當(dāng)歸紅芪超濾物對衰老大鼠腦組織氧化損傷及線粒體DNA缺失的影響

當(dāng)歸紅芪超濾物對衰老大鼠腦組織氧化損傷及線粒體DNA缺失的影響

李應(yīng)東1劉萍萍周倩倩1孫少伯1劉凱1

(甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,甘肅蘭州730000)

摘要〔〕目的探討當(dāng)歸紅芪超濾物延緩老齡大鼠腦衰老的作用及其機制。方法選用3月齡大鼠12只作為青年組，選用24月齡大鼠36只隨機分為老年組、當(dāng)歸紅芪超濾物組、維生素E組。給予相應(yīng)處理后檢測各組學(xué)習(xí)記憶功能、腦指數(shù)測定，組織形態(tài)學(xué)觀察，腦組織中超氧化物歧化酶(SOD)活力，丙二醛(MDA)含量測定及腦組織線粒體DNA(mt-DNA)缺失的表達。結(jié)果與青年組大鼠相比:老年組大鼠學(xué)習(xí)能力下降，腦組織形態(tài)學(xué)存在差異，腦指數(shù)存在差異(P<0.05)，腦組織SOD活力明顯降低，MDA 含量明顯升高，腦缺失mt-DNA/內(nèi)參mt-DNA 比例明顯增高(P<0.05)；與老年組相比:用藥組大鼠學(xué)習(xí)能力明顯增加，腦組織形態(tài)學(xué)存在差異，腦指數(shù)無明顯差異，腦組織中SOD 活力顯著增高，腦組織中MDA 含量顯著降低，腦缺失mt-DNA/內(nèi)參mt-DNA比例降低(P<0.05)。與維生素E組相比，用藥組大鼠學(xué)習(xí)能力、腦指數(shù)、腦組織SOD 活力、MDA含量、腦缺失mt-DNA/內(nèi)參mt-DNA比例均無顯著差異(P>0.05)。結(jié)論當(dāng)歸紅芪超濾物可能通過清除自由基，防止mt-DNA片段丟失發(fā)揮延緩老齡大鼠腦組織衰老的作用，其功效與維生素E相當(dāng)。

關(guān)鍵詞〔〕當(dāng)歸紅芪超濾物；衰老；抗氧化；線粒體DNA

中圖分類號〔〕R285.5〔文獻標(biāo)識碼〕A〔

基金項目：國家教育部“春暉計劃”(No．Z2004-1-62042)

1甘肅中醫(yī)學(xué)院

第一作者：李應(yīng)東(1962-)，男，博士，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要從事心腦血管疾病研究。

Effect of ultra-filtration extract mixture from Angelica sinensis and Hedysarum polybotrys on the oxidative damage of brain tissues and the expression of the mt-DNA deletion in old rats

LI Ying-Dong,LIU Ping-Ping,ZHOU Qian-Qian，etal.

Affiliated Hospital of Gansu College of Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730000,Gansu,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effect of ultra-filtration extract from Angelica sinensis and Hedysari Polybotrys(UFE-AH) on slowing brain aging of old rats.Methods12 healthy male Wistar rats of 3-months old were selected for the youth control group,and 36 natural aging male Wistar rats of 24-months old were selected and randomly divided into three groups:the old control,UFE-AH and Vitamin E(VE) groups. After above treatments,the learning and memory ability and the brain index of each group of Wistar rats were measured,brain tissue(hippocampus and cortex) was observed by microscope,the activity of dismutase(SOD),contents of maloudialdehyde(MDA) and the expression of mitochondrial DNA(mt-DNA) deletion in the brains were tested. ResultsThe learning and memory ability of old rats decreased compared with the youth rats,there were significant difference in the brain tissue and brain index between the old and the youth(P<0.05). The activity of SOD apparently decreased,contents of MDA apparently increased,and the expression of mt-DNA deletion increased in old rats(P<0.05). Rats treated with UFE-AH had high learning and memory ability compared with the normal old rats,there were significant difference in the brain tissue,and there was no difference in brain index. The activity of SOD apparently increased,contents of MDA apparently decreased,and the expression of mt-DNA deletion decreased of rats treated with UFE-AH(P<0.05). Rats treated with UFE-AH had no significant differences with the rats treated with VE in above parameters. ConclusionsThe UFE-AH could slow brain aging of old rats by eliminating free oxygen radicals and preventing from mt-DNA deletion,whose function is similar with the VE.

【Key words】ApoC Ⅲ; mRNA; Bama; Longevity; RT-PCR

自由基學(xué)說是衰老的機制之一〔1〕。衰老是過量自由基攻擊生物組織細(xì)胞、核酸和蛋白質(zhì)，體內(nèi)的抗氧化物質(zhì)，致使損傷積累戰(zhàn)勝了機體的修復(fù)能力，改變細(xì)胞分化狀態(tài),甚至喪失,從而導(dǎo)致衰老〔2〕。線粒體是細(xì)胞的能量中心，易產(chǎn)生氧自由基，自身又缺乏有效的清除系統(tǒng)，故線粒體DNA(mt-DNA)也是自由基損傷的重要目標(biāo)〔3〕，這種損傷可使線粒體DNA發(fā)生突變，且隨增齡逐漸積累，達到一定閾值后即可導(dǎo)致細(xì)胞能量危機造成機體生理功能的減退引起衰老〔4〕。線粒當(dāng)歸紅芪超濾物合劑來自于當(dāng)歸,紅芪按1∶5 配伍所組成的補氣生血之經(jīng)典名方當(dāng)歸補血湯，目前該提取物已被證實具有良好的抗自由基〔5〕，抗氧化損傷〔6〕，促進血管新生〔7〕等功效,但在抗衰老方面尚未見相關(guān)研究，本實驗以10萬分子量當(dāng)歸紅芪超濾物作用于自然衰老雄性大鼠，通過檢測學(xué)習(xí)記憶功能、腦指數(shù)，腦組織中超氧化物歧化酶(SOD)活力，丙二醛(MDA)含量及腦組織mt-DNA，以期探討其延緩腦衰老的作用及機制。

1材料與方法

1.1實驗動物選用SPF級雄性3、24月齡的Wistar大鼠，實驗動物購自甘肅中醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心，SPF級動物合格證號:SCXK(甘) 2011-0001。

1.2藥品及試劑維生素E膠丸(青島雙鯨藥業(yè))；當(dāng)歸紅芪超濾物(甘肅中西醫(yī)結(jié)合研究所和甘肅省膜科院聯(lián)合提供)；SOD試劑盒、MDA 試劑盒、考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒(均購自南京建成生物研究所)；Go Taq Green master mix(美國Sigma公司)；mt-DNA引物(南京金斯瑞生物科技有限公司)；柱式動物線粒體DNA提取試劑盒(北京天恩澤基因科技有限公司)。

1.3儀器BP211D型電子天平(瑞士Sartorius公司)；UV-2401PC型紫外可見分光光度儀(日本島津)；臺式低溫高速離心機(PLCO型，德國Heraeus公司)；MDF-382 型低溫冰箱(日本三洋公司)；美國亞培全自動酶標(biāo)分析儀；PCR擴增儀(PE2400型，美國PE公司)；Morris水迷宮實驗系統(tǒng)和BI2000圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟公司)。

1.4動物分組與給藥分組：選用SPF級雄性，3月齡的青年Wistar大鼠12只，體重(160.8±9.3)g，作為青年組(A組)；SPF級雄性，24月齡的老齡Wistar大鼠36只，體重(461.6±36.8)g，隨機分為老年組、當(dāng)歸紅芪超濾物組、維生素E組，每組12只，給藥:各組大鼠在相同條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，開始進行實驗。當(dāng)歸紅芪超濾物組給予10萬分子量的當(dāng)歸紅芪超濾物，每次19.428 g生藥·kg-1·d-1(每克生藥可提取10萬分子量當(dāng)歸紅芪超濾物0.111 g)，維生素E組給予維生素E，每次54 mg·kg-1·d-1，青年組和老年組均給予同體積生理鹽水7 ml·kg-1·d-1，每天灌胃1次，連續(xù)70 d。

1.5大鼠學(xué)習(xí)記憶功能檢測(水迷宮實驗)70 d以后開始行Morris水迷宮實驗，該實驗分為定向航行實驗和空間探索實驗。先對大鼠進行3 d訓(xùn)練，第4天開始定向航行試驗，記錄第4、5天大鼠的逃避潛伏期，并取其平均值作為大鼠學(xué)習(xí)能力的檢測指標(biāo)。第6天行空間探索實驗，記錄大鼠穿越平臺次數(shù)來作為判斷大鼠記憶能力的指標(biāo)。

1.6腦指數(shù)測定水迷宮測試結(jié)束，大鼠禁食12 h，測量記錄大鼠體重(g)；注射水合氯醛麻醉固定，冰上快速取腦，鹽水沖凈并濾干，稱取腦組織重量(g)；腦指數(shù)=腦重量/動物重量。

1.7光學(xué)顯微鏡下組織形態(tài)學(xué)觀察稱重完畢分離大鼠左側(cè)顳葉大腦皮質(zhì)和左側(cè)海馬，福爾馬林溶液固定，不同濃度乙醇逐級脫水，二甲苯溶液，石蠟中浸泡后包埋，切片，然后脫蠟，染色、脫水、透明、封固、晾干，光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)。以上操作由甘肅中醫(yī)學(xué)院病理教研室協(xié)助完成。

1.8生化法測定腦組織SOD活力、MDA含量剩余腦組織稱重，用4℃生理鹽水制備成1%，10%的組織勻漿，3 000 r/min，離心10 min，取上清液行SOD活力、MDA含量檢測。采用黃嘌呤氧化酶法測定腦組織SOD活力,硫代巴比妥酸比色法測定MDA的含量，嚴(yán)格按試劑說明書進行操作。

1.9各組大鼠腦組織mt-DNA缺失表達的測定線粒體DNA 提?。簠⒄毡本┨於鳚苫蚩萍加邢薰咎峁┑闹絼游锞€粒體DNA提取試劑盒說明操作。引物設(shè)計：內(nèi)參引物L(fēng)4395-4418(5′-AGGACTTAACCAGACCCAAACACG-3′)和H5164-5145(5′-CCTTTTTCTGATAGGCGGG-3′)，用于擴增野生型mt-DNA片段，反映正常mtDNA 含量，以此作為內(nèi)參照；缺失型引物L(fēng)7825-7944(5′-TTTCTTCCCAAACCTTTCCT-3′)和H13117-13098(5′-AAGCCTGCTAGGATGCTTC-3′)，用于擴增缺失型mt-DNA 片段，反映片段缺失型mt-DNA 含量。PCR擴增：選擇25 μl的反應(yīng)體系，組成如下：Go Tap Green master mix,2×,12.5 μl；上游引物，10 μmol/L，2 μl；下游引物，10 μmol/L，2 μl；模板DNA ，5 μl；滅菌雙蒸水，3.5 μl。PCR擴增條件：94℃，2 min；94℃，30 s；53℃30 s；74℃，60 s；74℃，5 min,25個循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳：各組取10 μl擴增產(chǎn)物和上樣緩沖液混勻后入瓊脂糖凝膠孔中，一孔加Marker作參照。電泳完成后，在凝膠圖像成像分析系統(tǒng)下獲得圖像并分析。

2結(jié)果

2.1大鼠學(xué)習(xí)記憶功能檢測結(jié)果老年組同青年組相比潛伏期延長，平臺搜索次數(shù)明顯增加(P<0.05)，說明在衰老的過程中大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能是下降的。與老年組比較，用藥組潛伏期縮短，穿越平臺次數(shù)均增加，10萬分子量組差異最顯著(P<0.05)。與維生素E組比較，用藥組潛伏期及穿越平臺次數(shù)無顯著性差異(P>0.05)，說明當(dāng)歸紅芪超濾物同維生素E在改善衰老的過程中大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能是相當(dāng)?shù)摹Ｒ姳?。

2.2腦指數(shù)測定結(jié)果與青年組大鼠腦指數(shù)相比，老年組、當(dāng)歸紅芪超濾物組及維生素E組腦指數(shù)存在差異(0.003 572±90.004 87、0.003 336±0.000 339，P<0.05)；用藥組大鼠與衰老對照組相比，腦指數(shù)之間均無差異(P>0.05)?？梢娫谒ダ线^程中會出現(xiàn)腦萎縮現(xiàn)象，當(dāng)歸紅芪超濾物和維生素E對大鼠腦萎縮的改善并不明顯。

2.3光學(xué)顯微鏡下組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果見圖1。在光學(xué)顯

組別n逃避潛伏期(s)穿越平臺次數(shù)青年組1229.50±13.9822)3)10±2.7303)老年組1285.50±11.0231)3)2.92±1.7301)3)當(dāng)歸紅芪超濾物組1243.33±23.8381)2)6.58±1.7301)維生素E組1148.60±21.2851)2)5.91±2.6631)2)

與青年組比較：1)P<0.05；與老年組比較：2)P<0.05；與維生素E組比較：3)P<0.05

圖1　各組大鼠大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)組織的形態(tài)(HE,×10)

微鏡下青年組大鼠大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞豐富，層次清晰；衰老組大鼠大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞層次不清楚，排列稀疏、雜亂，脫失明顯；當(dāng)歸紅芪超濾物組大鼠大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞層次欠清楚，與老年組相比細(xì)胞脫失減輕；維生素組大鼠大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞層次欠清楚，細(xì)胞脫失較衰老組減輕。

2.4腦組織SOD活力、MDA含量測定結(jié)果與青年對照組比較，老年組大鼠腦組織中SOD活力明顯降低，MDA 含量明顯升高(P<0.05)；與老年組相比，當(dāng)歸紅芪超濾物組大鼠腦組織中SOD 活力增高，MDA 含量降低(P<0.05)。與維生素E組比較，用藥組大鼠腦組織中SOD活力、MDA 含量無顯著差異(P>0.05)，說明用藥組與維生素E組對衰老大鼠腦組織SOD活力、MDA含量影響作用是相當(dāng)?shù)摹Ｒ姳?。

2.5當(dāng)歸紅芪超濾物對衰老大鼠腦組織mt-DNA缺失的影響與青年組比較，老年組大鼠腦組織缺失mt-DNA/內(nèi)參mt-DNA比值升高(1.029±0.040 vs 0.298±0.007,P<0.01)；與老年組比較，當(dāng)歸紅芪超濾物組大鼠腦組織缺失mt-DNA/內(nèi)參mt-DNA比值下降(0.579±0.098，P<0.01)。與維生素E組比較，當(dāng)歸紅芪超濾物組大鼠腦組織缺失mt-DNA/內(nèi)參mt-DNA比值無顯著差異(0.525±0.101，P>0.05)，說明當(dāng)歸紅芪超濾物同維生素E在對衰老大鼠腦組織mt-DNA缺失的影響作用是相當(dāng)?shù)?。見圖2。

組 別nSOD活力(U/mgprot)MDA(nmol/mgprot)青年組12183.590±20.4482)3)1.411±0.2872)3)老年組1292.987±21.2461)3)7.678±0.7951)3)當(dāng)歸紅芪超濾物組12141.132±18.2281)2)3.871±0.4731)2)維生素E組11132.181±8.0861)2)4.031±0.7631)2)

與青年組組比較：1)P<0.05；與老年組比較：2)P<0.05；與維生素E組比較：3)P<0.05

M:Marker；1：青年組缺失mt-DNA；2:青年組野生mt-DNA；3.老年組缺失mt-DNA；4.老年組野生mt-DNA；5當(dāng)歸紅芪超濾物組缺失mt-DNA；6. 當(dāng)歸紅芪超濾物組野生mt-DNA；7.維生素E組缺失mt-DNA；8.維生素E組野生mt-DNA 圖2　各組大鼠腦組織mt-DNA缺失的凝膠成像圖

3討論

衰老的器官和組織主要表現(xiàn)在形態(tài)和功能兩方面的變化，形態(tài)上表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)量減少，臟器萎縮和變性，引起相應(yīng)生理功能逐漸減退〔8〕。神經(jīng)系統(tǒng)在衰老過程中起著重要作用而且極易受損，體內(nèi)外的有害物質(zhì)通過作用于神經(jīng)細(xì)胞而影響其衰老的進程〔9〕，伴隨著年齡增長，衰老的腦組織會出現(xiàn)重量減輕，結(jié)構(gòu)變化，進而影響其功能。在影響衰老的進程中氧自由基屬決定性因素，起著至關(guān)重要的作用〔2〕，因此，增強機體抗自由基能力且減少腦組織自由基生成，維持它們之間的動態(tài)平衡便成為有延緩腦組織衰老，促進機體健康的有效方式。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為氣和血是構(gòu)成人體和維持人體的基本物質(zhì)，氣血的盛衰和運行狀況與人體衰老有著密切的關(guān)系，氣血虧虛是衰老的病機之一。中藥當(dāng)歸，黃芪在臨床上被廣泛用于延緩衰老的治療〔10〕。紅芪屬多巖序黃芪，甘肅道地藥材，有研究顯示紅芪對自由基的清除效果優(yōu)于黃芪，以自由基為誘因的疾病防治中優(yōu)先選用紅芪〔11，12〕。超濾技術(shù)可以保持藥物有效組分的生理活性,顯著提高藥效〔13〕。

本實驗采用自然衰老大鼠作為研究模型，更真實地模擬了衰老的生理變化過程〔14〕，通過檢測顯示老齡鼠學(xué)習(xí)記憶功能下降，腦指數(shù)降低，腦組織結(jié)構(gòu)層次不清，排列雜亂，脫失比較明顯，進一步檢測顯示，衰老腦組織SOD活力下降,MDA含量增加，mt-DNA缺失片段增加。而用當(dāng)歸紅芪超濾物干涉雖然不能改變老齡鼠腦組織重量減輕的情況，但卻可以明顯改善老齡鼠的記憶功能，腦組織結(jié)構(gòu)的紊亂，本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸紅芪超濾物可能通過增加機體最重要的抗氧化酶——SOD的活力，降低自由基代謝產(chǎn)物——MDA的含量，從而有效地加強了機體抗氧化能力，減輕了自由基對mt-DNA的攻擊，防止mt-DNA片段丟失而發(fā)揮良好的抗衰老作用，并且發(fā)現(xiàn)其功效作用同維生素E相當(dāng)。本研究結(jié)果也提示益氣活血方劑發(fā)揮其療效作用的機制同抗氧化損傷密切相關(guān)，同時為益氣活血法在抗衰老中的臨床應(yīng)用的提供了一定的實驗依據(jù)。

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〔2013-12-09修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)