DHA通過抑制PI3K通路和GLUT2表達(dá)而誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞毒性

DHA通過抑制PI3K通路和GLUT2表達(dá)而誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞毒性

閔發(fā)勝1，楊建洪1，黃建軍1，劉啟梁2△

(1國防科技大學(xué)醫(yī)院保健科，湖南 長沙 410073；2第三軍醫(yī)大學(xué)病理生理學(xué)教研室，重慶 400037)

[摘要]目的： 研究二氫青蒿素(dihydroartemisinin, DHA)誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞毒性的分子機(jī)制。方法: 將不同濃度的DHA作用NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549和NCI-H1650細(xì)胞不同時間，運(yùn)用MTT法、克隆形成實驗、Annexin V染色和流式細(xì)胞術(shù)測定DHA對細(xì)胞活力、克隆形成能力和細(xì)胞凋亡的影響；同時測定DHA對細(xì)胞中葡萄糖水平、ATP和乳酸含量的影響；Western blot檢測PI3K通路活性和GLUT2表達(dá)變化；通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染實現(xiàn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體2(GLUT2)和Rheb在A549和NCI-H1650細(xì)胞中高表達(dá)，測定和分析DHA作用下細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡、葡萄糖水平、ATP含量和PI3K通路活性的變化；分析葡萄糖缺乏對DHA誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞毒性的影響。結(jié)果: 與對照組比較，DHA顯著抑制A549和NCI-H1650細(xì)胞活力和克隆形成能力以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時降低ATP和乳酸含量以及抑制細(xì)胞對葡萄糖的攝取，具有時間和劑量依賴效應(yīng)。Western blot結(jié)果顯示，DHA能抑制PI3K通路活性和GLUT2的表達(dá)。上調(diào)GLUT2的表達(dá)和激活PI3K通路能減弱DHA對NSCLC細(xì)胞的毒性作用；葡萄糖缺乏能增強(qiáng)DHA對NSCLC細(xì)胞的毒性；相反，高濃度葡萄糖則抑制DHA對NSCLC細(xì)胞的毒性。結(jié)論: DHA能抑制NSCLC細(xì)胞活力和克隆形成，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，該作用是通過降低PI3K活性和GLUT2的表達(dá)進(jìn)而抑制細(xì)胞糖酵解代謝實現(xiàn)的。

[關(guān)鍵詞]非小細(xì)胞肺癌； 二氫青蒿素； PI3K通路； 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體2； 細(xì)胞毒性

[中圖分類號]R730.23[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.11.007

[文章編號]1000-4718(2015)11-1970-09

[收稿日期]2015-05-11[修回日期] 2015-06-17

通訊作者△Tel: 0719-8272465; E-mail： Zhengxin19740912@163.com

DHA induced cytotoxicity in NSCLC cells via inhibiting PI3K pathway activation and GLUT2 expressionMIN Fa-sheng1, YANG Jian-hong1, HUANG Jian-jun1, LIU Qi-liang2

(1DepartmentofHealthCare,HospitalofNationalUniversityofDefenseTechnology,Changsha410073,China;2DepartmentofPathophysiology,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China.E-mail:zhongliukeyan@163.com)

ABSTRACT[]AIM: To investigate the molecular mechanisms of cytotoxicity induced by dihydroartemisinin (DHA) in non-small cell lung cancer (NSCLC) cells. METHODS: NSCLC cell lines A549 and NCI-H1650 were treated with various concentrations of DHA for indicated time. Subsequently, the effects of DHA on the cell activity, colony formation ability and apoptosis were determined by MTT assay, colony formation assay, Annexin V-FITC/PI staining and flow cytometry, respectively. At the same time, the effects of DHA on glucose, ATP and lactate levels were assessed, and the PI3K pathway activation and glucose transporter 2 (GLUT2) expression were detected by Western blot in the A549 cells and NCI-H1650 cells. Overexpression of GLUT2 and Rheb was established in A549 and NCI-H1650 cells by transfection with GST-GLUT2 and GST-Rheb plasmids, respectively, and the effects of DHA on cell activity, apoptosis, glucose level, ATP content and PI3K pathway activation were analyzed in A549 cells and NCI-H1650 cells. The effect of glucose deprivation on the cytotoxicity triggered by DHA in NSCLC cells was also determined. RESULTS: Compared with control group, DHA significantly inhibited cell activity and colony formation ability, and induced remarkable cell apoptosis in the A549 cells and NCI-H1650 cells. At the same time, DHA reduced ATP and lactate contents, and hindered glucose uptake in a time- and dose-dependent manner in A549 cells and NCI-H1650 cells. The activity of PI3K pathway and GLUT2 expression were downregulated, while upregulated GLUT2 expression and activated PI3K pathway reduced the cytotoxicity induced by DHA in NSCLC cells. Glucose deprivation increased DHA-mediated cytotoxicity in NSCLC cells. On the contrary, high levels of glucose inhibited DHA-mediated cytotoxicity in NSCLC cells. CONCLUSION: DHA restrains cell activity and colony formation, and induces apoptosis. DHA induces cytotoxicity via inhibiting PI3K pathway activation and GLUT2 expression, leading to inhibit glycolytic metabolism in NSCLC cells.

[KEY WORDS]Non-small cell lung cancer; Dihydroartemisinin; PI3K pathway; Glucose transporter 2; Cytotoxicity

肺癌是當(dāng)今世界上嚴(yán)重威脅人類生命與健康的最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在我國居第3位。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung can-cer，NSCLC)是肺癌的主要類型，NSCLC對一些抗癌藥物如它莫西芬和芳香酶抑制劑不敏感[1]。因此，尋找和研發(fā)靶向治療NSCLC的新型藥物是當(dāng)前亟需解決的問題。二氫青蒿素(dihydroartemisinin，DHA)是一種天然存在于青蒿素中具有抗瘧疾功能的中草藥[2]。最新的研究發(fā)現(xiàn)[3-4]，DHA能抑制乳腺癌、宮頸癌、肝癌和胰腺癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提示DHA具有抗腫瘤功能。同時有資料顯示[5]，DHA通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡引起NSCLC細(xì)胞毒性，而對正常細(xì)胞無影響。另研究表明DHA對腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成和免疫調(diào)節(jié)具有重要的調(diào)控作用[6-8]。然而，DHA抗腫瘤功能的分子機(jī)制目前仍不完全清楚。

癌細(xì)胞內(nèi)的生物合成速度和葡萄糖代謝反應(yīng)加快，使得癌細(xì)胞經(jīng)常遭遇代謝應(yīng)激和營養(yǎng)匱乏[9]。因此，癌細(xì)胞通過促進(jìn)葡萄糖攝取和糖酵解代謝從而緩解腫瘤細(xì)胞對營養(yǎng)物的需求[10]。激活mTOR/PI3K通路促進(jìn)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞增殖，同時PI3K通路在細(xì)胞糖代謝過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[11]。最新的研究表明激活mTOR通路能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對葡萄糖的攝入從而促進(jìn)葡萄糖代謝[12]。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(glucose transporter, GLUT)是細(xì)胞攝取葡萄糖所必須，研究發(fā)現(xiàn)GLUT在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，而在正常上皮細(xì)胞中不表達(dá)[13-14]。促進(jìn)GLUT的表達(dá)能夠加速細(xì)胞對葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)從而緩解腫瘤細(xì)胞對葡萄糖的需求[10]。早期的研究發(fā)現(xiàn)雷帕霉素抑制mTOR通路活性進(jìn)而抑制GLUT1的表達(dá)最終抑制細(xì)胞對葡萄糖的攝入[15]。目前，DHA誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞毒性作用的分子機(jī)制仍不清楚。因此，本研究以非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和NCI-H1650細(xì)胞為對象，研究DHA誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞毒性作用可能的分子機(jī)制。

材料和方法

1細(xì)胞株和材料

非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549和NCI-H1650細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所；ATP生物發(fā)光檢測試劑盒、氧化酶法-葡萄糖測定試劑盒、乳酸測定試劑盒、MTT、DMSO、葡萄糖、DHA購自Sigma；DHA溶解于DMSO中，-20℃保存，作用細(xì)胞前用DMEM培養(yǎng)液稀釋至所需濃度；DMEM培養(yǎng)基(Gibco)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、胰蛋白酶和雙抗購自北京金博益生物技術(shù)有限公司；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；GLUT2和β-actin抗體購自Abcam；TSC2、p-TSC2、4EBP1、p-4EBP1、S6和p-S6抗體購自CST；辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG II 抗購自北京中杉金橋公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自Thermo。

2主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)A549和NCI-H1650細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS、1%青霉素和1%鏈霉素的高糖型DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%、CO2及完全濕度的培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右時進(jìn)行細(xì)胞傳代，按細(xì)胞密度傳到相應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中用于后續(xù)試驗。

2.2MTT實驗將生長良好的A549和NCI-H1650細(xì)胞經(jīng)胰酶消化計數(shù)后，以4×104/well接種于96孔板中，細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)；24 h后棄掉培養(yǎng)基，分別加入200 μL不同終濃度的DHA DMEM完全培養(yǎng)基，同時設(shè)置對照組(含DSMO的DMEM完全培養(yǎng)基)，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h和48 h。每孔加入20 μL 5 g/L MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，在搖床上輕微振蕩5 min使結(jié)晶完全溶解，用酶標(biāo)儀測定492 nm處各孔吸光值(A值)。重復(fù)3次，按下列公式計算細(xì)胞活力抑制率：細(xì)胞活力抑制率(%)=(對照組A均值-實驗組A均值)/對照組A均值×100%。

2.3克隆形成實驗將生長良好的A549和NCI-H1650細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后計數(shù)，細(xì)胞以200個/皿接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；向培養(yǎng)皿中加入不同終濃度DHA(0、5、10、20、40 mg/L)DMEM培養(yǎng)基，設(shè)3個平行皿，置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)15 d，直到通過出現(xiàn)肉眼能清晰觀察到可見的細(xì)胞克?。粚⑴囵B(yǎng)液倒掉，用PBS洗滌，甲醇固定10 min，PBS洗滌，吉姆薩染色 10 min，自來水清洗，晾干后計數(shù)，按下列公式計算細(xì)胞克隆形成率：克隆形成率(%)=細(xì)胞克隆數(shù)平均值/鋪板細(xì)胞總數(shù)×100%。

2.4流式細(xì)胞術(shù)實驗生長良好的A549和NCI-H1650細(xì)胞經(jīng)消化后接種到6孔板中，培養(yǎng)24 h后棄掉培養(yǎng)基，加入不同終濃度DHA(0、5、10、20、40 mg/L)DMEM培養(yǎng)基作用48 h，然后用PBS洗滌3次，無EDTA的胰酶消化，離心收集細(xì)胞，按照Annexin V/PI試劑盒說明書操作，先加入500 μL的binding buffer重懸細(xì)胞，再加入5 μL FITC標(biāo)記的Annexin V和5 μL PI混勻，室溫下避光孵育15 min，運(yùn)用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡。

2.5葡萄糖和乳酸含量的測定生長良好的A549和NCI-H1650細(xì)胞經(jīng)消化后以細(xì)胞密度為2.5×105/well接種到12孔板中，培養(yǎng)24 h后棄掉培養(yǎng)基，加入不同終濃度的DHA(0、10、20、40 mg/L)高糖型DMEM培養(yǎng)基分別作用24 h和48 h。收集培養(yǎng)液，12 000 r/min離心10 min去除細(xì)胞碎片，收集上清，用于葡糖糖和乳酸含量的測定。運(yùn)用比色法按照氧化酶法-葡萄糖測定試劑盒說明書測定葡萄糖含量(nmol/L)；乳酸含量測定前，用乳酸測定緩沖液將細(xì)胞上清稀釋100倍，運(yùn)用比色法按照乳酸測定試劑盒使用說明書測定乳酸含量(nmol/L)。

2.6ATP含量測定A549和NCI-H1650細(xì)胞處理條件同實驗2.5，作用24 h，細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌2次，離心收集細(xì)胞。按照ATP生物發(fā)光檢測試劑盒說明書，向細(xì)胞中加入ATP釋放裂解液吹打混勻，冰上裂解30 min。再加入螢光素酶溶液，漩渦振蕩1 min，取100 μL于反應(yīng)管中，立即用熒光分光光度計測定熒光密度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算ATP含量。

2.7細(xì)胞轉(zhuǎn)染GST-GLUT2和GST-Rheb重組表達(dá)載體由本實驗室構(gòu)建。將生長良好的A549和NCI-H1650細(xì)胞以1×106/well接種到6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右時按照脂質(zhì)體2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將5 μL脂質(zhì)體2000和2 μg質(zhì)粒溶解于無血清OptiMEM培養(yǎng)液中，輕輕混勻，室溫靜置10min后加入A549和NCI-H1650細(xì)胞中，培養(yǎng)4 h后換成完全培養(yǎng)基，未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為空白對照，培養(yǎng)48 h用于后續(xù)實驗。

2.8Western blotA549和NCI-H1650細(xì)胞經(jīng)不同終濃度DHA作用不用時間，特定時間收集細(xì)胞。細(xì)胞沉淀中加入RIPA細(xì)胞裂解液(50 mmol/L Tris-HCl pH 7.5，150 mmol/L NaCl，1% NP-40，0.5% 脫氧膽酸鈉，0.1% SDS)，超聲破碎、12 000 r/min，4℃離心10 min，按照BCA試劑盒說明書測定總蛋白濃度。每個樣本以30 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別孵育 I 抗(GLUT2、GLUT4、TSC2、p-TSC2、4EBP1、p-4EBP1、S6、p-S6和β-actin)，4 ℃過夜。洗膜、孵育HRP-IgG II抗，室溫1 h。ECL顯影后掃描，蛋白相對表達(dá)量經(jīng)內(nèi)參照歸一化后經(jīng)Quantity-One軟件分析。

2.9葡萄糖對細(xì)胞增殖和凋亡的影響A549和NCI-H1650細(xì)胞培養(yǎng)在無葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基(含10% FBS、1%青霉素和1%鏈霉素)，傳代培養(yǎng)3 d。分別以4×104/well和4.5×105/well接種于96孔板和6孔板中，細(xì)胞貼壁后加入不同葡萄糖濃度(0、2、4、8 nmol/L)+40 mg/L DHA的DMEM培養(yǎng)基(不含葡萄糖，含10% FBS、1%青霉素和1%鏈霉素)，繼續(xù)作用48 h。按照MTT法，克隆形成實驗和Annexin V/PI試劑盒說明書測定細(xì)胞活性、克隆形成和細(xì)胞凋亡。

3統(tǒng)計學(xué)處理

每個實驗進(jìn)行3次獨立重復(fù)實驗。應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，兩組之間的比較采用t檢驗，多組間的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1DHA抑制NSCLC細(xì)胞活力和克隆形成

將不同濃度的DHA處理A549和NCI-H1650細(xì)胞24 h和48 h后，運(yùn)用MTT法和克隆形成實驗測定細(xì)胞活力和細(xì)胞克隆形成能力。結(jié)果表明DHA能顯著抑制A549和NCI-H1650的細(xì)胞活力(P<0.05)，并具有時間和劑量依賴效應(yīng)，DHA對A549細(xì)胞活力的半數(shù)抑制濃度分別為41.3 mg/L(24 h)和27.5 mg/L(48 h)，DHA對NCI-H1650細(xì)胞活力的IC50分別為42.3 mg/L(24 h)和38.7 mg/L(48 h)?？寺⌒纬蓪嶒炦M(jìn)一步證實DHA能顯著抑制A549和NCI-H1650細(xì)胞的克隆形成能力(P<0.05)，隨著DHA濃度的增加，細(xì)胞的克隆形成率逐漸降低，見圖1。

2Annexin V-FITC染色和流式細(xì)胞術(shù)測定DHA誘導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞凋亡

隨著DHA濃度的增加，早期細(xì)胞凋亡率無顯著變化，晚期細(xì)胞凋亡率與DHA濃度呈劑量依賴效應(yīng)；DHA處理的A549和NCI-H1650細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組(P<0.01)，見圖2。

Figure 1.DHA inhibited cell growth and colony formation in A549 cells and NCI-H1650 cells. Mean±SEM.n=6.*P<0.05,**P<0.01vs0 mg/L group.

圖1DHA抑制A549和NCI-H1650細(xì)胞活力和克隆形成能力

Figure 2.DHA induced apoptosis in A549 cells and NCI-H1650 cells determined by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI staining. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vs0 mg/L group.

圖2DHA誘導(dǎo)A549和NCI-H1650細(xì)胞凋亡

3DHA抑制NSCLC細(xì)胞的糖酵解代謝

DHA能抑制A549和NCI-H1650細(xì)胞對葡萄糖的攝入，經(jīng)DHA作用的NSCLC細(xì)胞其葡萄糖攝入量顯著低于對照組(P<0.01)，并呈時間和劑量依賴效應(yīng)。10 mg/L DHA對A549和NCI-H1650細(xì)胞中ATP和乳酸含量無影響；當(dāng)DHA濃度大于20 mg/L時，細(xì)胞內(nèi)的ATP和乳酸含量顯著降低(P<0.01)，并呈劑量依賴效應(yīng)。

Figure 3.DHA inhibited glycolytic metabolism in A549 cells and NCI-H1650 cells. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 mg/L group.

圖3DHA抑制A549和NCI-H1650細(xì)胞的糖酵解代謝

4DHA通過抑制PI3K通路活性和GLUT2表達(dá)抑制糖酵解代謝

將A549和NCI-H1650細(xì)胞經(jīng)DHA作用48 h后，Western blot檢測PI3K信號通路中關(guān)鍵蛋白(4EBP1和TSC-2)的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)DHA能誘導(dǎo)4EBP1和TSC-2蛋白磷酸化，隨著DHA濃度的增加，4EBP1和TSC-2蛋白磷酸化水平逐漸降低，呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。然后用40 mg/L DHA作用A549細(xì)胞不同時間(0～24 h)后發(fā)現(xiàn)4EBP1和TSC-2蛋白磷酸化水平逐漸降低，并呈時間-依賴效應(yīng)。同時，研究DHA對GLUT2 和 GLUT4表達(dá)的影響，結(jié)果顯示DHA處理的NSCLC細(xì)胞中GLUT2的表達(dá)顯著下調(diào)，并呈劑-量依賴效應(yīng)，而GLUT4的表達(dá)無明顯變化。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，DHA顯著誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡(18 h和24 h)(P<0.05)，而6 h和12 h的細(xì)胞凋亡率與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。A549細(xì)胞對葡萄糖攝入量顯著低于對照組，并具有時間依賴效應(yīng)，見圖4。

Figure 4.DHA suppressed glycolytic metabolism via inhibiting PI3K pathway activation and GLUT2 expression. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 mg/L group.

圖4DHA通過抑制PI3K通路活性和GLUT2表達(dá)抑制糖酵解代謝

5上調(diào)PI3K通路活性促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的糖酵解代謝和細(xì)胞增殖

上述研究顯示DHA抑制糖酵解代謝和NSCLC細(xì)胞增殖與PI3K活性降低相關(guān)，而增強(qiáng)PI3K的活性能否減弱由DHA對糖酵解代謝和NSCLC細(xì)胞增殖的抑制作用？本研究發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞中Rheb的過表達(dá)能促進(jìn)GLUT2的表達(dá)和4EBP1蛋白磷酸化；相反，DHA能抑制GLUT2的表達(dá)和4EBP1蛋白磷酸化，提示Rheb過表達(dá)能激活PI3K信號通路，而DHA能抑制Rheb對PI3K通路的激活。同時，DHA顯著抑制A549細(xì)胞增殖和細(xì)胞對葡萄糖的攝入以及ATP的產(chǎn)生，而Rheb的過表達(dá)能抑制DHA的這一功能，見圖5。

Figure 5.Upregulated PI3K pathway activation promoted glycolytic metabolism and growth in A549 cells. A549 cells were transfected with control or Rheb vector, and then treated with the indicated concentration of DHA for 48 h. Mean ± SEM.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖5上調(diào)PI3K通路活性促進(jìn)A549細(xì)胞糖酵解代謝和提高細(xì)胞活力

6GLUT2過表達(dá)抑制由DHA介導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞毒性

以上的研究表明DHA通過下調(diào)GLUT2的表達(dá)抑制NSCLC細(xì)胞對葡萄糖的攝入，從而誘導(dǎo)細(xì)胞毒性?；谶@一發(fā)現(xiàn)，有必要研究GLUT2的過表達(dá)能否抑制DHA對NSCLC細(xì)胞的毒性作用。結(jié)果顯示外源性GST-GLUT2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的A549和NCI-H1650細(xì)胞中GLUT2的表達(dá)顯著高于對照組(未轉(zhuǎn)染細(xì)胞)。轉(zhuǎn)染的NSCLC細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，高表達(dá)GLUT2的細(xì)胞存活率顯著高于對照組(未轉(zhuǎn)染細(xì)胞)(P<0.01)；當(dāng)細(xì)胞經(jīng)40 mg/L DHA作用48 h后，高表達(dá)GLUT2的細(xì)胞存活率顯著低于溶劑對照組(DMSO處理的細(xì)胞)(P<0.01)，但仍顯著高于對照組(DHA未處理的細(xì)胞)，見圖6。

7高濃度葡萄糖能抑制DHA對NSCLC細(xì)胞的毒性作用

本研究提示DHA通過抑制NSCLC細(xì)胞對葡萄糖的攝入和糖酵解代謝從而誘導(dǎo)細(xì)胞毒性作用。為了進(jìn)一步證實這一結(jié)果，用不同濃度的葡萄糖培養(yǎng)A549和NCI-H1650細(xì)胞，觀察葡萄糖缺乏能否增強(qiáng)DHA的細(xì)胞毒性作用。結(jié)果如圖7所示，當(dāng)培養(yǎng)基中無葡萄糖存在時(0 mmol/L)，細(xì)胞存活率為59.4%(A549細(xì)胞)和62.5%(NCI-H1650細(xì)胞)，顯著高于DHA(40 mg/L)作用下細(xì)胞存活率(P<0.01)；隨著葡萄糖濃度的增加(2、4、8 mmol/L)，細(xì)胞存活率逐漸升高。當(dāng)葡萄糖濃度為8 mmol/L時，細(xì)胞存活率幾乎不受影響；克隆形成實驗也能觀察到相似的結(jié)果，提示葡萄糖匱乏能誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞毒性，而葡萄糖能減弱DHA對細(xì)胞的毒性作用。高濃度葡萄糖能否抑制由DHA誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞凋亡，A549和NCI-H1650細(xì)胞經(jīng)不同濃度葡萄糖培養(yǎng)48 h后，Annexin V-FITC/PI染色結(jié)果顯示，無葡萄糖存在時(0 mmol/L)細(xì)胞凋亡率為25%(A549細(xì)胞)和20%(NCI-H1650細(xì)胞)，而40 mg/L DHA單獨作用下細(xì)胞凋亡率為52%(A549細(xì)胞)和61%(NCI-H1650細(xì)胞)，隨著葡萄糖濃度的增加細(xì)胞凋亡率逐漸降低。

Figure 6.Overexpression of GLUT2 inhibited cell death triggered by DHA in A549 cells and NCI-H1650 cells. A549 cells and NCI-H1650 cells were transfected with control or GLUT2 vector, and then treated with the indicated concentration of DHA for 48 h. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖6GLUT2過表達(dá)抑制由DHA介導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞死亡

討論

最新的研究發(fā)現(xiàn)DHA能抑制肝癌、胰腺癌和前列腺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[3-4,16]。本研究結(jié)果中，DHA具有抑制A549和NCI-H1650細(xì)胞活力和克隆形成能力以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性，且呈劑-量依賴效應(yīng)，與上述文獻(xiàn)報道一致。此外，本研究首次發(fā)現(xiàn)DHA能夠抑制NSCLC細(xì)胞的糖酵解代謝。有研究發(fā)現(xiàn)PI3K通路在細(xì)胞糖代謝過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，激活mTOR通路能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對葡萄糖的攝入從而促進(jìn)葡萄糖代謝[11-12]。在卵巢癌細(xì)胞和橫紋肌肉瘤細(xì)胞中的研究也發(fā)現(xiàn)DHA能抑制mTOR通路活性[17-18]。本研究在NSCLC細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn)DHA能抑制PI3K通路活性和葡萄糖代謝以及A549細(xì)胞對葡萄糖的攝入，并呈時間-依賴效應(yīng)。此外，40 mg/L DHA作用12 h的A549細(xì)胞的凋亡率與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示DHA抑制糖酵解代謝是通過抑制PI3K通路活性，而不是激活細(xì)胞凋亡通路。

有研究表明GLUT在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，而在正常上皮細(xì)胞中不表達(dá)[13-14]。促進(jìn)GLUT的表達(dá)能夠加速細(xì)胞對葡萄糖攝取從而滿足腫瘤細(xì)胞對葡萄糖的需求[10]。早期的研究發(fā)現(xiàn)雷帕霉素抑制mTOR通路活性進(jìn)而抑制GLUT1的表達(dá)最終抑制細(xì)胞對葡萄糖的攝入[15]。我們在NSCLC細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn)DHA能抑制GLUT2的表達(dá)，而GLUT2的高表達(dá)能夠減輕DHA對NSCLC細(xì)胞的抑制作用。在血管平滑肌細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn)GSK-3/TSC2/mTOR通路能夠調(diào)控GLUT1的表達(dá)[19]。糖酵解代謝受多種蛋白激酶調(diào)節(jié)，有研究表明PI3K對糖酵解代謝起正調(diào)控作用[11]。為揭示DHA是否通過抑制PI3K通路活性進(jìn)而抑制糖酵解代謝，最終發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，將A549和NCI-H1650細(xì)胞經(jīng)DHA作用48 h后檢測PI3K信號通路中關(guān)鍵蛋白(4EBP1和TSC-2)的表達(dá)情況。Western blot結(jié)果顯示NSCLC細(xì)胞中PI3K活性下調(diào)(p-4EBP1和p-TSC2表達(dá)降低)，同時發(fā)現(xiàn)GLUT2的表達(dá)被抑制且具有PI3K活性依賴關(guān)系，而上調(diào)PI3K的活性(A549細(xì)胞中Rheb的過表達(dá))能促進(jìn)GLUT2的表達(dá)和4EBP1蛋白磷酸化，提示PI3K通路調(diào)控GLUT2的表達(dá)。因此，本研究表明DHA通過抑制PI3K通路活性從而下調(diào)GLUT2的表達(dá)，最終抑制細(xì)胞對葡萄糖的攝入。

癌細(xì)胞內(nèi)的生物合成速度和葡萄糖代謝反應(yīng)加快，使得癌細(xì)胞經(jīng)常遭遇代謝應(yīng)激和營養(yǎng)匱乏[9]。因此，本研究將NSCLC細(xì)胞培養(yǎng)在低濃度葡萄糖或無葡萄糖的培養(yǎng)基中，觀察NSCLC細(xì)胞遭遇代謝應(yīng)激時的生理反應(yīng)。結(jié)果表明，DHA作用下葡萄糖缺乏能誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞毒性；DHA和葡萄糖匱乏聯(lián)合作用的NSCLC細(xì)胞死亡率顯著高于DHA單獨作用下的細(xì)胞死亡率。癌細(xì)胞在葡萄糖匱乏或葡萄糖濃度較低時ATP含量顯著降低，線粒體死亡通路被激活從而促進(jìn)氧化應(yīng)激和激活MAPK信號通路[20-22]。本研究結(jié)果顯示，GLUT2高表達(dá)抑制DHA對A549和NCI-H1650細(xì)胞的毒性作用，而高濃度葡萄糖能抑制DHA對NSCLC細(xì)胞的毒性作用；研究證實GLUT2的過表達(dá)增加葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)速度，促進(jìn)細(xì)胞對葡萄糖的攝取[10]。本研究發(fā)現(xiàn)DHA作用下NSCLC細(xì)胞中ATP和乳酸含量顯著降低，并呈濃度依賴效應(yīng)，提示DHA抑制NSCLC細(xì)胞對葡萄糖的攝入是其誘導(dǎo)細(xì)胞毒性作用可能的分子機(jī)制。

Figure 7.High glucose restrained DHA-induced cytotoxicity in A549 cells and NCI-H1650 cells. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vsDMSO-treated cells.

圖7高濃度葡萄糖抑制由DHA誘導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞毒性作用

DHA能誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞凋亡，并具有時間和劑量依賴效應(yīng)，但DHA誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制仍不清楚。研究表明DHA通過線粒體依賴性通路誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡[23]。最新的研究發(fā)現(xiàn)DHA與電離輻射聯(lián)合作用顯著誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，且不依賴于線粒體依賴性通路[24]。DHA與阿霉素聯(lián)合作用通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡從而對乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用[25]。本研究也證實，DHA誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，而葡萄糖能減弱DHA對NSCLC細(xì)胞毒性和DHA介導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞凋亡。然而，對DHA誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞凋亡的具體分子機(jī)制有必要做深入研究。

綜上所述，本研究表明DHA顯著抑制NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549和NCI-H1650細(xì)胞的增殖和克隆形成能力以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并具有時間-劑量依賴效應(yīng)。此外，本研究首次發(fā)現(xiàn)DHA能抑制NSCLC細(xì)胞的糖酵解代謝，且DHA對糖酵解代謝的抑制作用與PI3K通路活性和GLUT2表達(dá)下調(diào)相關(guān)，這一發(fā)現(xiàn)可能是DHA誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞毒性作用的分子機(jī)制，提示DHA有望成為治療NSCLC潛在的新型抗腫瘤藥物。然而，DHA抗腫瘤功能的生物學(xué)信息有待進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]石歆. 桔皮素對人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長及侵襲的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(3): 452-456.

[2]葉燕霞, 曾耀英, 黃秀艷, 等. 雙氫青蒿素對小鼠 T 細(xì)胞的免疫抑制作用[J]. 中國病理生理雜志, 2010, 26(3): 417-423.

[3]Zhang S, Ma Y, Jiang J, et al. Inhibition of urokinase-type plasminogen activator expression by dihydroartemisinin in breast cancer cells[J]. Oncol Lett, 2014, 7(5):1375-1380.

[4]Kong R, Jia G, Cheng ZX, et al. Dihydroartemisinin enhances Apo2L/TRAIL-mediated apoptosis in pancreatic cancer cells via ROS-mediated up-regulation of death receptor 5[J]. PLoS One, 2012, 7(5):e37222.

[5]Zhou HJ, Zhang JL, Li A, et al. Dihydroartemisinin improves the efficiency of chemotherapeutics in lung carcinomasinvivoand inhibits murine Lewis lung carcinoma cell line growthinvitro[J].Cancer Chemother Pharm, 2010, 66(1):21-29.

[6]周喜漢, 黃贊松, 向發(fā)良. 中藥抗結(jié)直腸癌作用的研究進(jìn)展[J]. 世界華人消化雜志, 2013, 21(18): 1720-1725.

[7]Wang SJ, Sun B, Cheng ZX, et al. Dihydroartemisinin inhibits angiogenesis in pancreatic cancer by targeting the NF-κB pathway[J]. Cancer Chemother Pharm, 2011, 68(6):1421-1430.

[8]Zhao YG, Wang Y, Guo Z, et al. Dihydroartemisinin ameliorates inflammatory disease by its reciprocal effects on Th and regulatory T cell function via modulating the mammalian target of rapamycin pathway[J]. J Immunol, 2012, 189(9):4417-4425.

[9]Ariffin AB, Forde PF, Jahangeer S, et al. Releasing pressure in tumors: what do we know so far and where do we go from here? A review[J]. Cancer Res, 2014, 74(10):2655-2662.

[10]Li X, Luo H, Paul SC, et al. Downregulation of the expression of GLUT1 plays a role in apoptosis induced by sodium butyrate in HT-29 cell line[J]. Int J Mol Sci, 2006, 7(3):59-70.

[11]Laplante M, Sabatini DM. mTOR signaling in growth control and disease[J]. Cell, 2012, 149(2):274-293.

[12]Cornu M, Albert V, Hall MN. mTOR in aging, metabolism, and cancer[J]. Curr Opin Genet Dev, 2013, 23(3):53-62.

[13]王瑋, 蔡建輝, 馬毓梅, 等. GLUT4 在多囊卵巢綜合征大鼠子宮內(nèi)膜中的表達(dá)及意義[J]. 中國病理生理雜志, 2007, 23(3): 587-590.

[14]Cai Y, Zhai JJ, Feng BB, et al. Expression of glucose transporter protein 1 and p63 in serous ovarian tumor[J]. J Obstet Gynaecol Re, 2014, 40(7):1925-1930.

[15]Cheng SC, Quintin J, Cramer RA, et al. mTOR- and HIF-1α-mediated aerobic glycolysis as metabolic basis for trained immunity[J]. Science, 2014, 345(6204):1250684.

[16]Buller CL, Loberg RD, Fan MH, et al. A GSK-3/TSC2/mTOR pathway regulates glucose uptake and GLUT1 glucose transporter expression[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2008, 295(3):C836-C843.

[17]He Q, Shi J, Shen XL, et al. Dihydroartemisinin upregulates death receptor 5 expression and cooperates with TRAIL to induce apoptosis in human prostate cancer cells[J]. Cancer Biol Ther, 2010, 9(10):819-824.

[18]Feng X, Li L, Jiang H, et al. Dihydroartemisinin potentiates the anticancer effect of cisplatin via mTOR inhibition in cisplatin-resistant ovarian cancer cells: involvement of apoptosis and autophagy[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2014, 444(3):376-381.

[19]Odaka Y, Xu B, Luo Y, et al. Dihydroartemisinin inhibits the mammalian target of rapamycin-mediated signaling pathways in tumor cells[J]. Carcinogenesis, 2014, 35(1):192-200.

[21]El Mjiyad N, Caro-Maldonado A, Ramirez-Peinado S, et al. Sugar-free approaches to cancer cell killing[J]. Oncogene, 2011, 30(3): 253-264.

[22]Raina K, Agarwal C, Wadhwa R, et al. Energy deprivation by silibinin in colorectalcancer cells: a double-edged sword targeting both apoptotic and autophagic machineries[J]. Autophagy, 2013, 9(5):697-713.

[23]Lu M, Sun L, Zhou J, et al. Dihydroartemisinin induces apoptosis in colorectal cancer cells through the mitochondria-dependent pathway[J]. Tumour Biol, 2014, 35(6):5307-5314.

[24]Chen T, Chen M, Chen J. Ionizing radiation potentiates dihydroartemisinin-induced apoptosis of A549 cells via a caspase-8-dependent pathway[J]. PLoS One, 2013, 8(3): e59827.

[25]Wu GS, Lu JJ, Guo JJ, et al. Synergistic anti-cancer activity of the combination of dihydroartemisinin and doxorubicin in breast cancer cells[J]. Pharmacol Rep, 2013, 65(2):453-459.

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅森)