結(jié)直腸癌組織PDCD4、PAQR3 mRNA水平及意義

結(jié)直腸癌組織PDCD4、PAQR3mRNA水平及意義

李日恒楊瑞紅1宋艷敏賈佳丁麗坤2鄭三龍2曹永樹2張愛民胡光

(河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北保定071000)

摘要〔〕目的探討結(jié)直腸癌組織中PDCD4和PAQR3 mRNA表達(dá)情況，以及與結(jié)直腸癌臨床資料之間的關(guān)系。方法收集結(jié)直腸癌及癌旁正常組織標(biāo)本各54例，用RT-PCR法檢測結(jié)直腸標(biāo)本中PDCD4和PAQR3 mRNA水平；分析PDCD4 和PAQR3 mRNA水平與臨床資料之間的關(guān)系。結(jié)果(1)結(jié)直腸癌組織中PDCD4 mRNA表達(dá)降低甚至不表達(dá)，表達(dá)降低率為35/54(64.8%)，PDCD4 mRNA表達(dá)水平為6.84±3.60，癌旁正常組織為5.88±2.52，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.036)。癌組織中PAQR3 mRNA表達(dá)水平降低，甚至不表達(dá)，表達(dá)降低率為57.4%(31/54)，PAQR3 mRNA表達(dá)水平為9.32±1.97，癌旁正常組織為8.44±2.42，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001);二者無相關(guān)性(R=0.129，P=0.532)。(2)結(jié)直腸癌組織中PDCD4 和PAQR3 mRNA均與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤深度有關(guān)，與性別、年齡、腫瘤部位無關(guān)。結(jié)論結(jié)直腸癌中PDCD4和PAQR3 mRNA表達(dá)下降，二者無明顯相關(guān)性；PDCD4 和PAQR3 mRNA水平均與分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤深度有關(guān)，與性別、年齡、腫瘤部位無關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕結(jié)直腸癌;PDCD4;PAQR3

中圖分類號(hào)〔〕R735〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目(132777248)；2015年度河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃項(xiàng)目(20150069)

1任丘市婦幼保健院2河北省淶源縣醫(yī)院

第一作者：李日恒(1972-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事胃腸外科疾病研究。

程序性細(xì)胞死亡因子(PDCD)4，是與細(xì)胞凋亡相關(guān)的抑癌基因，參與細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄、翻譯及多種信號(hào)通路。已有研究顯示，PDCD4在結(jié)直腸癌、胃癌、肺癌、肝癌、腦膠質(zhì)瘤等多種腫瘤組織中表達(dá)降低〔1，2〕。PAQR3是一種新的結(jié)直腸癌抑癌基因，參與了細(xì)胞的各種信號(hào)通路，影響能量代謝、細(xì)胞分裂增殖、分化以及生殖細(xì)胞成熟等生物學(xué)過程，能負(fù)性調(diào)控Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路。PAQR3也被證明在胃癌、乳腺癌等腫瘤組織中表達(dá)降低，PAQR3能增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3對表柔比星的敏感性〔3〕。目前已被證實(shí)PAQR3在結(jié)直腸癌組織中發(fā)揮抑癌作用〔4〕。本文探討PDCD4、PAQR3mRNA轉(zhuǎn)錄水平與結(jié)直腸癌的關(guān)系，進(jìn)一步指導(dǎo)結(jié)直腸癌診斷及治療。

1.材料與方法

1.1組織的提取54對結(jié)直腸癌組織、正常組織取自河北大學(xué)附屬醫(yī)院普通外科，收集標(biāo)本時(shí)間為2013～2014年。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者術(shù)前均未接受過放療、化療或免疫治療，收集癌組織標(biāo)本時(shí)除外已發(fā)生壞死的腫瘤組織，癌旁正常組織取距癌組織邊緣>10cm的正常組織，組織取全層，診斷結(jié)果均由術(shù)后病理結(jié)果確定。男32例，女22例；直腸癌19例，結(jié)腸癌35例；年齡36～82歲，平均59.69歲。術(shù)中立即取標(biāo)本放置于液氮中，并于-80℃冰箱內(nèi)低溫保存，時(shí)間不超過6個(gè)月。

1.2主要應(yīng)用試劑OmegaE.Z.N.A.TM總RNA提取試劑盒、VazymeHiscript第一鏈cDNA合成試劑盒、VazymeHiscriptqRTPCR熒光定量試劑盒、去RNA酶的EP管、槍頭、8聯(lián)排均購自石家莊市惠友生物科技有限公司，β-actin引物、PDCD4、PAQR3引物根據(jù)PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)合成，并通過PubmedBlast檢測其特異性，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。實(shí)驗(yàn)中所需的無水乙醇、氯仿、瓊脂糖等試劑均由河北大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室所提供。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1組織RNA提取取約30mg的組織，根據(jù)OmegaE.Z.N.A.TM總RNA試劑盒說明書提取總RNA，取產(chǎn)物2μl于1%瓊脂糖凝膠中電泳，紫外線下觀察并記錄結(jié)果，酶標(biāo)儀檢測含量(2 000ng/μl)及比值(OD：1.9～2.0)合適后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，中途不能及時(shí)完成時(shí)將產(chǎn)物放置-20℃或-80℃低溫保存，保存時(shí)間不超過3個(gè)月。

1.3.2反轉(zhuǎn)錄根據(jù)RNA定量結(jié)果調(diào)整RNA總量，各取總RNA1μg，根據(jù)VazymeHiscript第一鏈cDNA合成試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件：25℃，5min；42℃，30min；85℃，5min，反應(yīng)結(jié)束后產(chǎn)物進(jìn)行分裝稀釋，放置于-20℃，保存時(shí)間不超過6個(gè)月，用以進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.3.3PCRPCR引物根據(jù)Primerpremier5.0設(shè)計(jì)，反應(yīng)體系20μl，內(nèi)參基因β-actin引物：5’-GTGGACATCCGCAAAGAC-3’(正義)，5’-AAAGGGTGTAACGCAACTAA-3’(反義)，產(chǎn)物長度：302bp。PDCD4引物：5’-TGGGAGTGACGCCCTTAGAA-3’(正義)，5’-TCCACCTCCTCCACATCATACA-3’(反義)，產(chǎn)物長度 171bp；PAQR3引物：5’-TCTGTATGCTTTGCTCTGTGGG-3’(正義)，5’-TTTGCCATTGCTGCGTGAG-3’(反義)，產(chǎn)物長度252bp；反應(yīng)條件：95℃，5min；95℃，10s；60℃，，32s，40個(gè)循環(huán)；95℃，15s；60℃ 60s，95℃ 15s。結(jié)果以β-actin進(jìn)行校準(zhǔn)。擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外分析儀下分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS16.0軟件進(jìn)行t、χ2檢驗(yàn)和Spearman相關(guān)分析。

2結(jié)果

2.1結(jié)直腸癌組織中PAQR3 和PDCD4mRNA水平降低結(jié)直腸癌組織中PDCD4mRNA表達(dá)降低甚至不表達(dá)，表達(dá)降低率為35/54(64.8%)，表達(dá)水平：6.84±3.60，癌旁正常組織中mRNA為5.88±2.52，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.036)。癌組織中PAQR3mRNA表達(dá)水平降低，甚至不表達(dá)，表達(dá)降低率為57.4%(31/54)，癌組織PAQR3mRNA的表達(dá)水平9.32±1.97，癌旁正常組織：8.44±2.42，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。二者無相關(guān)性(R=0.129，P=0.532)。

2.2PDCD4、PAQR3mRNA水平與結(jié)直腸癌臨床資料的關(guān)系結(jié)直腸癌組織中PDCD4 和PAQR3mRNA均與分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤深度有關(guān)，與性別、年齡、腫瘤部位無關(guān)。見表1。

表1　 PDCD4、 PAQR3 mRNA水平與結(jié)直腸癌

3討論

PDCD4的分布影響其作用發(fā)揮，它除了在發(fā)揮腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮抑制轉(zhuǎn)錄、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及抑制轉(zhuǎn)移等作用，還能影響細(xì)胞類型的激活。在抑制轉(zhuǎn)錄方面，PDCD4蛋白能通過綁定eIF4A，直接抑制eIF4A結(jié)合到eIF4G，抑制eIF4A螺旋酶的活性，抑制轉(zhuǎn)錄起始；同時(shí)還能阻止P53與eIF4A的結(jié)合，抑制P53的表達(dá)，致其DNA損傷修復(fù)功能受損。此過程也影響細(xì)胞周期，能阻止G1向S、G2期進(jìn)展〔4〕。在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖方面，不同細(xì)胞的PDCD4調(diào)節(jié)方式也不同，細(xì)胞類型的差異也影響PDCD4功能的發(fā)揮〔5～10〕。PDCD4敲除的結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞分化能力明顯增強(qiáng)，c-Jun磷酸化水平明顯提高，eIF4E、FLIP表達(dá)〔11〕。PDCD4能抑制JNK的活性，進(jìn)一步抑制c-jun磷酸化，阻止eIF4E磷酸化，使金屬蛋白酶(MMP)-9和MMP-2表達(dá)降低，抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移；逆轉(zhuǎn)其磷酸化反應(yīng)后，MMP-9和MMP-2表達(dá)增高，促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

PDCD4mRNA在大腸癌中表達(dá)降低，表示PDCD4參與結(jié)直腸癌的形成，能作為結(jié)直腸癌的一種腫瘤標(biāo)志物。Ferraro等〔12〕研究顯示，PDCD4mRNA低表達(dá)與淋巴結(jié)相關(guān)，能預(yù)測是否發(fā)生轉(zhuǎn)移，與本項(xiàng)研究分析結(jié)果一致。雖然各研究結(jié)果略有不同，但PDCD4mRNA水平檢測可以作為一種監(jiān)測結(jié)直腸癌預(yù)后的輔助指標(biāo)。

PAQR3競爭性結(jié)合于RAF，干擾RAF與下游信號(hào)分子、底物的結(jié)合〔13〕，感受細(xì)胞外信號(hào)、控制細(xì)胞增殖分化及存活，作用就是將胞外的刺激信號(hào)傳遞至胞內(nèi)，達(dá)到調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡及細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、癌癥的發(fā)生、發(fā)展等生理過程的目的〔14〕。PAQR3基因沉默的機(jī)制仍不清楚。Wang等〔9〕檢測PAQR3mRNA在結(jié)直腸癌中表達(dá)降低率為82.3%(51/62)，與本研究結(jié)果有一定差異，而且他們提到在男性患者中PAQR3mRNA表達(dá)降低率較女性患者更高，這與結(jié)直腸癌在男性患者中比女性患者發(fā)病率高的流行病學(xué)分析結(jié)果一致〔15〕。且Wang等〔9〕發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中PAQR3mRNA水平與部位、年齡無關(guān)，與本研究的結(jié)果一致。

多種基因參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生檢測相關(guān)基因、有利于結(jié)直腸癌的早期診斷。但單獨(dú)檢測某種基因特異性低、檢出診斷率下降，不利于結(jié)直腸癌的早期診斷。多個(gè)基因聯(lián)合檢測為結(jié)直腸癌的早期診斷提供了更充分的依據(jù)。

4參考文獻(xiàn)

1PanYM，XingR，AnJ，et al.AmplificationofthemiR-181c/dclusterisinverselycorrelatedwithPDCD4expressioningastriccancer〔J〕.ChinSciBull,2014;59(19)：2240-8.

2DikshitB，IrshadK，MadanE，et al.FAT1actasanupstreamregulatorofoncogenicandinflammatorypathways，viaPDCD4，ingliomacells〔J〕.Oncogene，2013;32(33)：3798-808.

3黃劍波，羅鑫榮，孔令泉，等.PAQR3 對乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3的表柔比星敏感性的影響〔J〕.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013;35(16)：1658-62.

4WedekenL，SinghP，KlempnauerKH，et al.TumorsuppressorproteinPdcd4inhibitstranslationofP53mRNA〔J〕.JBiolChem，2011;286(50)：42855-62.

5G?keA，G?keR，KnolleA，et al.DUGisanovelhomologueoftranslationinitiationfactor4GthatbindseIF4A〔J〕.BiochemBiophysResCommun,2002;(297)：78-82.

6ShiotaM，IzumiH，TanimotoA，et al.Programmedcelldeathprotein4down-regulatesY-boxbindingprotein-1expressionviaadirectinteractionwithTwist1tosuppresscancercellgrowth〔J〕.CancerRes，2009;69(7)：3148-56.

7BitomskyN，WethkampN，MarikkannuR，et al.SiRNA-mediatedknockdownofPdcd4expressioncausesupregulationofp21Waf1/Cip1expression〔J〕.Oncogene，2008;27：4820-9.

8YangHS，JansenAP，NairR，et al.Anoveltransformationsuppressor，Pdcd4，inhibitsAP-1transactivationbutnotNF-kappaBorODCtransactivation〔J〕.Oncogene，2001;20：669-76.

9WangQ，SunZ.YangHS，et al.DownregulationoftumorsuppressorPdcd4promotesinvasionandactivatesbothβ-catenin/TcfandAP-1-dependenttranscriptionincoloncarcinomacells〔J〕.Oncogene，2008;27：1527-35.

10PalamarchukA，EfanovA，MaximovV，et al.Aktphosphorylatesandregulatespdcd4tumorsuppressorprotein〔J〕.CancerRes，2005;65：11282-6.

11AshishS，MohammadSB，KotaVR，et al.AldosereductaseinhibitionsuppressescoloncancercellviabilitybymodulatingmicroRNA-21mediatedprogrammedcelldeath4 (PDCD4)expression〔J〕.EurJCancer，2013;49：3311-9.

12FerraroA，KontosCK，BoniT，et al.EpigeneticregulationofmiR-21incolorectalcancer：ITGB4asanovelmiR-21targetandathree-genenetwork(miR-21-ITGΒ4-PDCD4)aspredictorofetastatictumorpotential〔J〕.Epigenetics，2014;9(1)：129-41.

13XieXD，ZhangYX，JiangYH，et al.SuppressivefunctionofRKTGonchemicalarcinogen-inducedskincarcinogenesisinmouse〔J〕.Carcinogenesis，2008;29(8)：1632-8.

14WangX，LiXB，F(xiàn)anFJ，et al.PAQR3playsasuppressiveroleinthetumorigenesisofcolorectalcancers〔J〕.Carcinogenesis，2012;33(11)：2228-35.

15陳創(chuàng)奇，方樂堃，馬晉平，等.結(jié)直腸癌2042例臨床病理特點(diǎn)及預(yù)后回歸分析〔J〕.中華醫(yī)學(xué)雜志，2010;9(26)：1804-7.

〔2015-03-17修回〕

(編輯徐杰)