貓泛白細(xì)胞減少癥病毒VP2基因快速檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

邱 杰，溫肖會(huì)，翟少倫，呂殿紅，寧章勇，魏文康

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所，廣州 510640）

·研究論文·

貓泛白細(xì)胞減少癥病毒VP2基因快速檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

邱 杰1,2，溫肖會(huì)2，翟少倫2，呂殿紅2，寧章勇1，魏文康2

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所，廣州 510640）

為了調(diào)查貓泛白細(xì)胞減少癥病毒（Feline panleukopenia virus, FPV）在貓群中的流行情況，根據(jù)GenBank已登錄的FPV VP2基因序列設(shè)計(jì)PCR引物，建立了FPV PCR快速檢測(cè)方法，并對(duì)3004份貓樣品進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，該方法擴(kuò)增的VP2基因片段為468 bp左右，檢出的最小基因組DNA濃度為6.19×10-8μg/μL，檢出DNA濃度低于1 fg/μL，從3004份樣品中檢測(cè)出13份貓泛白細(xì)胞減少癥病毒核酸陽(yáng)性樣品。本研究針對(duì)FPV VP2基因建立的PCR快速檢測(cè)方法可作為FPV臨床早期診斷及快速篩查手段。

貓泛白細(xì)胞減少癥病毒；VP2基因；PCR

貓泛白細(xì)胞減少癥（feline panleukopenia，F(xiàn)P）也稱貓瘟熱、貓細(xì)小病毒病，是由貓泛白細(xì)胞減少癥病毒（Feline panleukopenia virus，F(xiàn)PV）引起的一種高度接觸性急性傳染病。該病在自然條件下可感染貓科、浣熊科和鼬科等家貓、野貓及野生動(dòng)物包括動(dòng)物園國(guó)家保護(hù)動(dòng)物（如虎、獅、豹、浣熊等），感染比較普遍[1]；傳播性極強(qiáng)，感染動(dòng)物可通過(guò)糞便、嘔吐物、鼻涕、唾液、尿液排出病毒從而污染食具、籠子、墊物和周圍環(huán)境，妊娠母貓也可垂直傳播給胎兒，跳蚤和吸血昆蟲可成為傳播媒介；致病性極強(qiáng)，妊娠母貓?zhí)夯翁ド踔亮鳟a(chǎn)，死亡率高且無(wú)任何前驅(qū)癥狀[2]。目前該病的診斷方法是根據(jù)臨床表現(xiàn)做出初步診斷，借助膠體金試紙檢測(cè)、病毒分離、血清學(xué)試驗(yàn)等確診，這些檢測(cè)方法耗時(shí)、費(fèi)力、準(zhǔn)確性不夠，難以做大量篩查以滿足防控需求[3-5]。近幾年城市里動(dòng)物園貓科動(dòng)物增多，參觀人數(shù)較多，同時(shí)家庭寵物貓的養(yǎng)殖量急劇增多而且交流頻繁，疫病監(jiān)測(cè)和防控工作受到高度關(guān)注，建立適用于寵物、野生動(dòng)物FPV的早期診斷及大量快速篩查方法迫在眉睫。

FPV為細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬成員，基因組為單股DNA，長(zhǎng)約5200 nt，編碼2種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1、VP2），其中VP2 為主要結(jié)構(gòu)蛋白，是FPV衣殼的主要成分，暴露在衣殼蛋白表面，為FPV 的主要免疫保護(hù)性抗原蛋白[6,7]。因此，針對(duì)FPV VP2基因建立快速、敏感的PCR檢測(cè)方法，可為FPV臨床早期診斷和快速篩查奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗與病毒 貓四聯(lián)活疫苗（FP、貓衣原體、貓病毒性鼻氣管炎、貓傳染性鼻-結(jié)膜炎）來(lái)自美國(guó)輝瑞制藥有限公司，批號(hào)：A307101A；犬細(xì)小病毒（Canine parvovirus，CPV）、小鵝瘟病毒（Goose parvovirus，GPV）、豬細(xì)小病毒（Porcine parvovirus，PPV）、FPV由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所動(dòng)物疫病診斷中心保存。

1.1.2 待測(cè)樣品 2013年5月至2014年4月在廣州市5家動(dòng)物醫(yī)院收治的門診中共采集3004份樣品，包括泄殖腔棉試子、糞便、全血、病死貓的腸道等樣品，由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所動(dòng)物疫病診斷中心保存。

1.1.3 主要試劑和工具酶 Taq DNA 聚合酶、dNTP、DL 2000 Marker 等均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒、2×Taq PCR MasterMix購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。

1.1.4 主要儀器設(shè)備 S1000 梯度PCR儀購(gòu)自美國(guó)伯樂公司；1600凝膠成像系統(tǒng)、EPS-300電泳儀購(gòu)自上海天能科技有限公司；DU730核酸分析儀購(gòu)自美國(guó)貝克曼公司；AC204電子天平購(gòu)自瑞士梅特勒-托力多儀器有限公司；DK-8D三孔電熱恒溫水槽購(gòu)自上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；移液器購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；PIC017離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)賀利氏公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù) GenBank 已公布的FPV VP2基因序列（登錄號(hào)：DQ474237.1、FJ405225.1、EU697387.1、AB054227.1、AB054225.1），用 Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)FPV VP2基因特異性引物，用于FPV VP2基因擴(kuò)增。預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度約為468 bp。FPVF∶5'-TGGTTCTGGGGGTGTGGG-3'；FPVR∶5'-GCTGCTGGAGTAAATGGC-3'。以上引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2 樣品前處理 泄殖腔棉試子、糞便等樣品：4722×g離心2 min，取上清液備用；全血樣品：待血凝后經(jīng)4722×g離心2 min，取血清備用；腸道樣品：稱取0.05 g于研磨器中研磨，加入1.5 mL生理鹽水繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5 mL滅菌離心管中，4722×g離心2 min，取上清液備用。

1.2.3 模板制備 經(jīng)前處理的樣品按照天根生化科技有限公司病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒操作說(shuō)明書，提取病毒基因組，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 FPV VP2基因PCR擴(kuò)增體系 在 PCR 反應(yīng)管中分別加入滅菌ddH2O 7 μL、2×Taq PCR MasterMix 10 μL、上下游引物（20 pmol/μL）各0.5 μL、模板 2 μL，共20 μL PCR擴(kuò)增體系。

1.2.5 FPV VP2基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件的優(yōu)化 運(yùn)用正交法梯度性地改變變性溫度和時(shí)間，退火溫度和時(shí)間、延伸時(shí)間以及循環(huán)數(shù)等條件，確定上下游引物的最佳循環(huán)擴(kuò)增條件。

1.2.6 FPV VP2基因PCR擴(kuò)增特異性試驗(yàn) 以貓四聯(lián)活疫苗、犬細(xì)小病毒、小鵝瘟病毒、豬細(xì)小病毒、FPV提取的基因組進(jìn)行PCR，滅菌ddH2O為陰性對(duì)照，驗(yàn)證該P(yáng)CR方法的特異性。

1.2.7 FPV VP2基因擴(kuò)增序列序列分析 取貓四聯(lián)活疫苗基因組 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物 50 μL 送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果提交NCBI Blast進(jìn)行比對(duì)。

1.2.8 FPV VP2基因PCR擴(kuò)增敏感性試驗(yàn) 將貓四聯(lián)活疫苗提取的基因組用核酸分析儀確定其濃度，然后將其按10倍遞減稀釋至 10-9，用引物對(duì)其進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證該P(yáng)CR方法的敏感性。

1.2.9 FPV VP2基因PCR擴(kuò)增重復(fù)性試驗(yàn) 將貓四聯(lián)活疫苗在相同條件下，重復(fù)進(jìn)行 8次基因組DNA提取和 PCR檢測(cè)，以驗(yàn)證該P(yáng)CR方法的重復(fù)性。

1.2.10 臨床樣品檢測(cè) 運(yùn)用貓泛白細(xì)胞減少癥金標(biāo)檢測(cè)試紙條和已建立的FPV VP2基因PCR檢測(cè)方法對(duì)3004份貓樣品分別進(jìn)行了檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 FPV VP2基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件最佳循環(huán)擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性 5 min；95℃ 變性30 s，50℃延伸30 s，72℃延伸30 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后 72℃延伸 7 min，4℃保存。

2.2 FPV VP2基因PCR擴(kuò)增特異性試驗(yàn)經(jīng) 1.2% 瓊脂糖凝膠電泳顯示，F(xiàn)PV和貓四聯(lián)活疫苗基因組 PCR產(chǎn)物在468 bp左右出現(xiàn)了一條特異性目的片段，與預(yù)期大小相符，犬細(xì)小病毒、小鵝瘟病毒、豬細(xì)小病毒等細(xì)小病毒科基因組、滅菌ddH2O陰性對(duì)照沒有條帶出現(xiàn)（圖1）。

圖1 FPV VP2基因PCR檢測(cè)特異性試驗(yàn)Fig.1 Specifi city test of PCR for detecting FPV

2.3 貓四聯(lián)活疫苗基因組擴(kuò)增片段序列分析將擴(kuò)增到的貓四聯(lián)活疫苗基因組片段測(cè)序，序列測(cè)定結(jié)果提交NCBI Blast 進(jìn)行檢索比對(duì)，鑒定為FPV VP2基因片段，結(jié)果表明，本研究設(shè)計(jì)的FPV VP2基因引物能準(zhǔn)確擴(kuò)增到FPV基因。

2.4 FPV-VP2基因PCR擴(kuò)增敏感性試驗(yàn)用核酸測(cè)定儀測(cè)定貓四聯(lián)活疫苗基因組的濃度為0.619 μg/ μL，OD260與OD280的比值為 1.81，按 10倍遞減稀釋至 10-9，PCR擴(kuò)增體系為 20 μL，模板為 2 μL。能檢出的最小基因組DNA濃度為6.19×10-8μg/μL（圖2）。

圖2 FPV VP2基因PCR檢測(cè)敏感性試驗(yàn)Fig.2 Sensitivity test of PCR for detection of FPV

2.5 FPV-VP2基因PCR擴(kuò)增重復(fù)性試驗(yàn)經(jīng) 1.2% 瓊脂糖凝膠電泳顯示，8次提取的貓四聯(lián)活疫苗基因組DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果均出現(xiàn)了清晰明亮的目的條帶（圖3）。

2.6 臨床樣品檢測(cè)FPV金標(biāo)檢測(cè)試紙條從5家動(dòng)物醫(yī)院共檢測(cè)出10份疑似FPV陽(yáng)性樣品，本研究建立的FPV-PCR檢測(cè)方法不但從以上10份疑似貓泛白細(xì)胞減少癥陽(yáng)性樣品中檢測(cè)出FPV核酸陽(yáng)性樣品，而且從2994份FPV金標(biāo)檢測(cè)試紙條檢測(cè)陰性的樣品中檢測(cè)出3份FPV核酸陽(yáng)性樣品（表1），結(jié)果表明，建立的FPV-PCR檢測(cè)方法不但準(zhǔn)確而且更為靈敏。

圖3 FPV VP2基因PCR擴(kuò)展重復(fù)性試驗(yàn)Fig.3 Repeatability test of PCR for FPV VP2 gene

表1 3004份貓樣品金標(biāo)試紙條和PCR檢測(cè)結(jié)果Table1 The detection result of PCR and Colloidal gold immunostrip for 3004 samples

3 討論

FPV與CPV、水貂腸炎病毒（Mink entertis virus，MEV）三者血清抗體彼此間有交叉反應(yīng)，病毒基因組之間同源性比較高。CPV可在犬或貓細(xì)胞復(fù)制，而貓細(xì)小病毒只能在貓細(xì)胞中復(fù)制[2]。FPV在自然條件下能夠感染貓科和鼬科多種動(dòng)物，CPV遺傳特性、基因組特點(diǎn)與FPV相似，起初CPV2型只感染犬跟犬屬動(dòng)物，并不感染貓。隨著病毒重要氨基酸的不斷變異，CPV出現(xiàn)新的變異株，導(dǎo)致病毒的宿主范圍擴(kuò)大，能夠引起貓的感染[8,9]。因此，設(shè)計(jì)的引物必須具有特異性，能準(zhǔn)確擴(kuò)增到FPV基因組。結(jié)構(gòu)蛋白VP2是病毒重要的抗原性蛋白，在誘導(dǎo)機(jī)體的免疫反應(yīng)和病毒感染的過(guò)程中占主導(dǎo)地位，病毒的遺傳變異也主要體現(xiàn)在該蛋白序列中[10,11]。通過(guò)對(duì)FPV、CPV、MEV VP2基因進(jìn)行比對(duì)，選取FPV VP2特異性基因序列設(shè)計(jì)特異性引物。

近年來(lái)，寵物飼養(yǎng)量快速增加，北京、上海、廣州、重慶和武漢已被稱為“中國(guó)五大寵物城市”[12]。寵物攜帶疫病可快速傳播，引起很多負(fù)面影響[13,14]。隨著人員流動(dòng)，寵物犬貓也會(huì)乘坐相應(yīng)的交通工具流動(dòng)，增加了寵物疫病如犬瘟熱、貓瘟熱、狂犬病等潛在傳播流行的風(fēng)險(xiǎn)[15]。2013年4月農(nóng)業(yè)部首次頒發(fā)了《關(guān)于進(jìn)一步加強(qiáng)犬和貓產(chǎn)地檢疫監(jiān)管工作的通知》，嚴(yán)格要求開展犬、貓產(chǎn)地檢疫，在調(diào)運(yùn)犬、貓前應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)疫病的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。然而，目前FPV快速檢測(cè)沒有相應(yīng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，國(guó)內(nèi)對(duì)貓泛白細(xì)胞減少癥的檢疫方法也很少報(bào)道，一般沿用傳統(tǒng)分離、血清學(xué)等方法，耗時(shí)耗力，難以滿足進(jìn)一步加強(qiáng)犬和貓產(chǎn)地檢疫監(jiān)管和進(jìn)行大量的病原篩查工作的要求。

本研究根據(jù)GenBank已登錄的FPV VP2基因序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，成功建立了FPV PCR檢測(cè)方法，通過(guò)與FPV金標(biāo)檢測(cè)試紙條進(jìn)行對(duì)比，建立的FPV PCR檢測(cè)方法不但從10份疑似貓泛白細(xì)胞減少癥陽(yáng)性樣品中檢測(cè)出FPV核酸陽(yáng)性樣品，而且從2994份FPV金標(biāo)檢測(cè)試紙條檢測(cè)陰性的樣品中檢測(cè)出3份FPV核酸陽(yáng)性樣品?？梢姡狙芯拷PV檢測(cè)方法具有良好的特異性、重復(fù)性、敏感性，可以作為FPV流行病學(xué)調(diào)查的一種方法，滿足了政府產(chǎn)地檢疫的需求。

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DEVELOPMENT AND APPLICATION OF PCR ASSAY FOR DETECTION OF FELINE PANLEUKOPENIA VIRUS

QIU Jie1, 2, WEN Xiao-hui2, ZHAI Shao-lun2, LV Dian-hong2, NING Zhang-yong1, WEI Wen-kang2

(1.College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 2.Institute of Animal Health, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, China)

To investigate the prevalence of Feline panleukopenia virus in cats, PCR method was developed using primers designed from the sequence of VP2 gene of Feline panleukopenia virus in GenBank.The amplifi ed VP2 gene fragment was 468 bp in length.The minimal DNA detection concentration was 6.19×10-8μg/μL, which was below 1 fg/μL.This PCR method was used to test 3004 samples.Total 13 samples were confi rmed positive for Feline panleukopenia virus.Therefore, the PCR method developed here is suitable for early diagnosis and epidemiological investigation of Feline panleukopenia virus in pets and wild animals.

Feline panleukopenia virus; VP2 gene; PCR

S852.659.2

文章編號(hào)：1674-6422（2015）02-0021-05

2014-12-02

省部產(chǎn)學(xué)研合作科技創(chuàng)新平臺(tái)項(xiàng)目（2012B090600048）；廣州市科普項(xiàng)目（2013KP093、2013KP072）；廣州市動(dòng)物疫病診斷行業(yè)工程技術(shù)中心（穗科信字[2012]224-26號(hào)）；廣東省農(nóng)村信息直通車工程（2012A020601010）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011B020306001）

邱杰，男，碩士，主要從事小動(dòng)物診療方面的研究

寧章勇，E-mail：ningzhyong@126.com; 魏文康，E-mail：wwk188@tom.com