抗生素對(duì)雨生紅球藻無(wú)菌化培養(yǎng)的影響

抗生素對(duì)雨生紅球藻無(wú)菌化培養(yǎng)的影響

孫雯1，黃和1，林海龍2，彭超2，蘇會(huì)波2

(1.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇南京211800；2.中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院，北京102200)

摘要：采用8種常用抗生素對(duì)雨生紅球藻進(jìn)行無(wú)菌化處理，研究抗生素種類及濃度對(duì)雨生紅球藻細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，以確定對(duì)雨生紅球藻細(xì)胞無(wú)害并能抑制伴生雜菌生長(zhǎng)的抗生素種類及使用濃度。結(jié)果表明：培養(yǎng)前期(0～8 d)添加灰黃霉素(0.05 mg/mL)的抑菌效果最好，且對(duì)雨生紅球藻細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制最??；培養(yǎng)中后期(8 d后)，添加青霉素(0.05 mg/mL)所起到的抑菌效果較明顯。另外，當(dāng)分階段添加灰黃霉素(0.05 mg/mL)和青霉素(0.025 mg/mL)時(shí)，雨生紅球藻細(xì)胞密度可達(dá)4.75×106個(gè)/mL(培養(yǎng)18 d)，是空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)組的1.8倍，且其抑菌效果明顯優(yōu)于使用單一抗生素。

關(guān)鍵詞：雨生紅球藻；抗生素；蝦青素；無(wú)菌化培養(yǎng)

doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2015.04.003

收稿日期：2014-05-06

基金項(xiàng)目：國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(2012AA023107)

作者簡(jiǎn)介：孫雯(1991—)，女，江蘇贛榆人，碩士研究生，研究方向：微藻生物技術(shù)；黃和(聯(lián)系人)，教授，E-mail:biotech@njtech.edu.cn

中圖分類號(hào)：Q949.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Effects of antibiotics on axenic culture fromHaematococcuspluvialis

SUN Wen1,HUANG He1,LIN Hailong2,PENG Chao2,SU Huibo2

(1.College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China;

2.Nutrition and Health Research Institute,COFCO,Beijing 102200,China)

Abstract：We studied eight common antibiotics adding to the culture broth to explore axenic cultivation of Haematococcus pluvialis. The optimal antibiotics and concentration were determined. At the earlier stage of the cultivation(0-8 d),relatively lower concentration of griseofulvin(0.05 mg/mL)was beneficial to microalgae cell growth and antibacterial effect than the others. In the middle and later stage of the cultivation(after 8 d),an obvious antibacterial effect was observed when penicillin(0.05 mg/mL)was used as bacteriostatic agent. Furthermore,the combination of griseofulvin (0.05 mg/mL) and penicillin(0.025 mg/mL) had better antibacterial effect than that with single use. After 18 days cultivation,the number of algal cells reached 4.75×106 mL-1, nearly 1.8-fold of the control.

Keywords：Haematococcus pluvialis; antibiotics; astaxanthin; axenic culture

微藻研究領(lǐng)域中，多采用伴有雜藻或雜菌的藻種，但是對(duì)于藻間或藻菌相互作用及兼養(yǎng)和異養(yǎng)等方面的研究均需要以無(wú)菌的藻種為實(shí)驗(yàn)材料，才能確保研究的可靠性。微藻的純種培養(yǎng)和保存是其應(yīng)用的基礎(chǔ)和關(guān)鍵性環(huán)節(jié)，也是研究其生理生化特性、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及藥理學(xué)和毒理學(xué)等必不可少的步驟[2-3]。微藻的無(wú)菌化培養(yǎng)主要采用離心洗滌法、稀釋過(guò)濾法、抗生素法、消毒法、毛細(xì)管顯微鏡分離法和利用特性法(趨向運(yùn)動(dòng)性、耐高鹽性等)。相比較而言，抗生素法比較快速有效，因?yàn)榭股卦诔?、抑菌方面表現(xiàn)出了強(qiáng)大的作用[4-5]。目前，微藻培養(yǎng)無(wú)菌化研究中，抗生素的應(yīng)用主要集中在綠藻、波吉卵囊藻、顫藻、節(jié)旋藻、螺旋藻、球等鞭金藻和紫球藻等方面[6-9]。王江濤等[10]聯(lián)合使用鏈霉素和多粘菌素B作為中肋骨條藻(Skeletonemacostatum)的抑菌劑，取得了較好的抑菌效果。周文禮等[11]研究了氯霉素、遺傳霉素(G418)及青霉素對(duì)小球藻、金藻和小新月菱形藻等海洋餌料微藻生長(zhǎng)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低濃度的青霉素可以促進(jìn)3種微藻細(xì)胞的生長(zhǎng)。

雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)是一種單細(xì)胞淡水微藻[11]，當(dāng)其受到脅迫(鹽、光強(qiáng)度、溫度或pH)后開(kāi)始大量積累蝦青素[12-13]。雨生紅球藻培養(yǎng)時(shí)存在著特異性雜菌污染的問(wèn)題，尤其在規(guī)?；囵B(yǎng)中，雜菌污染會(huì)嚴(yán)重影響產(chǎn)品產(chǎn)量與品質(zhì)，并在一定程度上制約其應(yīng)用。此外，若收獲的雨生紅球藻細(xì)胞中大量的藻細(xì)胞被雜菌污染，將會(huì)導(dǎo)致藻細(xì)胞中天然蝦青素的含量急劇下降，特別是采用大規(guī)模開(kāi)放池培養(yǎng)時(shí)，一旦雜菌污染，不但會(huì)引起染菌爆發(fā)流行,而且會(huì)造成產(chǎn)品絕收。因此，迫切需要選擇合適的抑菌劑對(duì)雨生紅球藻進(jìn)行無(wú)菌化處理，在抑制雜菌和雜藻生長(zhǎng)的同時(shí)，又對(duì)雨生紅球藻細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制效果控制到最低[14]。

筆者主要考察對(duì)雨生紅球藻細(xì)胞生長(zhǎng)抑制影響比較小，但能抑制或消滅伴生雜菌的抗生素[15]，重點(diǎn)考察8種常用抗生素對(duì)雨生紅球藻細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，以初步確定雨生紅球藻培養(yǎng)過(guò)程中較理想的抗生素種類和使用方法，為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)雨生紅球藻的大規(guī)模開(kāi)放式培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1藻種及抗生素來(lái)源

雨生紅球藻原始藻種從中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)購(gòu)買，藻種編號(hào)為FACHB-875，經(jīng)過(guò)一系列分離、純化等工作，獲得了1株性狀優(yōu)良的藻種，藻種編號(hào)為NHRI A753.1。

氨芐青霉素(AMP)、硫酸鏈霉素(STR)、卡那霉素(KAN)、氯霉素(CHL)、青霉素(PEN)、灰黃霉素(GRI)、硫酸慶大霉素(GEN)、頭孢他啶(CAZ)均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2培養(yǎng)基

雨生紅球藻生長(zhǎng)培養(yǎng)基(BBM培養(yǎng)基，g/L)：NaNO3250、K2HPO475、NaCl 25、MgSO4·7H2O 75、CaCl2·2H2O 25、KH2PO4175、維生素B10.001、生物素 0.25×10-6、維生素B120.15×10-6、Na2EDTA 0.75、MnCl2·4H2O 0.041、ZnCl2·7H2O 0.005、Na2MoO4·2H2O 0.004、FeCl3·6H2O 0.097、CoCl2·6H2O 0.002。

1.3培養(yǎng)方法

1.3.1雨生紅球藻培養(yǎng)方法

配制BBM培養(yǎng)液，分裝至100 mL搖瓶中，裝液量50 mL，121 ℃滅菌30 min，冷卻后無(wú)菌條件接入1 mL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雨生紅球藻細(xì)胞，其中包括大部分游動(dòng)細(xì)胞和少量不動(dòng)細(xì)胞。置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照強(qiáng)度2 000 lx，培養(yǎng)溫度25 ℃，光暗比12 h∶12 h，每天按時(shí)搖瓶4次。

1.3.2抗生素母液的配制

8種常用抗生素用蒸餾水配制成母液(10 mg/mL)，0.4 μm細(xì)菌濾膜處理后保存于4 ℃冰箱[16]，備用。

1.3.3除菌抗生素對(duì)雨生紅球藻生長(zhǎng)的影響

1)滅菌培養(yǎng)基及未滅菌培養(yǎng)基中抗生素對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)的影響向滅菌后的和未滅菌的BBM培養(yǎng)基加入抗生素溶液(終質(zhì)量濃度0.1 mg/mL)[16-17]，并將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的藻液按2%接種量接入，按1.3.1節(jié)方法培養(yǎng)，定時(shí)取樣測(cè)定藻細(xì)胞密度，記錄藻細(xì)胞活性，以未加抗生素藻液為對(duì)照，每組設(shè)3個(gè)平行組。

2)抗生素濃度的優(yōu)化已除菌的灰黃霉素、青霉素、氨芐霉素、頭孢他啶和氯霉素各設(shè)4個(gè)質(zhì)量濃度梯度0.05、0.1、0.2 和0.5 mg/mL，分別加入BBM培養(yǎng)液后，再將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的藻液按2%的接種量接入其中，以未加抗生素藻液為對(duì)照，每組設(shè)3個(gè)平行組，培養(yǎng)10 d。

3)抗生素組合使用對(duì)雨生紅球藻細(xì)胞生長(zhǎng)的影響①向BBM培養(yǎng)基中分別加入灰黃霉素、氯霉素和頭孢他啶(0.05 mg/mL)溶液，并將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的藻液按2%的接種量接入，按1.3.1節(jié)方法培養(yǎng)，定時(shí)取樣測(cè)定藻細(xì)胞密度，記錄藻細(xì)胞活性，以未加抗生素藻液為對(duì)照，每組設(shè)3個(gè)平行組，培養(yǎng)18 d。②向BBM培養(yǎng)基中分別加入灰黃霉素、氯霉素和頭孢他啶(0.05 mg/mL)溶液，并將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的藻液按2%接種量接入，按1.3.1節(jié)方法培養(yǎng)，定時(shí)取樣測(cè)定藻細(xì)胞密度，記錄藻細(xì)胞活性，以未加抗生素藻液為對(duì)照，培養(yǎng)至第8天，各加入0.025 mg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)10 d，每組設(shè)3個(gè)平行組。

1.4分析檢測(cè)方法

1.4.1藻細(xì)胞密度測(cè)定方法

紅球藻細(xì)胞數(shù)量的測(cè)量方法采用傳統(tǒng)的血球計(jì)數(shù)板方法[18]。吸取少量搖勻的藻液置于觀察視野為40×10倍的光學(xué)顯微鏡下，記錄藻細(xì)胞總數(shù)，同時(shí)記錄游動(dòng)細(xì)胞與不動(dòng)細(xì)胞的比例。

1.4.2藻細(xì)胞活力的測(cè)定方法

在1.4.1節(jié)基礎(chǔ)上計(jì)算細(xì)胞數(shù)目的增長(zhǎng)速率，同時(shí)參考游動(dòng)細(xì)胞與不動(dòng)細(xì)胞的比例確定藻細(xì)胞的活力。

藻細(xì)胞生長(zhǎng)速率計(jì)算見(jiàn)式(1)。

(1)

式中：x為培養(yǎng)第t天的藻細(xì)胞密度，t為培養(yǎng)時(shí)間。

2結(jié)果與討論

2.1不同種類抗生素對(duì)雨生紅球藻細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

為了同時(shí)考察添加抗生素對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)的影響以及對(duì)雜菌、雜藻生長(zhǎng)的抑制作用，分別考察在滅菌后的培養(yǎng)基中，添加一定量的抗生素對(duì)微藻培養(yǎng)所起到的作用，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1　 滅菌培養(yǎng)基中不同抗生素對(duì)雨生紅球藻生長(zhǎng)的影響 Fig.1　 Effects of different antibiotics on growth of Haematococcus pluvialis in a sterilized culture

圖2　 未滅菌培養(yǎng)基中不同抗生素對(duì)雨生紅球藻生長(zhǎng)的影響 Fig.2　 Effects of different antibiotics on growth of Haematococcus pluvialis in a unsterilized culture

由圖1可知：添加灰黃霉素作為抑菌劑時(shí)，培養(yǎng)至第8天的藻細(xì)胞密度達(dá)到最大值(3.0×106個(gè)/mL)。當(dāng)添加青霉素、氨芐青霉素2種抗生素作為抑菌劑時(shí)，藻細(xì)胞密度達(dá)到1.4×106個(gè)/mL，也高于對(duì)照組的值(1.25×106個(gè)/mL)。添加了灰黃霉素、青霉素及氨芐青霉素的實(shí)驗(yàn)組中，培養(yǎng)至第8～10天時(shí)，藻細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率(μ)分別為0.18、0.14和0.11，都高于對(duì)照組。說(shuō)明這3種抗生素對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的作用較小。另外，當(dāng)添加頭孢他啶作為抑菌劑時(shí)，培養(yǎng)至第8天時(shí)的細(xì)胞密度為1.0×106個(gè)/mL，低于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，而藻細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率(0.25)高于對(duì)照組；氯霉素實(shí)驗(yàn)組在第8天時(shí)細(xì)胞密度為0.8×106個(gè)/mL，此時(shí)μ為0.036，高于對(duì)照組，因此這2種抗生素仍可作為雨生紅球藻無(wú)菌化處理的抑菌劑。綜上所述，灰黃霉素、青霉素、氨芐霉素、頭孢他啶和氯霉素這5種常用抗生素可考慮作為雨生紅球藻無(wú)菌化處理的抑菌劑使用。

為了考察幾種常用抗生素對(duì)雜菌或雜藻的抑制效果，筆者進(jìn)一步考察了向未滅菌的培養(yǎng)基中添加抗生素對(duì)藻細(xì)胞培養(yǎng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知：隨著培養(yǎng)過(guò)程的進(jìn)行，各抗生素添加實(shí)驗(yàn)組的藻細(xì)胞密度和細(xì)胞活性均高于對(duì)照組。這可能是由于在培養(yǎng)初期，添加抗生素對(duì)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生了抑制作用，而隨著培養(yǎng)過(guò)程的進(jìn)行，對(duì)照組藻液中的雜菌不斷滋生，而抗生素的添加抑制了雜菌的滋生，從而更利于藻細(xì)胞的生長(zhǎng)。當(dāng)添加氯霉素、灰黃霉素、頭孢他啶和青霉素作為雨生紅球藻細(xì)胞培養(yǎng)的抑菌劑時(shí)，在培養(yǎng)至第10 天時(shí)，藻細(xì)胞密度分別為0.4×106、0.46×106、0.4×106和0.45×106個(gè)/mL，明顯高于對(duì)照組(0.05×106個(gè)/mL)；此外，培養(yǎng)至第10 天時(shí)，上述4種抗生素實(shí)驗(yàn)組中藻細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率(μ)分別為0.125、0.043、0.037和0.056，也高于包括對(duì)照組在內(nèi)的其他各組中藻細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率。因此，氯霉素、灰黃霉素、頭孢他啶和青霉素在未滅菌培養(yǎng)基中對(duì)其他雜菌、雜藻抑菌效果最為理想。綜合分析圖1與圖2的研究結(jié)果可知，在雨生紅球藻培養(yǎng)過(guò)程中，對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)抑制影響小，同時(shí)對(duì)雜菌或雜藻的抑制能力強(qiáng)的抗生素包括：氯霉素、灰黃霉素、頭孢他啶和青霉素。

2.2不同濃度的抗生素對(duì)雨生紅球藻細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

由上節(jié)的研究結(jié)果可知，灰黃霉素、氯霉素、青霉素以及頭孢他啶這4種優(yōu)選抗生素可以考慮作為無(wú)菌化處理的抑菌劑。因此，綜合考慮4種抗生素對(duì)雜菌、雜藻的抑菌作用以及其對(duì)雨生紅球藻細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效果，考察分別添加灰黃霉素、氯霉素、青霉素以及頭孢他啶這4種抗生素對(duì)雨生紅球藻細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，結(jié)果分別如圖3、圖4、圖5和圖6所示。

圖3　 灰黃霉素濃度對(duì)雨生紅球藻生長(zhǎng)的影響 Fig.3　 Effects of GRI concentration on growth of Haematococcus pluvialis

圖4　 氯霉素濃度對(duì)雨生紅球藻生長(zhǎng)的影響 Fig.4　 Effects of CHL concentration on growth of Haematococcus pluvialis

圖5　 青霉素濃度對(duì)雨生紅球藻生長(zhǎng)的影響 Fig.5　 Effects of PEN concentration on growth of Haematococcus pluvialis

圖6　 頭孢他啶濃度對(duì)雨生紅球藻生長(zhǎng)的影響 Fig.6　 Effects of CAZ concentration on growth of Haematococcus pluvialis

圖7　 灰黃霉素、氯霉素及頭孢他啶單獨(dú)使用對(duì)雨生紅球藻生長(zhǎng)的影響 Fig.7　 Effects of single antibiotics on growth of Haematococcus pluvialis

綜合圖3～圖6可知:在雨生紅球藻培養(yǎng)前期(0～8 d)，除青霉素表現(xiàn)出對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)極大的抑制作用之外，其他3種抗生素的添加均對(duì)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)起到不同程度的促進(jìn)作用。其中，當(dāng)灰黃霉素添加質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL時(shí)，其抑菌效果最優(yōu)，藻細(xì)胞數(shù)量高于對(duì)照組，且培養(yǎng)8 d時(shí)藻細(xì)胞密度達(dá)到最大值(4.25×106個(gè)/mL)；0.05 mg/mL的氯霉素在雨生紅球藻培養(yǎng)中后期(5～10 d)表現(xiàn)出很好的促進(jìn)作用，并且此抗生素濃度下，培養(yǎng)8 d 后的細(xì)胞密度達(dá)(2.2×106個(gè)/mL)；當(dāng)頭孢他啶添加質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL時(shí)，培養(yǎng)5～8 d，藻細(xì)胞數(shù)量和藻細(xì)胞比生長(zhǎng)速率均明顯優(yōu)于對(duì)照組；然而，添加青霉素作為抑菌劑時(shí)，各濃度的青霉素在培養(yǎng)前期對(duì)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)都有較強(qiáng)的抑制作用。在培養(yǎng)后期(8 d之后)，除青霉素添加實(shí)驗(yàn)組外，其他各抗生素實(shí)驗(yàn)組中，雨生紅球藻細(xì)胞數(shù)量和比生長(zhǎng)速率均顯著下降。其中添加0.05 mg/mL的青霉素實(shí)驗(yàn)組中，藻細(xì)胞密度急劇增長(zhǎng)，并且，細(xì)胞密度在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)達(dá)到3.3×106個(gè)/mL。這可能是因?yàn)樵谂囵B(yǎng)前期，藻細(xì)胞對(duì)青霉素的敏感性較強(qiáng)，而在培養(yǎng)后期，隨著藻細(xì)胞數(shù)目的增加，原始藻種內(nèi)伴生的其他微生物大量繁殖，除青霉素外的各抗生素不能夠繼續(xù)起到很好的抑菌效果。

在微藻無(wú)菌化培養(yǎng)的研究中，抗生素作為抑菌劑使用的相關(guān)報(bào)道多集中于各抗生素的單一應(yīng)用，其中Joo 等考察了多種抗生素對(duì)雨生紅球藻生長(zhǎng)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗生素的抑菌效果僅限于10 d以內(nèi)；趙培等[16]研究了常用抗生素在海洋微藻無(wú)菌化培養(yǎng)中的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)僅在培養(yǎng)9 d內(nèi)各抗生素起到了不同程度的抑菌效果。綜上所述，抗生素單獨(dú)使用無(wú)法達(dá)到理想的抑菌效果，并且圖3～圖6的結(jié)果表明：在雨生紅球藻的培養(yǎng)過(guò)程中，單一添加任何常用抗生素作為抑菌劑使用時(shí)的抑菌效果均不完善。因此，考慮將抗生素組合使用，在不同的培養(yǎng)階段添加不同種類和不同濃度的抗生素作為抑菌劑，篩選得到最優(yōu)的抑菌劑使用方法。

2.3抗生素的組合使用

基于2.1與2.2節(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，繼續(xù)考察灰黃霉素、氯霉素及頭孢他啶與青霉素組合使用對(duì)雨生紅球藻細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖7和圖8。

圖8　 灰黃霉素、氯霉素及頭孢他啶與青霉素組合使用對(duì)雨生紅球藻生長(zhǎng)的影響 Fig.8　 Effects of combination use of GRI,CHL,CAZ and PEN on growth of Haematococcus pluvialis

綜合圖7與圖8發(fā)現(xiàn)，各抗生素與青霉素組合使用所起到的抑菌效果明顯優(yōu)于各抗生素單獨(dú)使用。其中，由圖7可知，在培養(yǎng)前期，加入抗生素的實(shí)驗(yàn)組對(duì)藻細(xì)胞起到很好的促進(jìn)作用，而隨著培養(yǎng)過(guò)程的繼續(xù)，其他微生物的滋生導(dǎo)致培養(yǎng)中后期各組細(xì)胞密度驟降；而由圖8發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)至第8 天時(shí)添加青霉素后，包括對(duì)照組在內(nèi)的各組細(xì)胞密度在整個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)程內(nèi)一直處于上升趨勢(shì)，并且灰黃霉素與青霉素組合使用組中，細(xì)胞密度最高(4.75×106個(gè)/mL)，氯霉素與青霉素組合使用效果次之(2.76×106個(gè)/mL)。

3結(jié)論

研究表明，氯霉素、灰黃霉素、頭孢他啶和青霉素這4種常用抗生素均可作為雨生紅球藻無(wú)菌化處理的抑菌劑。綜合考慮抗生素對(duì)雨生紅球藻細(xì)胞生長(zhǎng)的雜藻、雜菌的抑制作用，優(yōu)化得到最適于雨生紅球藻的無(wú)菌化處理方法：培養(yǎng)初期(0～8 d)，添加0.05 mg/mL灰黃霉素作為抑菌劑使用；培養(yǎng)中后期(8 d后)，添加0.025 mg/mL的青霉素作為抑菌劑。通過(guò)分階段添加2種不同抗生素作為抑菌劑，可以有效實(shí)現(xiàn)雨生紅球藻的無(wú)菌化培養(yǎng)。

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(責(zé)任編輯荀志金)