復(fù)合誘變法篩選達(dá)托霉素高產(chǎn)菌株

（華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司微生物藥物國家工程研究中心河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心，河北石家莊050015）

達(dá)托霉素是具有獨(dú)特環(huán)狀結(jié)構(gòu)的脂肽類抗生素［1］，由玫瑰孢鏈霉菌（Streptomycesroseosporus）發(fā)酵產(chǎn)生，它能通過阻礙細(xì)菌細(xì)胞壁的生成和破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的功能等方式殺死細(xì)菌［2－3］，作用機(jī)制與傳統(tǒng)抗生素不同，故不易產(chǎn)生耐藥菌。達(dá)托霉素的抗菌譜與萬古霉素類似，且在體外對萬古霉素、甲氧西林、利奈唑烷等的耐藥菌也具有強(qiáng)烈活性，因此成為目前臨床上公認(rèn)的繼萬古霉素之后最理想的備用抗生素［4－9］。鑒于以上特殊優(yōu)勢，達(dá)托霉素的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，篩選適合工業(yè)化生產(chǎn)所需的高產(chǎn)菌株迫在眉睫。

復(fù)合誘變法是指在誘變育種中使用2種或2種以上的誘變方法處理菌株，以提高菌株的誘變效果［10］。作者在此采用氦氖（He－Ne）激光輻照－亞硝基胍（NTG）復(fù)合誘變達(dá)托霉素產(chǎn)生菌HK402，以期獲得高產(chǎn)且遺傳穩(wěn)定性好的達(dá)托霉素產(chǎn)生菌。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌株與儀器

玫瑰孢鏈霉菌（Sterptomycesroseosporus）HK402，由微生物藥物國家工程研究中心菌種保藏庫提供。

搖床，超凈工作臺，離心機(jī)，He－Ne－1000型氦氖激光儀。

1.2 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基：高氏1號培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基：糊精1%，葡萄糖0.5%，玉米漿0.5%，K2HPO4·3H2O 0.04%，MgSO4·7H2O 0.1%。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2%，淀粉1.3%，冷榨豆餅粉1.5%，蛋白胨1%，CaCO30.5%，MgSO4·7H2O 0.3%，前體0.8%。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：取生長好的斜面，用接種鏟挖塊1cm2左右接入種子瓶中，28 ℃、220r·min－1培養(yǎng)36h。

發(fā)酵培養(yǎng)：將搖瓶種子按4%的接種量接入250 mL裝量為40mL的發(fā)酵瓶中，28℃、220r·min－1培養(yǎng)118h。

1.3.2 誘變方法

1）單孢子菌懸液的制備

取生長好的成熟斜面，加入適量無菌生理鹽水，輕輕刮下孢子后將孢子液移入無菌玻璃珠瓶中充分振蕩打散，過濾后將孢子數(shù)調(diào)到106個·mL－1，待用。

2）亞硝基胍溶液的配制

在通風(fēng)櫥中稱取100mg 亞硝基胍于棕色容量瓶中，加入少量丙酮使其溶解，最后用乙醇定容至10 mL，使終濃度為10mg·mL－1，待用。

3）氦氖激光輻照誘變

取適量單孢子菌懸液于石英皿中進(jìn)行氦氖激光輻照，激光燈功率為18mW，照射距離為20cm，分別照射10min、20min、30min、40min、50min、60min；將處理過的菌懸液梯度稀釋后涂平板，28 ℃培養(yǎng)7d，待菌落成熟后計(jì)算致死率。挑選菌落形態(tài)好、孢子豐富的菌落傳斜面，進(jìn)行搖瓶初篩，并根據(jù)初篩結(jié)果計(jì)算正突變率。

4）亞硝基胍誘變

取適量單孢子菌懸液于10mL 無菌離心管中，分別用終濃度（mg·mL－1）為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2的亞硝基胍處理30min，離心，棄上清，用pH 值為6.5的磷酸緩沖溶液洗滌菌體3次以終止反應(yīng)，最后用無菌生理鹽水梯度稀釋涂平板，待菌落成熟后計(jì)算致死率。挑選生長健壯、孢子豐富的菌落傳斜面，進(jìn)行搖瓶初篩，并根據(jù)初篩結(jié)果計(jì)算正突變率。

5）氦氖激光輻照－亞硝基胍復(fù)合誘變

在最佳誘變劑量下復(fù)合處理出發(fā)菌株HK402，將處理后的單孢子菌懸液梯度稀釋后涂平板，進(jìn)行菌落初篩和搖瓶初篩，根據(jù)初篩結(jié)果計(jì)算致死率和正突變率。

1.3.3 計(jì)算與檢測方法

1）致死率和正突變率的計(jì)算

2）發(fā)酵單位的測定

采用HPLC法［11］測定發(fā)酵單位。

2 結(jié)果與討論

2.1 氦氖激光輻照誘變篩選達(dá)托霉素高產(chǎn)菌株

將HK402的無菌菌懸液用氦氖激光輻照不同時(shí)間后，計(jì)算致死率和正突變率，結(jié)果見表1。

表1 氦氖激光輻照不同時(shí)間后的致死率和正突變率／%Tab.1 Death rate and positive mutation rate after irradiating different time by He－Ne laser／%

由表1可知：隨著氦氖激光輻照時(shí)間的延長，菌株的致死率逐漸升高；在輻照40min時(shí)菌株的致死率達(dá)到78.2%，此時(shí)正突變率最高，為25.3%；繼續(xù)延長輻照時(shí)間，菌株的致死率趨于平穩(wěn)，但正突變率逐漸降低。因此，氦氖激光輻照誘變時(shí)間以40min為宜。

出發(fā)菌株HK402 經(jīng)氦氖激光輻照不同時(shí)間后，篩選得到了發(fā)酵單位比出發(fā)菌株提高10%的正突變菌株共68株，其中有7株為誘變40min的菌株，其發(fā)酵單位較出發(fā)菌株高20%以上，菌株14－8－102發(fā)酵單位最高，比出發(fā)菌株高25%。

2.2 亞硝基胍誘變篩選達(dá)托霉素高產(chǎn)菌株

將HK402的無菌菌懸液用不同濃度的亞硝基胍溶液處理后，計(jì)算致死率和正突變率，結(jié)果見圖1。

圖1 不同濃度亞硝基胍誘變后的致死率和正突變率Fig.1 Death rate and positive mutation rate after mutated by different concentrations of NTG

由圖1可知：隨著亞硝基胍濃度的增大，菌株的致死率逐漸升高；在亞硝基胍濃度為0.8mg·mL－1時(shí)菌株的致死率達(dá)到75.5%，此時(shí)正突變率最高，為28.1%；繼續(xù)增大亞硝基胍濃度至1.2mg·mL－1時(shí)，菌株的致死率接近100%，正突變率卻降低到5.3%。因此，亞硝基胍誘變濃度以0.8mg·mL－1為宜。

HK402經(jīng)亞硝基胍誘變后，從0.8mg·mL－1劑量組中篩選到了發(fā)酵單位最高的菌株14－9－196，比出發(fā)菌株高19%。

2.3 氦氖激光輻照－亞硝基胍復(fù)合誘變篩選達(dá)托霉素高產(chǎn)菌株

用氦氖激光輻照和0.8mg·mL－1的亞硝基胍溶液復(fù)合處理出發(fā)菌株HK402，氦氖激光輻照時(shí)間為40min，亞硝酸胍處理時(shí)間為30 min，篩選得到了10株高產(chǎn)菌株，結(jié)果見圖2。

由圖2可見，復(fù)合誘變得到的高產(chǎn)菌株14－10－98的發(fā)酵單位最高，比出發(fā)菌株HK402高35%，比單用氦氖激光輻照誘變得到的高產(chǎn)菌株14－8－102高8%，比單用亞硝基胍誘變得到的高產(chǎn)菌株14－9－196高13%。

圖2 氦氖激光輻照－亞硝基胍復(fù)合誘變結(jié)果Fig.2 Results of complex mutagenesis of He－Ne laser irradiation and NTG

2.4 高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性考察

將誘變高產(chǎn)菌株進(jìn)行傳代實(shí)驗(yàn)，以出發(fā)菌株HK402為對照（發(fā)酵單位以100計(jì)），考察其遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果見圖3。

圖3 高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性Fig.3 Genetic stability of the high producing strains

由圖3可見：單一誘變得到的高產(chǎn)菌株14－8－102和14－9－106的遺傳穩(wěn)定性都不好，發(fā)酵單位從2代斜面開始就發(fā)生回落，傳代4次以上菌株的高產(chǎn)特性基本消失；而復(fù)合誘變得到的高產(chǎn)菌株14－10－98在斜面?zhèn)鞔?次的遺傳穩(wěn)定性仍然較好，是一株已具備上罐條件的高產(chǎn)菌株。

3 結(jié)論

用氦氖激光輻照和亞硝基胍誘變達(dá)托霉素產(chǎn)生菌HK402，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用氦氖激光輻照誘變得到的高產(chǎn)菌株14－8－102的發(fā)酵單位比出發(fā)菌株高25%；單獨(dú)使用亞硝基胍誘變得到的高產(chǎn)菌株14－9－196的發(fā)酵單位比出發(fā)菌株高19%；采用氦氖激光輻照－亞硝基胍復(fù)合誘變得到的高產(chǎn)菌株14－10－98的發(fā)酵單位比出發(fā)菌株高35%。采用氦氖激光輻照－亞硝基胍復(fù)合誘變較單一誘變的效果好，而且高產(chǎn)菌株傳代5代后遺傳穩(wěn)定性良好。

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