雞傳染性支氣管炎病毒多表位核酸疫苗的構(gòu)建及其免疫研究

劉 芳，譚 磊，陸 鳳，范 瑾，劉開春，王 欣，廖 瑛,仇旭升，孫英杰，宋翠萍，王桂軍，丁 鏟

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，合肥230036； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

·研究論文·

雞傳染性支氣管炎病毒多表位核酸疫苗的構(gòu)建及其免疫研究

劉 芳1, 2，譚 磊2，陸 鳳2，范 瑾2，劉開春2，王 欣2，廖 瑛2,仇旭升2，孫英杰2，宋翠萍2，王桂軍1，丁 鏟2

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，合肥230036； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

應(yīng)用篩選出的雞傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus, IBV）結(jié)構(gòu)蛋白S1基因的T細(xì)胞抗原表位盒、Australia T株和M41株S1基因的B細(xì)胞抗原表位，定向克隆入真核表達(dá)載體pVAX1，構(gòu)建成5個(gè)真核表達(dá)質(zhì)粒：pVAX-S1T+M、pVAXS1B-M41、pVAX-S1B-T、pVAX-S1T+S1B-M41、pVAX-S1T+S1B-T。將每組提取制備的質(zhì)粒溶液通過腿部肌肉多點(diǎn)注射免疫7日齡SPF雛雞，28日齡時(shí)加強(qiáng)免疫1次，同時(shí)設(shè)立PBS組作為對(duì)照免疫組。分別在首免前及免疫后7、14、21 d以及二免后10 d翅靜脈采血并分離血清，用間接ELISA方法檢測(cè)抗體效價(jià)。二免后10 d用IBV病毒液攻毒測(cè)定保護(hù)率。ELISA抗體效價(jià)結(jié)果顯示：二免后10 d各免疫組抗體水平達(dá)到最高，pVAX-S1B-T、pVAX-S1T+S1B-M41和pVAX-S1T+S1B-T組與PBS組相比差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)，pVAX-S1、pVAX-S1T+M 和pVAX-S1B-T組與PBS組相比差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)。攻毒結(jié)果表明，pVAX-S1、pVAX-S1B-T組的保護(hù)效率均為75%，高于PBS組（12.5%），表明表位抗原成分能夠有效發(fā)揮保護(hù)效力，與S1全基因疫苗組保護(hù)率相當(dāng)。本研究結(jié)果為研制安全有效的新型IBV疫苗提供了新的途徑。

傳染性支氣管炎病毒；抗原表位；核酸疫苗；免疫研究

傳染性支氣管炎（Infectious bronchitis, IB）是由雞傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus, IBV）引起的一種急性、高度接觸性傳染病，給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[1]。IBV存在多個(gè)血清型，給疫病的防控帶來極大困難。

生產(chǎn)中常采用弱毒疫苗對(duì)IB進(jìn)行預(yù)防控制，但存在毒力返強(qiáng)的隱患[2]。滅活疫苗對(duì)冠狀病毒感染的免疫效果不確實(shí)，且其副作用可能造成較嚴(yán)重及較長(zhǎng)時(shí)間的局部反應(yīng)[3,4]。DNA疫苗（又稱核酸疫苗），是將編碼病原體免疫原性蛋白的基因克隆到真核表達(dá)元件的序列后面，再導(dǎo)入動(dòng)物機(jī)體內(nèi)，通過宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成抗原蛋白，從而誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對(duì)該抗原蛋白的免疫應(yīng)答。由于DNA疫苗能模擬病毒自然感染過程中抗原提呈的過程，使表達(dá)的抗原能以天然的形式加工提呈給免疫識(shí)別系統(tǒng)，從而有效地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生廣泛的體液免疫和細(xì)胞免疫，因而在多種疾病的防治研究中已顯示出巨大的應(yīng)用潛力[5]。

常規(guī)DNA疫苗具有安全性好和誘導(dǎo)全方位免疫應(yīng)答等優(yōu)點(diǎn)，但它需要以整個(gè)基因?yàn)槟康钠?，且通常只能攜帶一個(gè)目的基因，誘導(dǎo)的免疫保護(hù)力有限。而表位疫苗則突破了常規(guī)DNA疫苗的局限，多表位DNA疫苗[6-9]除了可同時(shí)激活細(xì)胞和體液免疫之外，還具有諸多優(yōu)點(diǎn)：內(nèi)源性表位提呈可避免表位肽的降解；可去除抗原中非相關(guān)的和免疫抑制性區(qū)域，降低免疫耐受和自身免疫發(fā)生的可能性，同時(shí)可去除潛在的致病區(qū)域，提高疫苗的安全性；可使免疫效應(yīng)集中在高度保守的特異性表位，防止抗原調(diào)變導(dǎo)致免疫逃逸；在單一載體中易于容納多個(gè)不同抗原，更具有廣譜性。

本實(shí)驗(yàn)室前期應(yīng)用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)并驗(yàn)證篩選獲得了IBV Australia T株和M41株的結(jié)構(gòu)蛋白S1基因的T細(xì)胞抗原表位盒以及B細(xì)胞抗原表位盒[10]。本研究基于此T、B細(xì)胞表位盒構(gòu)建了5組表位相關(guān)真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX-S1T+M、pVAX-S1B-M41、pVAX-S1B-T、pVAX-S1T+S1B-M41、pVAXS1T+S1B-T。免疫動(dòng)物后，用間接ELISA方法檢測(cè)體液免疫水平，通過攻毒保護(hù)率來評(píng)價(jià)免疫效果，為研制能有效防止IB流行的新型DNA疫苗提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 毒株、載體IBV經(jīng)典呼吸型M41株和腎型Australia T株為本實(shí)驗(yàn)室保存；感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根公司；pET-28a(+)、pVAX1表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室保存；pMD19T-simple載體購(gòu)于寶生物公司；真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX-S1由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF雞胚購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（9～11日齡SPF雞胚和SPF雛雞由本實(shí)驗(yàn)室自行孵化飼養(yǎng)）。

1.3 主要試劑T4連接酶為美國(guó)Promega公司；各種限制性內(nèi)切酶購(gòu)自寶生物公司；質(zhì)粒提取試劑盒為QIAGEN Plasmid Midi kit；酶標(biāo)兔抗雞IgG購(gòu)自Sigma公司；ELISA板購(gòu)自Corning公司。

1.4 真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建pVAX-S1T+M的構(gòu)建：將合成的IBV S1基因T細(xì)胞表位盒（S1T）用Cla I 和Xho I雙切回收備用。利用IBV M41株特異性引物擴(kuò)增M基因連入pMD19T-simple載體，陽(yáng)性質(zhì)粒用Cla I和Xho I雙切回收，連接Cla I和Xho I雙酶切的S1T表位盒。Hind III和Xho I雙酶切回收，連接入相同酶切的載體pVAX，構(gòu)建成pVAXS1T+M。pVAX-S1B-M41、pVAX-S1B-T的構(gòu)建：分別篩選了IBV病毒M41株、Australia T株的B細(xì)胞抗原表位S1B-M41、S1B-T，Hind III和Xho I雙酶切回收，連接入相同酶切的載體pVAX，構(gòu)建成pVAX-S1B-M41、pVAX-S1B-T。pVAXS1T+S1B-M41、pVAX-S1T+S1B-T的構(gòu)建：S1B-M41、S1B-T用Cla I和Xho I雙酶切回收，連接Cla I和Xho I雙酶切的S1T表位盒，Hind III和Xho I雙酶切回收，連接入相同酶切的載體pVAX，構(gòu)建成pVAX-S1T+S1B-M41、pVAX-S1T+S1B-T。

1.5 動(dòng)物免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)

1.5.1 大量制備免疫用核酸DNA 分別將pVAX-S1、pVAX-S1T+M、pVAX-S1B-M41、pVAXS1B-T、pVAX-S1T+S1B-M41、pVAXS1T+S1B-T的陽(yáng)性質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用QIAGEN Plasmid Midi kits 進(jìn)行質(zhì)粒中量提取，獲得的質(zhì)粒用紫外核酸蛋白分析儀測(cè)定質(zhì)粒純度和濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 攻毒用毒株ELD50的測(cè)定 將IBV Australia T株尿囊液進(jìn)行10倍梯度稀釋，取10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10稀釋度的病毒液尿囊腔接種SPF雞胚，每個(gè)稀釋度接種7枚胚，0.1 mL/枚。同樣IBV M41株取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9稀釋度的病毒液接種SPF雞胚。連續(xù)觀察5 d，24 h內(nèi)死亡的雞胚棄去。記錄雞胚死亡情況，用Reed-Muench法計(jì)算雞胚半數(shù)致死量（median embryo lethal dose，ELD50）。

1.5.3 實(shí)驗(yàn)分組及免疫程序 將70只SPF雞隨機(jī)分成7組，每組10只（表1）。7日齡首免，首免后3周（28日齡）加強(qiáng)免疫1次。

表1 實(shí)驗(yàn)分組及免疫程序Table1 Grouping and immunization program in this study

1.5.4 ELISA檢測(cè)特異性IBV IgG抗體 首免前及免疫后7、14、21 d以及二免后10 d每組隨機(jī)抽取3只雞頸靜脈采血并分離血清，用間接ELISA方法檢測(cè)抗體效價(jià)。具體方法：將IBV病毒液用包被液10倍稀釋后，加入酶標(biāo)板中，100 μL/孔，4℃過夜；棄掉液體，PBST洗板3次，300 μL /孔，每次3 min，每孔加入200 μL 10%胎牛血清封閉， 37℃作用2 h；PBST洗板3次，加入提前用PBS稀釋20倍的待測(cè)血清，100 μL/孔，37℃作用2 h；PBST洗板3次，加入兔抗雞酶標(biāo)抗體IgG（PBS按1∶5000稀釋），100 μL/孔，37℃作用1 h；PBST洗板3次，加入TMB底物溶液，100 μL/孔，避光室溫作用20 min；加入2N H2SO4100 μL/孔終止反應(yīng)，于波長(zhǎng)450nm下測(cè)定各孔OD值。

1.5.5 攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn) 二免后d10攻毒，用IBV Australia T株和M41株病毒液混合后，經(jīng)滴鼻點(diǎn)眼進(jìn)行攻毒，106ELD50/只，攻毒后觀察各組雞發(fā)病情況，連續(xù)觀察2周。

攻毒后d4、6、8、10、12、14采集泄殖腔棉拭子，置于無菌PBS中，反復(fù)凍融3次，8000×g離心10 min，取上清液提取RNA作為模板，用熒光定量PCR法檢測(cè)排毒量。構(gòu)建IBV M41株M基因的質(zhì)粒pMD19T-M，作為繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒。

2 結(jié)果

2.1 真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建成功構(gòu)建了pVAXS1T+M、pVAX-S1B-M41、pVAX-S1B-T，pVAX-S1T+S1B-M41和pVAX-S1T+S1B-T 五個(gè)重組質(zhì)粒，用于后續(xù)免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 動(dòng)物免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)

2.2.1 特異性IBV血清抗體的ELISA檢測(cè) ELISA結(jié)果顯示各疫苗組在首免后7 d抗體水平有所上升，隨著免疫時(shí)間的延長(zhǎng)其抗體水平逐漸增高，各疫苗組均高于PBS對(duì)照組 (P＜0.05)，并在二免后d10達(dá)到最高水平，pVAX-S1B-T、pVAX-S1T+S1B-M41和pVAX-S1T+S1B-T組與PBS組相比差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)，pVAX-S1、pVAX-S1T+M 和pVAX-S1B-T組與PBS組相比差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)（圖1）。

圖1 免疫后各組抗體水平Fig.1 Antibody level of each group after immunization

圖2 攻毒后各組保護(hù)效力Fig.2 Productive effi cacy of DNA vaccines in each group

2.2.2 攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn) 各組攻毒后保護(hù)率如圖2所示。攻毒后d4 PBS組出現(xiàn)流鼻涕、甩頭癥狀，伴有氣管啰音，部分雞開始出現(xiàn)死亡，攻毒后d14死亡率達(dá)87.5%。死亡雞剖檢病變主要在呼吸道和腎臟，具體表現(xiàn)為上呼吸道充滿黏液，喉頭腫脹，氣管出現(xiàn)點(diǎn)狀出血，腎臟腫大，呈典型的花斑型腎。疫苗免疫組pVAX-S1和pVAX-S1B-T免疫后，有效誘導(dǎo)了雞體的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，能提供75%的保護(hù)率。

制備的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒pMD19T-M濃度為11.5 ng/μL，質(zhì)粒大小為678 bp，換算成拷貝數(shù)為3.221×107copies/μL。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品在10-2～10-8范圍內(nèi)稀釋時(shí)，線性關(guān)系良好。以Ct值為y軸，對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為x軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3）。標(biāo)準(zhǔn)方程為y=-3.5982x+33.688，相關(guān)系數(shù)R2為0.9993。

圖3 熒光定量PCR檢測(cè)pMD19T-M的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The standard curve graph of pMD19T-M by real time qPCR assay

熒光定量PCR檢測(cè)顯示攻毒后d4各組均開始出現(xiàn)排毒，以PBS組排毒量最高，pVAX-S1B-T組排毒量最低（圖4）。

3 討論

表位核酸疫苗是在總結(jié)核酸疫苗與多肽疫苗優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上發(fā)展出來的一種新型疫苗，它通過人工設(shè)計(jì)的方法用間隔序列將有效的疫苗抗原表位序列串連在一起，構(gòu)成一個(gè)全新疫苗候選基因[11]。它比常規(guī)疫苗具有更多優(yōu)勢(shì)[12]：僅含免疫相關(guān)序列而無多余無用的序列，可誘導(dǎo)更強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)；可表達(dá)多個(gè)不同的保護(hù)性抗原表位，誘導(dǎo)多重免疫保護(hù)性反應(yīng)，進(jìn)而提高疫苗保護(hù)水平；設(shè)計(jì)的全新復(fù)合表位可改變表位在毒性抗原蛋白中的次序，因此新表達(dá)的蛋白降低了原蛋白的毒性而保留其免疫原性；可對(duì)多表位基因進(jìn)行修飾，如添加N端信號(hào)肽引導(dǎo)序列、通用性細(xì)胞表位、免疫刺激基序等，使其獲得最佳的免疫效果；比活載體苗、常規(guī)DNA疫苗更安全，無基因整合、重組等問題。因此，表位疫苗在未來疫苗研究中有廣泛的應(yīng)用前景。

本研究應(yīng)用篩選出的IBV的結(jié)構(gòu)蛋白S1基因的T細(xì)胞抗原表位盒、Australia T株和M41株的S1基因的B細(xì)胞抗原表位，構(gòu)建了5個(gè)真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX-S1T+M、pVAX-S1B-M41、pVAX-S1B-T、pVAX-S1T+S1B-M41、pVAXS1T+S1B-T，共同免疫7日齡雛雞，血清抗體的ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示各疫苗組的抗體效價(jià)水平均高于PBS對(duì)照組（P＜0.05），并在二免后d10達(dá)到最高水平，pVAX-S1B-T、pVAX-S1T+S1B-M41 和pVAX-S1T+S1B-T組與PBS組相比差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)，pVAX-S1、pVAXS1T+M 和pVAX-S1B-T組與PBS組相比差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)。攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示pVAX-S1、pVAX-S1B-T組均能提供75%免疫保護(hù)效力。結(jié)果表明本研究成功篩選到一組由Australia T株S1基因的B細(xì)胞抗原表位構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX-S1B-T，篩選的B細(xì)胞抗原表位發(fā)揮了重要作用，能有效誘導(dǎo)雞體的免疫反應(yīng)，與全基因免疫組pVAX-S1相比能提供更好的保護(hù)率。而本研究中構(gòu)建的T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位混合組pVAXS1T+S1B-M41和pVAX-S1T+S1B-T雖然IgG抗體效價(jià)較高，但是在攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)中混合表位組保護(hù)率較低，可能是由于多表位成分較為復(fù)雜，表位間相互影響造成沒有完全發(fā)揮效力，下一步研究中將優(yōu)化混合表位組的表位組合，以期提高細(xì)胞免疫和體液免疫水平。

圖4 攻毒后各組排毒量Fig.4 Viral shedding in each group after challenge

本研究獲得了一組能夠與IBV S1全基因提供相同保護(hù)率的表位疫苗pVAX-S1B-T，為進(jìn)一步構(gòu)建嵌合IBV表位重組病毒提供了重要的表位信息，為研制安全有效的新型IBV疫苗提供了新的途徑。

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CONSTRUCTION AND IMMUNOGENICITY OF A MULTI-EPITOPE DNA VACCINE AGAINST INFECTIOUS BRONCHITIS VIRUS IN CHICKENS

LIU Fang1, 2, TAN Lei2, LU Feng2, FAN Jin2, LIU Kai-chun2, WANG Xin2, LIAO Ying2, QIU Xu-sheng2, SUN Ying-jie2, SONG Cui-ping2, WANG Gui-jun1, DING Chan2

(1.Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China; 2.Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

Infectious bronchitis virus; epitope ; DNA vaccine ; immunization

: The T cell epitope box of structural protein S1 gene of avian Infectious bronchitis virus (IBV) and B cell epitopes of Australia T strain and M41 strain S1 gene were cloned into the eukaryotic expression vector pVAX1, constructing five groups of eukaryotic expression plasmids: pVAX-S1T+M, pVAX-S1B-M41, pVAX-S1B-T, pVAX-S1T+S1B-M41 and pVAX-S1T+S1B-T.The plasmid solution from each group was administered to 7-days-old chickens via intramuscular route.Three weeks later, chickens were boosted with the same doses of DNA vaccines.Chickens receiving PBS served as controls.Blood samples were taken at 0, 7, 14 and 21 days post the fi rst vaccination and 10 days post the second vaccination.Anti-IBV specifi c antibodies were measured in indirect ELISA.At 10 days post the second vaccination, chickens were challenged with virulent IBV strains.The result showed that antibody titers of chickens immunizedwith pVAX-S1, pVAX-S1T+M and pVAX-S1B-T were signifi cantly higher (P＜0.01) than that of control group.The protection against the challenge was achieved in 75% chickens administered with pVAX-S1 and pVAX-S1B-T.In conclusion, the present study provided a new strategy to enhance the protection of IBV DNA vaccine.

2014-12-08

上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（滬農(nóng)科攻字（2013）第3-7號(hào)）

劉芳，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

王桂軍, E-mail∶ wangguijun@ahau.edu.cn；丁鏟, E-mail∶shoveldeen@shvri.ac.cn

S852.659.6

A

1674-6422（2015）02-0026-06