熒光碳點(diǎn)納米材料對(duì)大腸桿菌的毒性研究

熒光碳點(diǎn)納米材料對(duì)大腸桿菌的毒性研究

劉文娟,靳競(jìng)男,馬家恒,姚俊

(北京科技大學(xué)土木與環(huán)境工程學(xué)院,北京100083)

摘要：以革蘭氏陰性菌大腸桿菌為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，采用微量熱法研究了碳點(diǎn)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的生物效應(yīng)。低濃度的碳點(diǎn)(0.00～5.00 mg·L-1)使得細(xì)菌的最大熱功率(Ppeak)和總熱量(Qtotal)增大。碳點(diǎn)對(duì)大腸桿菌的半抑制濃度(IC50)為18.53 mg·L-1。碳點(diǎn)對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的影響與其濃度有關(guān)。

關(guān)鍵詞：碳點(diǎn)；大腸桿菌；微量熱法；毒性效應(yīng)

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金杰出青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目(41273092)

收稿日期：2015-05-16

作者簡(jiǎn)介：劉文娟(1986-)，女，山西忻州人，博士研究生，研究方向：納米毒理研究，E-mail:liuwenjuan19860521@aliyun.com；通訊作者：姚俊，教授,E-mail:yaojun@163.com。

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2015.09.007

中圖分類號(hào)：R 378.21文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

納米材料作為一種具有市場(chǎng)應(yīng)用潛力的材料，在醫(yī)藥、化工、電子和航空等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[1-3]。納米材料在開發(fā)和應(yīng)用過程中將不可避免地進(jìn)入環(huán)境，對(duì)環(huán)境和人類健康產(chǎn)生潛在的重大危害[4]。因此，納米材料對(duì)環(huán)境和人類的副作用需要進(jìn)行深入的研究。碳點(diǎn)是一種零維的碳納米材料，具有很多半導(dǎo)體量子點(diǎn)的優(yōu)點(diǎn)，如很好的光穩(wěn)定性、多色、雙光子吸收截面大等[5-6]。此外，碳點(diǎn)還有許多半導(dǎo)體量子點(diǎn)所沒有的優(yōu)點(diǎn)，如優(yōu)越的水溶性、無光閃爍性、制造成本低等。碳點(diǎn)不含重金屬，既不污染環(huán)境又具有優(yōu)良的生物相容性。由于碳點(diǎn)優(yōu)良的物理和化學(xué)性質(zhì)，它在生物學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)引起很多研究者的關(guān)注。碳點(diǎn)的表面能被各種化學(xué)基團(tuán)修飾，使得它在一些新的應(yīng)用領(lǐng)域有很大的發(fā)展?jié)摿7-8]。

到目前為止，碳納米材料(如單壁碳納米管[9]、富勒烯[10]及功能性碳納米材料[11])對(duì)微生物或微生物群落的影響已有報(bào)道。但是，碳點(diǎn)納米材料對(duì)微生物的影響未見報(bào)道。Tao等[12]研究了不同飼養(yǎng)時(shí)期碳點(diǎn)在小鼠體內(nèi)的分布和毒理學(xué)，但所得的結(jié)論不一定適用于其它生物。因此，碳點(diǎn)對(duì)單細(xì)胞生物(細(xì)菌和真菌)的毒性研究十分必要。微生物在整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著很重要的作用，其中細(xì)菌所占的比例高達(dá)90%。大腸桿菌Escherichiacoli(E.coli)由于細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能組織與絕大多數(shù)的微生物都很類似，在環(huán)境中廣泛存在，且對(duì)環(huán)境變化非常敏感，是一種廣泛使用的研究分子和細(xì)胞生物學(xué)的模式生物。此外，大腸桿菌還被廣泛應(yīng)用于研究外源性物質(zhì)(如重金屬、除草劑及納米材料等)的毒性[13-15]。

作者采用微量熱法研究了碳點(diǎn)對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的影響。從大腸桿菌的微量熱曲線計(jì)算得出大腸桿菌的生長(zhǎng)速率常數(shù)(k)、最大熱功率(Ppeak)和碳點(diǎn)對(duì)大腸桿菌的半抑制濃度(IC50)。

1實(shí)驗(yàn)

1.1　試劑與儀器

多壁碳納米管(MWCNTs，內(nèi)徑20 nm,外徑40 nm)，深圳納米港有限公司。硝酸(含量65%)，硫酸(含量98%)及其它試劑，天津試劑公司。所有試劑均為分析純，不需要任何前處理。實(shí)驗(yàn)中的溶液用二次蒸餾水配制。

LB培養(yǎng)基：氯化鈉10 g·L-1,蛋白胨10 g·L-1,酵母膏5 g·L-1，120 ℃高壓釜中滅菌30 min，常溫下儲(chǔ)存，備用。

TAMⅢ型多通道微量量熱儀(瑞典)；日立F-4500型熒光光譜儀(日本)；島津UV-1800型紫外可見分光光度計(jì)(日本)。

1.2　碳點(diǎn)納米材料的制備

根據(jù)文獻(xiàn)[12]方法制備碳點(diǎn)納米材料。

將100 mg多壁碳納米管置于三口燒瓶中，加入含有5 mL 65%的硝酸和15 mL 98%的硫酸的混酸。采用超聲清洗機(jī)振蕩混合物30 min。將混合物在80 ℃下冷凝回流24 h。冷卻后將混合物移入100 mL去離子水中稀釋。將稀釋后的混合物經(jīng)0．1 μm濾膜抽濾，并將濾液裝入14 000 Da的透析袋中,用去離子水透析以除去殘留的混酸,最終得到棕黃色透明液體。該液體在365 nm紫外燈照射下可發(fā)出明亮的黃色熒光。

1.3　微量熱測(cè)定

采用多通道微量量熱儀測(cè)定大腸桿菌的代謝產(chǎn)熱。大腸桿菌的代謝反應(yīng)在4.0 mL 不銹鋼的安瓿瓶中進(jìn)行。安瓿瓶使用前在電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中110 ℃下滅菌30 min。

大腸桿菌的微量熱曲線的測(cè)量采用安瓿瓶法。 將2 mL 的LB培養(yǎng)基放入安瓿瓶?jī)?nèi)，然后分別加入不同濃度的無菌碳點(diǎn)，使得培養(yǎng)基中碳點(diǎn)的終濃度(mg·L-1)分別為5.00、10.0、20.0、50.0、100、200,每個(gè)安瓿瓶中都加入100 μL的大腸桿菌(OD600=0.5)。輕微渦旋，將碳點(diǎn)和大腸桿菌混合均勻。大腸桿菌的代謝反應(yīng)在28 ℃進(jìn)行，大腸桿菌的熱功率-時(shí)間曲線被記錄到與量熱儀連接的計(jì)算機(jī)上。

2結(jié)果與討論

2.1　碳點(diǎn)的光譜測(cè)定

碳點(diǎn)的紫外吸收光譜和熒光發(fā)射光譜如圖1所示。

圖1　碳點(diǎn)的紫外吸收光譜(a)和熒光發(fā)射光譜(b) Fig.1　UV Absorption spectrum(a) and photoluminescence spectrum(b) of Cdots

由圖1a可知，碳點(diǎn)的紫外吸收光譜與文獻(xiàn)[16]報(bào)道一致。在紫外區(qū)域，碳點(diǎn)有很強(qiáng)的吸收峰。掃描波長(zhǎng)越短，吸收強(qiáng)度越大，為典型的碳點(diǎn)的吸收光譜。由圖1b可知，碳點(diǎn)的熒光光譜在496 nm 處有一個(gè)明顯對(duì)稱的發(fā)射峰。

2.2　大腸桿菌的微量熱曲線

微量熱法是一種有效且準(zhǔn)確的研究微生物能量代謝的方法[16]。這種方法被證實(shí)可以原位長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)監(jiān)測(cè)微生物生長(zhǎng)代謝，并且不干擾微生物的生長(zhǎng)過程。28 ℃時(shí)大腸桿菌的微量熱曲線和OD600-時(shí)間曲線如圖2所示。

圖2　大腸桿菌的微量熱曲線和 OD 600-時(shí)間曲線 Fig.2　Microcalorimetric curve and OD 600-time curve for E. coli

由圖2可知，大腸桿菌的微量熱曲線顯示出特有的生長(zhǎng)期:適應(yīng)期(1)、指數(shù)期(2)、穩(wěn)定期(3)、衰退期(4)。微量熱曲線的峰值和OD600-時(shí)間曲線的峰值幾乎同時(shí)發(fā)生。微量熱曲線的每一個(gè)階段都和細(xì)胞密度相吻合。

含有不同濃度碳點(diǎn)的大腸桿菌的微量熱曲線如圖3所示。

圖3　含有不同濃度碳點(diǎn)的大腸桿菌的微量熱曲線 Fig.3　Microcalorimetric curves of E. coli in the presence of Cdots at different concentrations

由圖3可知，含有不同濃度碳點(diǎn)的大腸桿菌的微量熱曲線形狀相似，能夠明顯看出大腸桿菌的4個(gè)生長(zhǎng)期。但是隨著碳點(diǎn)濃度的增大，大腸桿菌的微量熱曲線的峰值逐漸降低，說明它的整個(gè)代謝過程變緩且有延遲。

生長(zhǎng)速率常數(shù)k是微生物活動(dòng)的一個(gè)重要的定量指標(biāo)，是指示微生物的化學(xué)應(yīng)力和微生物呼吸的參數(shù)[17]。通過對(duì)微量熱曲線中對(duì)數(shù)期部分的lnPt和t的數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合計(jì)算得到：

lnPt= lnP0+kt

式中：t是對(duì)數(shù)期的某一時(shí)刻；P0是微生物所有細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)期時(shí)的初始總放熱功率；Pt是t時(shí)刻的總放熱功率。

在大腸桿菌懸浮液中加入不同濃度碳點(diǎn)，大腸桿菌的代謝會(huì)受到影響，生長(zhǎng)速率常數(shù)k發(fā)生變化。通過分析微量熱曲線，得到與微生物活性相關(guān)的熱力學(xué)參數(shù)，見表1。

表1含有不同濃度碳點(diǎn)的大腸桿菌的熱力學(xué)參數(shù)

Tab.1Thermodynamic parameters ofE.coliin the presence of Cdots at different concentrations

c/(mg·L-1)k/h-1R2Ppeak/μWtpeak/hQtotal/JI/%IC50/(mg·L-1)02.900.987215.5611.496.19052.490.998232.0613.357.66914.13102.280.996198.7413.767.68321.38201.260.990168.9013.536.18756.5518.53500.310.994136.2115.135.93189.311000.220.99891.0816.755.44092.412000.160.98654.4416.944.55594.48

注：Ppeak為最大熱功率；tpeak為最大熱功率對(duì)應(yīng)的時(shí)刻；Qtotal為總熱量；I為抑制率。

2.3　生長(zhǎng)速率常數(shù) k與碳點(diǎn)濃度的關(guān)系

大腸桿菌的生長(zhǎng)速率常數(shù)k和碳點(diǎn)濃度的關(guān)系如圖4所示。

圖4　生長(zhǎng)速率常數(shù) k與碳點(diǎn)濃度的關(guān)系 Fig.4　The relationship between growth rate constant k and concentration of Cdots

由圖4可知，在低碳點(diǎn)濃度(0.00～5.00 mg·L-1)下，大腸桿菌沒有明顯的損害，生長(zhǎng)速率常數(shù)也沒有發(fā)生大的改變。這可能是大腸桿菌適應(yīng)性的反應(yīng)。大多數(shù)情況下，這種現(xiàn)象被稱為應(yīng)激反應(yīng)，而不是真正的促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)。為了減少背景損傷，大腸桿菌可以通過增強(qiáng)它的生物膜進(jìn)行修復(fù)和補(bǔ)償[18]。但是隨著碳點(diǎn)濃度的增大，大腸桿菌的生長(zhǎng)速率常數(shù)明顯下降。說明大腸桿菌的代謝活動(dòng)被抑制或是部分大腸桿菌被殺死，存活的大腸桿菌保持較低的生長(zhǎng)代謝。這歸因于大腸桿菌的薄膜應(yīng)力及它與碳點(diǎn)之間的氧化壓力。隨著碳點(diǎn)濃度的增大，與大腸桿菌最大熱功率相對(duì)應(yīng)的時(shí)刻tpeak也增大，這也證實(shí)了大腸桿菌代謝的延遲。大腸桿菌與碳點(diǎn)濃度的關(guān)系可以通過等式k=2.907e-0.042c+0.1146(R2=0.98)反映出來。

2.4　微量熱參數(shù) P peak、 Q total與碳點(diǎn)濃度的關(guān)系

大腸桿菌生長(zhǎng)代謝的最大熱功率(Ppeak) 和總熱量(Qtotal)能夠代表大腸桿菌在特定條件下的生長(zhǎng)能力。Qtotal通過對(duì)微量熱曲線從開始到結(jié)束進(jìn)行積分計(jì)算得到。在本研究中，大腸桿菌本身的代謝Qtotal為6.190 J，這是它在安瓿瓶?jī)?nèi)代謝葡萄糖產(chǎn)生的熱量[19]。Ppeak是大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的峰值。Ppeak和代謝生長(zhǎng)的Qtotal與碳點(diǎn)濃度的關(guān)系如圖5所示。

由圖5可知，低碳點(diǎn)濃度(0.00～5.00 mg·L-1)下，Ppeak和Qtotal的值隨著碳點(diǎn)濃度的增大而增大。說明低濃度的碳點(diǎn)對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。高濃度的碳點(diǎn)與Ppeak和Qtotal成負(fù)相關(guān)，說明碳點(diǎn)對(duì)大腸桿菌產(chǎn)生了毒性效應(yīng)。這與其它熒光納米材料對(duì)微生物生長(zhǎng)代謝的影響類似，即低濃度的熒光納米材料對(duì)微生物生長(zhǎng)有刺激效應(yīng)，高濃度的熒光納米材料對(duì)微生物生長(zhǎng)有抑制效應(yīng)。

2.5　微量熱參數(shù) I和 IC 50

抑制率I可以顯示加入外源物質(zhì)后對(duì)微生物活性的影響，可以通過下式計(jì)算：

式中:k0為微生物本身的生長(zhǎng)速率常數(shù);kc為外源物質(zhì)濃度為c時(shí)的生長(zhǎng)速率常數(shù)。I值越大，說明這種物質(zhì)對(duì)微生物的抑制程度越大。微量熱參數(shù)I與碳點(diǎn)濃度的關(guān)系(I-c)如圖6所示。

圖5　微量熱參數(shù) P peak 和 Q total與碳點(diǎn)濃度的關(guān)系 Fig.5　The relationships between microcalorimetric parameters P peak (a), Q total(b) and concentration of Cdots

圖6　微量熱參數(shù) I與碳點(diǎn)濃度的關(guān)系 Fig.6　The relationship between the microcalorimetric parameter I and concentration of Cdots

I-c可以直接顯示微生物的活性與碳點(diǎn)濃度的關(guān)系。當(dāng)抑制率為50%時(shí)的濃度定義為半抑制濃度(IC50)。IC50可以定量地表示一個(gè)物質(zhì)對(duì)微生物代謝的抑制能力。IC50的值越小，說明外源物質(zhì)的毒性越強(qiáng)。抑制率I和碳點(diǎn)濃度c的關(guān)系為I=-100.26e-0.042c+96.045,R2=0.98。從該式計(jì)算出IC50為18.53 mg·L-1。與量子點(diǎn)CdTe 對(duì)大腸桿菌的毒性相比，碳點(diǎn)對(duì)大腸桿菌的毒性較小。這可能是因?yàn)樘键c(diǎn)不含重金屬，而且具有良好的生物相容性。

3結(jié)論

采用微量熱法研究了碳點(diǎn)對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)代謝的影響。從微量熱參數(shù)k、Ppeak和Qtotal與碳點(diǎn)濃度的關(guān)系推斷出碳點(diǎn)在一定程度上抑制了大腸桿菌的生長(zhǎng)。碳點(diǎn)對(duì)大腸桿菌的半抑制濃度(IC50)為18.53 mg·L-1?？梢?，與其它熒光納米材料相比，碳點(diǎn)的毒性和抗菌性較小。因此，碳點(diǎn)作為低毒的熒光納米探針在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有很大應(yīng)用潛力。

參考文獻(xiàn)：

[1]AHN J H,KIM H S,LEE K J，et al.Heterogeneous three-dimensional electronics by use of printed semiconductor nanomaterials [J].Science,2006,314(5806):1754-1757.

[2]HARDMAN R.A toxicological review of quantum dots:Toxicity depends on physicochemical and environmental factors[J].Environmental Health Perspective,2006,114(2):165-172.

[3]VALIEV R.Materials science:Nanomaterial advantage[J].Nature,2002,419(6910):887-889.

[4]MASRAHI A,VANDEVOORT A R,ARAI Y.Effects of silver nanoparticle on soil-nitrification processes[J].Archives Environmental Contamination and Toxicology,2014,66(4):504-513.

[5]HU S L,NIU K Y,SUN J，et al.One-step synthesis of fluorescent carbon nanoparticles by laser irradiation[J].Journal of Material Chemistry,2009,19(4):484-488.

[6]LIU H,YE T,MAO C.Fluorescent carbon nanoparticles derived from candle soot[J].Angewandte Chemie International Edition,2007,46(34):6593-6595.

[7]PENG H,TRAVAS S J.Simple aqueous solution route to luminescent carbogenic dots from carbohydrates[J].Chemistry of Material,2009,21(23):5563-5565.

[8]ZHU H,WANG X,LI Y,et al.Microwave synthesis of fluorescent carbon nanoparticles with electrochemistry luminescence properties[J].Chemistry Communication,2009，(34):5118-5120.

[9]KANG S,HERZBERG M,RODRIGUES D F,et al.Antibacterial effects of carbon nanotubes:Size does matter![J].Langmuir,2008,24(13)：6409-6413.

[10]TONG Z,BISCHOFF M,NIES L,et al.Impact of fullerene (C60) on a soil microbial community[J].Environmental Science and Technology,2007,41(8):2985-2991.

[11]QIN L,HUANG Q,WEI Z,et al.The influence of hydroxyl functionalized multi-walled carbon nanotubes and pH levels on the toxicity of lead toDaphniamagna[J].Environmental Toxicology and Pharmacology,2014,38(1):199-204.

[12]TAO H,YANG K,MA Z,et al.InvivoNIR fluorescence imaging,biodistribution,and toxicology of photoluminescent carbon dots produced from carbon nanotubes and graphite[J].Small,2012,8(2):281-290.

[13]BALAGUE C E,DE RUIZ C S,REY R,et al.Effect of the herbicide 2,4-dichlorophenoxyacetic acid on uropathogenicEscherichiacolivirulence factors[J].Toxicology,2002,177(2):143-155.

[14]FANG T T,LI X,WANG Q S,et al.Toxicity evaluation of CdTe quantum dots with different size onEscherichiacoli[J].ToxicologyinVitro,2012,26(7):1233-1239.

[15]FENG Q L,WU J,CHEN G Q,et al.A mechanistic study of the antibacterial effect of silver ions onEscherichiacoliandStaphylococcusaureus[J].Journal of Biomedical Materials Research,2001,52(4):662-668.

[16]包翔宇,趙冰,夏馬,等.微量熱法研究磁性生物材料與大腸桿菌的相互作用[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2013,13(5):3401-3406.

[17]LI R,JIANG F,XIAO Q,et al.Microcalorimetric,spectroscopic and microscopic investigation on the toxic effects of CdTe quantum dots onHalobacteriumhalobiumR1[J].Nanotechnology,2010,21(47):94-100.

[18]CHEN H,YAO J,WANG F,et al.Study on the toxic effects of diphenol compounds on soil microbial activity by a combination of methods[J].Journal of Hazardous Materials,2009,167(1):846-851.

[19]MEI J,YANG L Y,LAI L,et al.The interactions between CdSe quantum dots and yeastSaccharomycescerevisiae:Adhesion of quantum dots to the cell surface and the protection effect of ZnS shell[J].Chemosphere,2014,112:92-99.

Toxic Effect of Photoluminescent Carbon Dots Nanomaterial onEscherichiaColi

LIU Wen-juan,JIN Jing-nan,MA Jia-heng,YAO Jun

(SchoolofCivil&EnvironmentalEngineering，UniversityofScience&

TechnologyBeijing,Beijing100083，China)

Abstract：In this study,Gram-negative bacteria Escherichia coli(E.coli) was applied as testing model to study the biological effect of carbon dots(Cdots) on the cell growth by microcalorimetry.The introducing of Cdots caused a gradual increase of maximum heat power(Ppeak) and total heat produced(Qtotal) at low concentrations(0.00～5.00 mg·L-1).Half inhibitory concentration(IC50) of Cdots was 18.53 mg·L-1.Cdots had a concentration-dependent effect on the growth of E.coli.

Keywords：carbon dots；Escherichia coli;microcalorimetry;toxic effect