人羊膜上皮細(xì)胞移植改善AD樣病變模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力

人羊膜上皮細(xì)胞移植改善AD樣病變模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力*

董世桃1，方寧1，胡龍淼1，陳代雄1△，趙春華2

(1遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563003；2中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所組織工程研究中心，北京 100005)

[摘要]目的： 觀(guān)察人羊膜上皮細(xì)胞(hAECs)對(duì)阿爾茨海默病(AD)樣病變大鼠模型的治療效應(yīng)。方法: 采用胰蛋白酶消化法分離hAECs，流式細(xì)胞術(shù)分析表型。48只雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、培養(yǎng)基組和hAECs移植組，每組12只。采用雙側(cè)腦室注入脂多糖(LPS)復(fù)制AD樣病變大鼠模型。AD樣病變大鼠海馬區(qū)移植5×105個(gè)hAECs。細(xì)胞移植后2周，Morris水迷宮試驗(yàn)觀(guān)察行為學(xué)變化，HE和硫磺素S染色觀(guān)察海馬病理變化，免疫組化染色檢測(cè)β-淀粉樣蛋白42(Aβ42)、Tau蛋白和乙酰膽堿(ACh)的變化， 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血T淋巴細(xì)胞亞群的變化，流式微球陣列捕獲技術(shù)(cytometric bead array，CBA)檢測(cè)血清細(xì)胞因子含量，免疫熒光染色檢測(cè)海馬區(qū)人細(xì)胞核抗原陽(yáng)性細(xì)胞及其神經(jīng)元特異性核蛋白(NeuN)的表達(dá)。結(jié)果: 與模型組和培養(yǎng)基組比較，hAECs移植組大鼠逃避潛伏期明顯縮短(P<0.01)，跨域平臺(tái)次數(shù)明顯增加(P<0.05)；海馬神經(jīng)元病損減輕，Aβ沉積減輕(P<0.05)，磷酸化Tau蛋白水平下降(P<0.05),ACh增加(P<0.05)；外周血Th1和Th17細(xì)胞百分比下降(P<0.05)，而Th2和Treg細(xì)胞升高(P<0.05)；IL-2和IFN-γ水平下調(diào)(P<0.05)，而IL-4上調(diào)(P<0.05)；移植區(qū)可見(jiàn)hAECs，并表達(dá)NeuN。結(jié)論: hAECs可明顯改善AD樣病變模型大鼠空間辨別性學(xué)習(xí)記憶能力，減輕海馬病理?yè)p傷，其免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)可能發(fā)揮重要作用。

[關(guān)鍵詞]阿爾茨海默病； 人羊膜上皮細(xì)胞； β-淀粉樣蛋白； 學(xué)習(xí)記憶障礙

[中圖分類(lèi)號(hào)]R392.1[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.11.019

[文章編號(hào)]1000-4718(2015)11-2047-06

[收稿日期]2015-08-20[修回日期] 2015-10-12

[基金項(xiàng)目]*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 30901542)；廣東省自然科學(xué)基金自由申請(qǐng)項(xiàng)目(No. 2014A030313055)；產(chǎn)學(xué)研合作項(xiàng)目(No. 2014B090901043)；廣東省科技計(jì)劃(No. 2012B031800056)；中山大學(xué)高?；緲I(yè)務(wù)費(fèi)青年教師培育資助項(xiàng)目(No. 12ykpy44)

通訊作者△Tel: 020-85252170； E-mail: doctorwanghui@126.com

Transplantation of human amnion epithelial cells improves learning and memory function in Alzheimer’s disease-like pathology rat modelDONG Shi-tao1, FANG Ning1, HU Long-miao1, CHEN Dai-xiong1, ZHAO Chun-hua2

(1KeyLaboratoryofCellEngineeringofGuizhouProvince,AffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi563003,China;2CenterofTissueEngineering,InstituteofBasicMedicalSciences,ChineseAcademyofMedicalSciences,Beijing100005,China.E-mail:cellgene@163.com)

ABSTRACT[]AIM: To observe the treatment effect and its immune regulation of human amnion epithelial cells (hAECs) on Alzheimer’s disease (AD)-like pathology rat model. METHODS: The hAECs were isolated from amnion with trypsin digestion, and the phenotype of hAECs was analyzed by flow cytometry. SD rats (n=48) were randomly divided into sham control group, model group, medium group and hAECs group. AD-like pathology rat model was induced by bilateral intraventricular injection of lipopolysaccharide (LPS). hAECs (5×105) were injected into the hippocampus of the AD-like pathology rats. At 2 weeks after transplantation, the animals were tested by Morris water maze to observe the function of learning and memory. The pathological change of the brain was observed by HE staining. The expression of amyloid β-protein 42 (Aβ42) and Tau protein and the level of acetylcholine (ACh) in the injury brain were determined by immunohistochemistry. The survival and differentiation of hAECs in the hippocampus were measured by immunofluorescent technique. The percentages of lymphocyte subsets in the peripheral blood mononuclear cells were analyzed by flow cytometry. The contents of serum cytokines were detected by cytometric bead array. RESULTS: Compared with model group and medium group, hAECs group showed shortened escape latency (P<0.01), increased frequency of going through the platform (P<0.05), reduced loss of hippocampal neurons, decreased expression of Tau protein and Aβ42 in the hippocampus (P<0.05), increased ACh level in the hippocampus (P<0.05), decreased percentages of Th1 and Th17 subsets, increased percentages of Th2 and Treg cells (P<0.05), decreased concentrations of IFN-γ and IL-2 in the serum, and increased concentration of IL-4 (P<0.05). CONCLUSION: hAECs improve the cognitive learning and memory function and alleviate pathologic damage of hippocampus through immune regulation in AD-like pathology rats.

[KEY WORDS]Alzheimer’s disease; Human amniotic epithelial cells; Amyloid β-protein; Learning and memory impairment

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種常見(jiàn)的退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，治療方法十分有限。隨著干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展和對(duì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的深入了解，干細(xì)胞移植可望成為治療AD的有效手段。近年來(lái)，人們對(duì)人羊膜上皮細(xì)胞(human amniotic epithelial cells，hAECs)的生物學(xué)特性進(jìn)行了深入的研究，證明從足月分娩胎盤(pán)羊膜分離的hAECs仍保留了胚胎干細(xì)胞的某些特性，不表達(dá)HLA-A、B、C、DR抗原和共刺激分子(B7-1和B7-2)[1-2]，能合成、釋放多巴胺、乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)和多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子[3-4]。hAECs的這些生物學(xué)特性為治療神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病提供了可能。目前尚未見(jiàn)有關(guān)hAECs治療AD的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在觀(guān)察hAECs移植對(duì)AD樣病變大鼠模型的治療效應(yīng)及其可能機(jī)制，為臨床治療AD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1動(dòng)物

清潔級(jí)成年雄性SD大鼠48只，體重250～300 g，購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SCXK (渝) 2012-0006。實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物處置符合科技報(bào)《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)意見(jiàn)》的規(guī)定。

2主要試劑

LG-DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco；用于流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)的熒光標(biāo)記抗體和細(xì)胞因子流式細(xì)胞微球陣列(cytometric bead array，CBA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BD；鼠抗人波形蛋白抗體、脂多糖和硫磺素S購(gòu)自Sigma；鼠抗人CK19 抗體購(gòu)自GeneTech；鼠抗人細(xì)胞核抗原抗體、小鼠抗大鼠乙酰膽堿(ACh)抗體和熒光標(biāo)記的小鼠抗大鼠神經(jīng)元特異性核蛋白(NeuN)抗體購(gòu)自Millipore；兔抗大鼠β-淀粉樣蛋白42(amyloid β-protein 42，Aβ42)抗體和磷酸化Tau抗體購(gòu)自Abcam。

3主要方法

3.1hAECs分離、培養(yǎng)及表型分析經(jīng)產(chǎn)婦知情同意采集足月剖宮產(chǎn)胎盤(pán)，按本室建立的方法從羊膜提取hAECs[5]。將分離的hAECs懸浮于含10% 胎牛血清、1% GlutaMAX、1%β-巰基乙醇、1%非必需氨基酸(non-essential amino acid，NEAA)和10 μg/L表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)的L-DMEM培養(yǎng)基中，按5×105/cm2接種于培養(yǎng)瓶，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)面積達(dá)80%以上即進(jìn)行傳代培養(yǎng)，至第3代用于細(xì)胞治療，并采用流式細(xì)胞儀(BD)檢測(cè)其表型。熒光標(biāo)記抗體為CD29-PE、CD44-FITC、CD73-PE、E-Cad-PE、CD326-FITC、CD49f-FITC、CD34-PE、CD45-FITC、CD80-FITC、CD86-PE和HLA-DR-FITC，同型對(duì)照為相應(yīng)熒光素標(biāo)記的小鼠IgG，每份樣品采集細(xì)胞數(shù) ≥20 000個(gè)，采用Cell Quest軟件分析。為了排除羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的污染，制備hAECs爬片，采用免疫組化染色檢測(cè)上皮標(biāo)志CK19。

3.2AD模型制備與分組參照文獻(xiàn)[6]造模。動(dòng)物麻醉后固定于腦立體定位儀上，保持前后囟水平。術(shù)區(qū)常規(guī)消毒，暴露前囟，根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜[7]，側(cè)腦室注射點(diǎn)的座標(biāo)定位為前囟后1 mm，距離矢狀縫1.5 mm，顱骨下3.5 mm。雙側(cè)腦室注入脂多糖溶液(終濃度為10 g/L)，每側(cè)5 μL。術(shù)后1周進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試，與正常組大鼠逃避潛伏期和跨越平臺(tái)次數(shù)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性判為AD造模成功。隨機(jī)數(shù)字表法將AD大鼠隨機(jī)分為模型(model)組、培養(yǎng)基(medium)組和hAECs移植組(hAECs)，設(shè)假手術(shù)(sham)組作為平行對(duì)照，每組12只。Sham組以10 μL生理鹽水代替脂多糖, 其余操作同模型組。

3.3hAECs移植取第3代hAECs，用L-DMEM培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液。造模后2周，hAECs移植組大鼠用7%水合氯醛腹腔注射麻醉，根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜確定海馬區(qū)注射位點(diǎn)，座標(biāo)定位為前囟后3 mm、距離矢狀縫2.2 mm、顱骨下3.5 mm，每只注射10 μL hAECs懸液(含5×105個(gè)細(xì)胞)。Medium組以相同的部位注射等體積L-DMEM培養(yǎng)基。Model和sham組不作處理。

3.4行為學(xué)檢查hAECs移植前、后進(jìn)行Morris水迷宮定位航行和空間探索實(shí)驗(yàn)[8]，以評(píng)價(jià)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。定位航行實(shí)驗(yàn)每天上、下午各1次，持續(xù)5 d。將大鼠面向池壁分別從4個(gè)象限放入水中，攝像記錄其找到平臺(tái)所需時(shí)間即逃避潛伏期。如果 120 s內(nèi)未能找到平臺(tái)，則引導(dǎo)至平臺(tái)上，停留30 s，其逃避潛伏期記錄為120 s。取4個(gè)象限平均值為該次實(shí)驗(yàn)的成績(jī)。定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，撤除平臺(tái)后任選一個(gè)入水點(diǎn)將鼠放入水中，攝像記錄其在2 min內(nèi)跨越原平臺(tái)所在位置的次數(shù)。

3.5病理學(xué)檢查hAECs移植后2周，各組大鼠在麻醉下，經(jīng)腹主動(dòng)脈抽取外周血，主動(dòng)脈弓灌注4%多聚甲醛，取腦組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，進(jìn)行以下檢測(cè)：(1)常規(guī)HE染色觀(guān)察海馬神經(jīng)元形態(tài)變化；(2)硫磺素S染色觀(guān)察海馬區(qū)Aβ沉積；(3)免疫組化染色檢測(cè)Aβ42、Tau蛋白及ACh：石蠟切片常規(guī)脫蠟致水，檸檬酸鈉緩沖液抗原修復(fù)，3% H2O210～15 min，山羊血清封閉液20 min，滴加 I 抗(兔抗大鼠Aβ42抗體、兔磷酸化Tau蛋白抗體和小鼠抗大鼠ACh抗體，均1∶100稀釋), 4 ℃過(guò)夜，滴加免疫組化試劑盒A液室溫孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，顯微鏡觀(guān)察。每張切片海馬區(qū)隨機(jī)取3個(gè)視野, 用Image-Pro Plus 6.0軟件分析陽(yáng)性產(chǎn)物積分吸光度(IA)，以12張切片的平均IA值表示檢測(cè)物的相對(duì)表達(dá)量。

3.6免疫熒光染色腦冰凍切片山羊血清封閉，滴加 I 抗MAB1281 (1∶100)，4 ℃孵育過(guò)夜，滴加 II 抗羊抗小鼠IgG-FITC，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌，滴加NeuN-PE抗體，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌，DAPI復(fù)染，熒光顯微鏡觀(guān)察。

3.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞亞群外周血加入等體積PBS稀釋?zhuān)昧馨图?xì)胞分離液提取單個(gè)核細(xì)胞。加人0.02 mg/L的佛波酯、1 mg/L的離子霉素和10 mg/L的布雷菲德菌素A，37 ℃培養(yǎng)箱孵育4 h。收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至l×109/L。取細(xì)胞懸液200 μL，加入5 μL Ab CD4-APC，室溫避光孵育30 min，4%多聚甲醛固定20 min，加破膜緩沖液作用10 min。按組合方案加入相應(yīng)的小鼠抗大鼠Ab IFN-γ-FITC、IL-4-PE、IL-17-FITC和FoxP3-PE，用相應(yīng)熒光素標(biāo)記的小鼠IgG作為同型對(duì)照。室溫避光孵育30 min，PBS充分洗滌，1%多聚甲醛固定，4 ℃避光放置。所有樣本24 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)，每份樣品采集的細(xì)胞數(shù) ≥20 000個(gè)，采用Cell Quest軟件分析CD4+IFN-γ+(Th1)、CD4+IL-4+(Th2)、CD4+Foxp3+(Treg)和CD4+IL-17+(Th17)亞群百分率。

3.8流式微球陣列檢測(cè)細(xì)胞因子先用BD Calibrite Beads試劑通過(guò)BD FACSComp軟件設(shè)置FCM的基本參數(shù)(設(shè)門(mén)、電壓、補(bǔ)償)，隨后用試劑盒中的細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品按梯度法稀釋成1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128和1∶256，加上最高濃度和陰性對(duì)照制定細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。待測(cè)樣品1 500 r/min離心5 min，吸取50 μL上清液于待測(cè)管中，加入50 μL 5種捕獲微球混合物，孵育1 h，加入50 μL PE檢測(cè)試劑，室溫避光孵育2 h。加入1 μL洗液，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入300 μL洗液上機(jī)檢測(cè)。采用 BD CBA分析軟件，自動(dòng)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，測(cè)出待測(cè)樣品中細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和TNF-α的含量。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。各組間比較采用單因素方差分析；組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1hAECs形態(tài)及表型特征

原代hAECs形態(tài)呈三角形、圓形，第3代hAECs貼壁生長(zhǎng)，多為卵圓形，呈鋪路石樣生長(zhǎng)，表達(dá)上皮標(biāo)志CK19，見(jiàn)圖1。第3代hAECs不表達(dá)CD34、CD45、CD80、CD86和HLA-DR，表達(dá)CD29、CD44、CD73、CD49f、E-Cad和CD326，見(jiàn)圖2。

Figure 1.The morphology of cultured hAECs and positive expression of CK19 (×100). A: primary hAECs； B: positive expression of CK19.

圖1hAECs形態(tài)及CK19免疫組化染色

Figure 2.The phenotypic analysis of hAECs by flow cytometry analysis.

圖2hAECs流式細(xì)胞術(shù)表型分析

2行為學(xué)檢查結(jié)果

與模型組和培養(yǎng)基組比較，hAECs移植后2周，逃避潛伏期明顯縮短(P<0.01)，跨越平臺(tái)次數(shù)明顯增加(P<0.05)；而與假手術(shù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖3、4。

3腦組織病理變化

模型組和培養(yǎng)基組大鼠海馬齒狀回顆粒層神經(jīng)元層數(shù)和數(shù)量減少，細(xì)胞間隙變大，排列紊亂，部分細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞核固縮，并有變性、壞死；海馬區(qū)大量Aβ沉積，Aβ42和磷酸化Tau蛋白均明顯上調(diào)，其平均IA值顯著高于假手術(shù)組(P<0.01)，而ACh呈弱陽(yáng)性，其平均IA值明顯低于假手術(shù)組(P<0.05)。hAECs移植后2周，AD樣病變大鼠海馬神經(jīng)元的損傷明顯減輕, 細(xì)胞形態(tài)和排列大致正常；Aβ沉積明顯減少， Aβ42和磷酸化Tau蛋白均明顯下調(diào)，其平均IA值均明顯低于模型組和培養(yǎng)基組(P<0.05)；而ACh水平增加，其IA值高于模型組和培養(yǎng)基組，見(jiàn)圖5、表1。

4hAECs在海馬區(qū)分布及分化

hAECs移植后第2周，海馬區(qū)可見(jiàn)人細(xì)胞核特異性抗原陽(yáng)性細(xì)胞，其中多數(shù)細(xì)胞表達(dá)NeuN(MAB1281+/NeuN+細(xì)胞)，見(jiàn)圖6。

Figure 3.The changes of escaping latency from AD-like pathology rats 2 weeks after hAECs transplantation. Mean±SD.n=12.#P<0.05,##P<0.01vssham group;**P<0.01vsmodel group and medium group.

圖3hAECs移植后2周AD樣病變大鼠逃避潛伏期的變化

Figure 4.The changes of the frequency of going though platform from the AD-like pathology rats 2 weeks after hAECs transplantation. Mean±SD.n=12.#P<0.05vssham group；*P<0.05vsmodel group and medium group.

圖4hAECs移植后2周AD樣病變大鼠跨越平臺(tái)次數(shù)的變化

5外周血T淋巴細(xì)胞亞群變化

與假手術(shù)組比較，模型組和培養(yǎng)基組外周血Th1和Th17細(xì)胞亞群明顯升高(P<0.05)，Th2和Treg細(xì)胞無(wú)明顯改變；與模型組和培養(yǎng)基組比較，hAECs細(xì)胞治療后2周AD大鼠Th1和Th17細(xì)胞明顯降低(P<0.05)，Th2和Treg細(xì)胞明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)表2。

Figure 5.The pathological changes of brain tissues from the AD-like pathology rats 2 weeks after hAECs transplantation (×200).

圖5hAECs 移植后2周AD樣病變大鼠腦組織病理變化

表1各實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬區(qū)Aβ42、Tau 及ACh的變化

Table 1.The changes of Aβ42, ACh and Tau in the hippocampus in different groups (Mean±SD.n=12)

GroupAβ42TauAChSham40.36±15.9241.91±34.91268.22±57.38Model178.52±25.44##154.59±36.24##80.24±25.92##Medium161.86±62.88##141.74±33.88##78.02±40.46##hAECs26.88±14.10**50.92±25.11**236.41±76.70**

##P< 0.01vssham group；**P<0.01vsmodel group and medium group.

6血清細(xì)胞因子的變化

模型組和培養(yǎng)基組血清Th1型細(xì)胞因子IFN-γ和IL-2含量較之假手術(shù)組明顯升高(P<0.05)；與模型和培養(yǎng)基組比較，hAECs移植后2周大鼠IFN-γ和IL-2水平明顯下降(P<0.05)，而Th2型細(xì)胞因子IL-4明顯升高(P<0.05)，TNF-α和IL-10則無(wú)明顯變化，見(jiàn)表3。

討論

細(xì)胞類(lèi)型的鑒定是細(xì)胞治療過(guò)程中重要的質(zhì)控環(huán)節(jié)。目前尚無(wú)公認(rèn)的hAECs表型鑒定譜系標(biāo)志。

Figure 6.The expression of NeuN in the hAECs in hippocampus (immunofluorescence staining, ×200). A: bright field; B: human nuclear antigen positive; C: NeuN positive; D: DAPI staining; E: Merged.

圖6海馬區(qū)植活的hAECs表達(dá)NeuN

表2　各實(shí)驗(yàn)組外周血T淋巴細(xì)胞亞群百分率

#P<0.05vssham group;△P<0.05vsmodel group;▲P<0.05vsmedium group.

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，用于移植的第3代hAECs不表達(dá)CD34、CD45、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)和HLA-DR, 高表達(dá)CD29、CD44、CD73、CD49f、CD326(Ep-CAM)、E-Cad和CK19，說(shuō)明用于移植的第3代hAECs仍保持了良好的上皮細(xì)胞表型特征。值得指出的是hAECs不表達(dá)HLA-DR以及共刺激分子B7-

表3　各實(shí)驗(yàn)組血清細(xì)胞因子含量的比較

#P<0.05vssham group;△P<0.05vsmodel group;▲P<0.05vsmedium group.

1 和B7-2，說(shuō)明hAECs具有不被異種或同種異基因免疫細(xì)胞識(shí)別的免疫豁免特性。

目前常用的AD樣病變?cè)炷７绞接形锢頁(yè)p傷、化學(xué)損傷及轉(zhuǎn)基因老年動(dòng)物等方法，但都很難精確反映人類(lèi)AD發(fā)病機(jī)制和病理過(guò)程，迄今為止尚無(wú)一個(gè)公認(rèn)的最佳AD樣病變?cè)炷７椒?。本?shí)驗(yàn)采用LPS直接注入雙側(cè)腦室建立大鼠AD樣病變模型，主要病理變化表現(xiàn)為大腦海馬區(qū)神經(jīng)元明顯減少，大量Aβ沉積，磷酸化Tau蛋白呈陽(yáng)性反應(yīng)，伴有空間識(shí)別性學(xué)習(xí)、記憶障礙，表明用LPS建立的AD樣病變模型能較好地模擬AD的病理特征和臨床表現(xiàn)。水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AD樣病變大鼠hAECs海馬區(qū)移植后2周，逃避潛伏期縮短，測(cè)試第3天至第5天達(dá)與假手術(shù)組明顯差別，跨域平臺(tái)象限的次數(shù)也接近假手術(shù)組，說(shuō)明AD樣病變大鼠空間識(shí)別性學(xué)習(xí)和記憶能力得以明顯改善。病理檢查發(fā)現(xiàn)，hAECs治療組大鼠海馬齒狀回顆粒層神經(jīng)元增多，Aβ沉積減少，Tau蛋白異常磷酸化減輕，ACh水平明顯升高。這些證據(jù)表明，hAECs移植均可明顯改善AD樣病變大鼠認(rèn)知功能和減輕腦組織特征性的病理改變。

Aβ在細(xì)胞外異常沉積和異常磷酸化Tau蛋白形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFT)是AD最主要的病理學(xué)特征。 普遍認(rèn)為，Aβ聚集是AD的起始因子，Aβ沉積可對(duì)興奮性突觸和抑制性中間神經(jīng)元的ACh釋放產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用，導(dǎo)致廣泛的突觸功能異常，同時(shí)選擇性攻擊GABA能抑制性神經(jīng)元，使皮質(zhì)和海馬內(nèi)興奮性神經(jīng)元抑制減弱而過(guò)度興奮，從而引起神經(jīng)環(huán)路或網(wǎng)絡(luò)功能異常，導(dǎo)致認(rèn)知能力障礙[9-11]。Aβ以多種形式存在于生物體內(nèi)，其中Aβ40和Aβ42是最主要的亞型，后者較前者多2個(gè)疏水氨基酸，更容易在腦內(nèi)聚集，具有更強(qiáng)的毒性和成纖維性[12-13]。Tau蛋白主要分布于神經(jīng)元軸突，與微管結(jié)合有助于軸突的正常生理功能。大量Aβ可引發(fā)Tau蛋白過(guò)度磷酸化，過(guò)度磷酸化的Tau蛋白聚集在神經(jīng)元樹(shù)突棘，一方面可進(jìn)一步增強(qiáng)Aβ誘導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒性作用[14]；另一方面，可導(dǎo)致腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的軸突運(yùn)輸異常，使突觸容易疲勞而影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放[15]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，hAECs移植后，AD樣病變大鼠腦組織中Aβ42表達(dá)和磷酸化Tau蛋白水平均明顯下降。提示由hAECs介導(dǎo)的Aβ42和Tau蛋白下調(diào)可能在改善AD樣病變模型大鼠認(rèn)知功能方面起重要作用。

炎癥和免疫反應(yīng)是AD發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)，免疫活性細(xì)胞和免疫因子在A(yíng)D炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[16]。Aβ C端的T細(xì)胞表位(Aβ17-21和Aβ29-42 C端)是引起細(xì)胞毒作用的核心肽段，可誘導(dǎo)Th1細(xì)胞，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。迄今尚未見(jiàn)有關(guān)AD模型動(dòng)物免疫病理變化的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)LPS誘導(dǎo)的AD模型具有明顯的免疫病理特征，表現(xiàn)為T(mén)h1和Th17細(xì)胞反應(yīng)過(guò)亢，促炎性Th1型細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ水平升高。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，hAECs移植后AD大鼠外周血Th1和Th17細(xì)胞百分率明顯下降，Th2和FoxP3+Treg細(xì)胞明顯升高，Th1類(lèi)細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ水平下調(diào)，Th2類(lèi)細(xì)胞因子IL-4上調(diào)。Th17是一類(lèi)重要的介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的細(xì)胞，通過(guò)分泌IL-17參與各種炎癥反應(yīng)過(guò)程。FoxP3+Treg不僅可抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞增殖，而且在調(diào)節(jié)機(jī)體外源性抗原免疫反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，hAECs可通過(guò)抑制Th1和Th17，上調(diào)Th2和FoxP3+Treg，從而抑制AD的炎癥/免疫反應(yīng)。據(jù)此推測(cè)，由hAECs介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)作用可能在減輕AD神經(jīng)組織免疫損傷中發(fā)揮重要作用。

hAECs治療AD的機(jī)制還不完全清楚。相對(duì)于其它成體干細(xì)胞如MSCs，hAECs具有某些獨(dú)特的生物學(xué)特性，針對(duì)神經(jīng)性疾病治療最值得關(guān)注的價(jià)值成分是其神經(jīng)生物學(xué)特性和抗炎作用。hAECs能合成、釋放腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3、神經(jīng)生長(zhǎng)因子及其它一些未知的神經(jīng)生長(zhǎng)因子，發(fā)揮激活神經(jīng)細(xì)胞再生作用[17]。hAECs還能合成、分泌兒茶酚胺和ACh[3-4]，有助于改善AD、帕金森病、亨廷頓病等神經(jīng)退行性疾病所引起的認(rèn)知功能下降。在抗炎方面，hAECs可通過(guò)FasL、TRAIL、MIF等免疫抑制因子抑制免疫細(xì)胞的趨化活性，抑制T細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞由M1型(致炎型)向M2型(抗炎型)轉(zhuǎn)化，從而發(fā)揮抗炎作用[18-19]。我們?cè)缦妊芯孔C明，hAECs可通過(guò)上調(diào)FoxP3+Treg和下調(diào)Th17改善自身免疫性腦脊髓炎大鼠神經(jīng)組織的免疫損傷[20]。這些研究結(jié)果提示， hAECs對(duì)AD樣病變模型大鼠療效的生物學(xué)原理可能涉及其旁分泌機(jī)制介導(dǎo)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)、抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。

hAECs由胚胎上胚層(epiblast)衍化而來(lái)，其功能與胚胎發(fā)育尤其是神經(jīng)分化、母-胎免疫耐受及胎兒發(fā)育穩(wěn)態(tài)環(huán)境有關(guān)，而且仍保留了胚胎干細(xì)胞的某些特性，向神經(jīng)元分化無(wú)跨胚層障礙。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，移植到AD樣病變大鼠海馬中的hAECs表達(dá)NeuN，這是移植后微環(huán)境誘導(dǎo)分化的結(jié)果，還是其本身就表達(dá)NeuN，還不清楚。因此，尚不能確定移植的hAECs已分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。另一方面，即使hAECs移植后能分化為神經(jīng)元，它能否與宿主建存神經(jīng)元整合，并重建新的神經(jīng)環(huán)路，值得深入研究。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)