘導(dǎo)20 h時(shí)，菌體密度和FDH酶活力達(dá)到最高，其后增長不明顯。最終確定誘導(dǎo)時(shí)間為20 h，此時(shí)菌體密度(OD600)可達(dá)8.6， LeuDH和FDH比酶活分別可達(dá)1 543.3和2 572.4 U/L。

3結(jié)論

以共表達(dá)LeuDH和FDH的基因工程菌E.coliBL21-(LeuDH-FDH)為研究對(duì)象，研究了搖瓶中影響菌體生長和酶蛋白表達(dá)的因素，優(yōu)化了發(fā)酵條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，較佳的碳氮源及其質(zhì)量濃度分別為甘油(10 g/L)和酵母膏(10 g/L)，最適的培養(yǎng)基初始pH為8.0。在此條件下培養(yǎng)至菌體密度(OD600)為0.6時(shí)，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，25 ℃繼續(xù)誘導(dǎo)20 h，菌體密度(OD600)可達(dá)8.6， LeuDH和FDH比酶活分別可達(dá)1 543.3和 2 572.4 U/L，是優(yōu)化前的2.0和3.1倍。

參考文獻(xiàn)：

[1]Sanwal B D,Zink M W.L-leucine dehydrogenase ofBacilluscereus.Arch Biochem Biophys,1961,94(3):430-435.

[2]Ohshima T,Wandrey C,Sugiura M et al.Screening of thermostable leucine and alanine dehydrogenenases in thermophilicBacillusstrains.Biotechnol Lett,1985,7(12):871-875.

[3]Ohshima T,Misono H,Soda K.Properties of crystalline leucine dehydrogenase fromBacillussphaericus.J Biol Chem,1978,253(16):5719-5725.

[4]Ohshima T,Nagata S,Soda K.Purification and characterization of thermostable leucine dehydrogenase fromBacillusstearothermophilus.Arch Microbiol,1985,141(4):407-411.

[5]Shimoi H,Nagata S,Esaki N et al.Leucine dehydrogenase of a thermophilic anaerobe,Clostridiumthermoaceticum:gene cloning,purification and characterization.Agric Biol Chem,1987,51(12):3375-3381.

[6]Ohshima T,Misono H,Soda K.Determination of branched-chain L-amino acids and their keto-analogs with leucine dehydrogenase.Agric Biol Chem,1978,42:1919-1922.

[7]Ohshima T,Wandrey C,Kula M R,et al.Improvement for L-leucine production in a continuously operated enzyme membrane reactor.Biotechnol Bioeng,1985,27(11):1616-1618.

[8]Bommarius A S,Schwarm M,Sting K,et al.Synthesis and use of enantiomerically puretert-leucine.Tetrahedron:Asymmetry,1995,6(12):2851-2888.

[9]Kragl U,Vasic-Racki D,Wandrey C.Continuous production of L-tert-leucine in series of two enzyme membrane reactors.Bioprocess Eng,1996,14(6)：291-297.

[10]Menzel A,Werner H,Altenbuchner J,et al.From enzymes to "designer bugs" in reductive amination:a new process for the synthesis of L-tert-leucine using a whole cell-catalyst.Eng Life Sci,2004,4(6)：573-576.

[11]Tanja S,Achim R,Kula M R.Cloning,sequencing and overexpression of the leucine dehydrogenase gene fromBacilluscereus.J Biotechnol,1997,54(1):77-80.

[12]Reina K,Shinji N,Haruo M.Cloning and sequencing of the leucine dehydrogenase fromBacillussphaericusIFO 3525 and importance of the C-terminal region for the enzyme activity.J Mol Catal B:Enzymatic,2003,23(2):239-247.

[13]Li H M,Zhu D M,Brooke A.Cloning,protein sequence clarification,and substrate specificity of a leucine dehydrogenase fromBacillussphaericusATCC 4525.Appl Biochem Biotechnol,2009,158(2):343-351.

[14]Jormakka M,Byme B,Lwata S.Formate dehydrogenase:a versatale enzyme in changing environments.Curr Opin Struc Biol,2003,13(4):418-423.

[15]Schirwitz K,Schmidt A,Lamzin A S.High-resolution structures of formate dehydrogenase fromCandidaboidinii.Protein Sci,2007,16(6):1146-1156.

[16]Popov V O,Lamzin V S.NAD+-dependent formate dehydrogenase.Biochem J,1994,301(3):625-643.

[17]Ernst M,Kaup B,Müller M,et al.Enantioselective reduction of carbonyl compounds by whole-cell biotransformation,combining a formate dehydrogenase and a(R)-specific alcohol dehydrogenase.App Microb Biotechnol,2005,66(6):629-634.

[18]Kratzer R,Pukl M,Egger S,et al.Whole-cell bioreduction of aromatic α-keto esters usingCandidatenuisxylose reductase andCandidaboidiniiformate dehydrogenase co-expressed inEscherichiacoli.Microb Cell Fact,2008,7:37-48.

[19]Br?utigam S,Dennewald D,Schürmann M,et al.Whole-cell biocatalysis:evaluation of new hydrophobic ionic liquids for efficient asymmetric reduction of prochiral ketones.Enzyme Microb Technol,2009,45(4):310-316.

[20]Schütte H,Hummel W,Tsai H,et al.L-Leucine dehydrogenase fromBacilluscereus:production,large-scale purification and protein characterization.Appl Microbiol Biotechnol,1985,22(5):306-317.

[21]Zhang H B,Mao X Q,Wang Y J,et al.Optimization of culture conditions for high-level expression of dextransucrase inEscherichiacoli.J Food Agric Environ,2009,7(3/4):75-78.

[22]Hummel W,Schütte H,Kula M R.Leucine dehydrogenase fromBacillussphaericus:optimized production conditions and an efficient method for its large-scale purification.Eur J Appl Microbiol Biotechnol,1981(1),12:22-27.

[23]葉逢春,陳銀,邢新會(huì).重組大腸桿菌生產(chǎn)可溶性MBP融合肝素酶的培養(yǎng)條件優(yōu)化.生物加工過程,2006,4(3):28-32.

[24]Wang Y H,Jing C F,Yang B,et al.Production of a new sea anemone neurotoxin by recombinantEscherichiacoli:optimization of culture conditions using response surface methodology.Process Biochem,2005,40(8):2721-2728.

[25]林日輝,梁躍,農(nóng)勉,等.重組NADP+依賴甲酸脫氫酶的表達(dá)及純化.大眾科技,2012,14(12):87-88.

(責(zé)任編輯管珺)