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    核酸適配體修飾的納米脂質(zhì)體的制備及靶向毒性研究

    2015-12-28 05:42:52
    化學(xué)與生物工程 2015年8期
    關(guān)鍵詞:載藥阿霉素脂質(zhì)體

    (蘇州百拓生物技術(shù)服務(wù)有限公司,江蘇蘇州215123)

    近年來,癌癥的靶向治療顯示了巨大的應(yīng)用前景。靶向治療分為被動(dòng)靶向和主動(dòng)靶向,被動(dòng)靶向主要是利用腫瘤新生血管通透性比普通血管高,納米載體容易從這些部位滲漏到腫瘤部位,從而實(shí)現(xiàn)腫瘤部位的藥物富集作用;主動(dòng)靶向是在納米載體的表面修飾一段能特異識(shí)別腫瘤細(xì)胞的抗體、肽、小分子等,使藥物載體能特異識(shí)別并殺傷癌細(xì)胞[1]。脂質(zhì)體是所有載體中應(yīng)用最成功的,而且許多抗癌小分子脂質(zhì)體藥物(如吉西他濱、阿霉素、紫杉醇、順鉑、喜樹堿等)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化[2],但還存在著在體液環(huán)境中不穩(wěn)定、藥物未到達(dá)腫瘤部位就突然釋放、腫瘤部位藥物富集量少等缺點(diǎn)。為此,需要對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行進(jìn)一步的修飾,抗體、肽、小分子等可作為細(xì)胞靶向識(shí)別配體修飾在脂質(zhì)體上,以提高藥物載體的特異識(shí)別能力。抗體通常對(duì)配體有很高的親和力,但會(huì)引起很強(qiáng)的免疫反應(yīng);肽合成容易,不會(huì)引起很強(qiáng)的免疫反應(yīng),但易被體內(nèi)的酶降解[3];葉酸、乳糖酸等小分子雖然價(jià)格便宜,體內(nèi)也穩(wěn)定,但沒有很強(qiáng)的靶向性[4-6]。聚乙二醇修飾能大大延長(zhǎng)脂質(zhì)體的血液循環(huán)時(shí)間、避免內(nèi)皮系統(tǒng)的清除作用、提高藥物在腫瘤部位的富集[7]。

    適配體(aptamer)因獨(dú)特的生物學(xué)特性已成為靶向治療的熱點(diǎn)。核酸適配體是短的DNA 或RNA 片段,一般由12~30個(gè)堿基構(gòu)成,能特異識(shí)別目標(biāo)分子,而且合成容易、修飾簡(jiǎn)單、儲(chǔ)存和運(yùn)輸方便,在癌癥診療中顯示了巨大的應(yīng)用前景,越來越多的研究用核酸適配體修飾脂質(zhì)體,以進(jìn)一步提高脂質(zhì)體的治療效果[8-12]。美國(guó)FDA 已于2004年批準(zhǔn)了針對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的核酸適配體Pegaptanib用于老年眼睛黃斑病變的治療[13]。核酸適配體AS1411是一段26個(gè)核苷酸的單鏈DNA 片段,富含鳥嘌呤,具有非常緊湊的結(jié)構(gòu)和獨(dú)特的生物學(xué)特性,能抵抗血液核酸酶的降解,能以很高的親和力結(jié)合在癌細(xì)胞表面高表達(dá)核素蛋白(nucleolin),是第一個(gè)FDA 批準(zhǔn)用于各種癌癥臨床治療試驗(yàn)的適配體,Antisoma公司已完成了腎癌和急性髓性白血?。╝cute myeloid leukemia,AmL)的二期(phaseⅡa)臨床研究,取得了不錯(cuò)的臨床效果,現(xiàn)正等待審批進(jìn)行下一期(phaseⅡb)臨床研究[14-15]。

    鑒于此,作者利用DSPE-PEG2000和核酸適配體修飾的DSPE-PEG5000(DSPE-PEG5000-Aptamer)自組裝構(gòu)建靶向載藥體系(納米脂質(zhì)體),使修飾的核酸適配體充分暴露在載體表面,發(fā)揮識(shí)別細(xì)胞受體的作用,從而提高靶向性;并用乳腺癌細(xì)胞MCF-7(表面高表達(dá)核素蛋白)[16]檢測(cè)該載藥體系的靶向毒性。

    1 實(shí)驗(yàn)

    1.1 材料與儀器

    DSPE-PEG2000(Mw2 700Da)、DSPE-PEG5000-COOH(Mw5 700Da),NanocsInc;1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS),Sigma-Aldrich;核酸適配體AS1411(100 μmol·mL-1),序列為FAM-5′-(GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG)-3′-NH2,5′端進(jìn)行了FAM 熒光基團(tuán)修飾,3′端進(jìn)行了氨基修飾,由上海生工生物工程股份有限公司合成;鹽酸阿霉素(DOX,Mw579Da),上海生工生物工程股份有限公司;人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、非洲綠猴腎細(xì)胞Vero,自行保存;1640培養(yǎng)基、小牛血清,Gibco。

    透析袋,Spectrum;WST 細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒,碧云天;流式檢測(cè)凋亡試劑盒Annexin-VFLUOS,Roche;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海申勝;探頭式超聲儀,寧波新芝;動(dòng)態(tài)光散射儀,Malvern;熒光顯微鏡,Leica;FC-500型流式細(xì)胞儀,Beckman Coulter。

    1.2 DSPE-PEG5000-Aptamer的合成

    DSPE-PEG5000-COOH 通過EDC 交聯(lián),與核酸適配體AS1411反應(yīng),通過氨基和羧基形成酰胺鍵,從而把AS1411交聯(lián)到DSPE-PEG5000-COOH 上,形成DSPE-PEG5000-Aptamer。合成路線如圖1所示。

    圖1 DSPE-PEG5000-Aptamer的合成路線Fig.1 Synthetic route of DSPE-PEG5000-Aptamer

    具體過程:按DSPE-PEG5000-COOH∶AS1411∶EDC∶NHS=1∶1∶5∶1(物質(zhì)的量比,下同)的比例取11.4 mg(2 μmol·L-1)的DSPE-PEG5000-COOH 溶于10mL PBS溶液(pH 值7.4,50mmol·L-1)中,加入10μmol·L-1的EDC,磁力攪拌0.5h,然后加入2μmol·L-1的NHS和AS1411,25 ℃反應(yīng)16h后將反應(yīng)物裝入透析袋(截留分子量10 000)透析24h,除去未反應(yīng)的物質(zhì),即得DSPE-PEG5000-Aptamer。將合成的 DSPE-PEG5000-Aptamer 用15%的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)檢測(cè),上樣量15 μL,再用凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)檢測(cè)。

    1.3 納米脂質(zhì)體載藥體系的構(gòu)建

    先用10mL氯仿溶解54 mg(20μmol·L-1)的DSPE-PEG2000,抽真空狀態(tài)下55 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)4h,使其在瓶壁上形成脂膜;然后按DSPE-PEG2000∶DSPE-PEG5000-Aptamer∶鹽酸阿霉素=20∶1∶4的比例取5 mL PBS 溶液溶解的DSPE-PEG5000-Aptamer(0.2μmol·L-1),加入2.4 mg(4μmol·L-1)鹽酸阿霉素,充分混勻后加入已成干膜的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中;維持真空0.05MPa、溫度55℃、轉(zhuǎn)速180r·min-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)2h,使脂膜完全溶解在PBS溶液中,形成微紅的乳液;乳液用超聲儀冰浴超聲(功率200 W,探頭直徑2mm,超聲5s,間隔20s,共超聲10次)后用250nm 的濾膜過濾,即得納米脂質(zhì)體。合成路線如圖2所示。

    圖2 納米脂質(zhì)體載藥體系的構(gòu)建及細(xì)胞靶向識(shí)別示意圖Fig.2 Construction of liposome nanocarrier target drug delivery system and scheme of targeted cells recognization

    由于DSPE-PEG5000的分子量大,組裝完成后可以使Aptamer充分暴露在載體表面,有利于和細(xì)胞表面的受體結(jié)合,通過受體介導(dǎo)的方式進(jìn)入細(xì)胞而發(fā)揮藥效。

    用動(dòng)態(tài)光散射儀檢測(cè)納米脂質(zhì)體粒徑分布。產(chǎn)物進(jìn)行透析,收集透析液,按下式計(jì)算包封率:

    1.4 載藥體系對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的靶向毒性

    用MCF-7細(xì)胞檢測(cè)載藥體系的靶向毒性,以非洲綠猴腎細(xì)胞Vero為對(duì)照。將細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板中,待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)板70%左右,用PBS 溶液洗細(xì)胞3次,然后每孔加入無血清培養(yǎng)基100μL,培養(yǎng)2h,設(shè)計(jì)5個(gè)濃度梯度,每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。用于毒性實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞孔先吸出10μL、15μL、20μL、25μL 和50μL的培養(yǎng)液,再分別加入10μL、15μL、20μL、25 μL和50μL的藥物,使培養(yǎng)基的終體積為100μL,繼續(xù)培養(yǎng)4h。每孔加入10μL WST 溶液,37 ℃孵育2h,測(cè)定450nm 處吸光度。

    熒光顯微鏡檢測(cè)載藥體系進(jìn)入細(xì)胞的情況:細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板中,待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)板70%左右,吸出培養(yǎng)基,用PBS 溶液洗3 次,加入0.5 mL 新鮮的1640培養(yǎng)基,培養(yǎng)2h,加入20μL藥物孵育4h,用熒光顯微鏡觀察。

    流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況:待培養(yǎng)于6孔板的細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)板70%左右,加入40μL 藥物孵育4h,PBS溶液洗3次,胰酶消化,用1.5mL PBS溶液重懸,2 000r·min-1離心3min,用1mL PBS溶液重懸細(xì)胞,使細(xì)胞濃度為1.5×106個(gè)·mL-1,加入5μL的Annexin-V-FLUOS和5μL 的PI染色液,孵育20 min,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 DSPE-PEG5000-Aptamer的電泳圖譜

    由于Aptamer上帶有FAM 基團(tuán),紫外照射下能發(fā)黃綠色的光。因此,用15%PAGE 對(duì)DSPEPEG5000-Aptamer進(jìn)行電泳檢測(cè),結(jié)果見圖3。

    由圖3可看出,由于Aptamer的交聯(lián),使DSPEPEG5000在凝膠中遷移受到阻滯(泳道1),而游離的Aptamer在凝膠中遷移較快(泳道2)。表明Aptamer成功交聯(lián)到了DSPE-PEG5000上。

    2.2 納米脂質(zhì)體的粒徑分布及包封率

    用動(dòng)態(tài)光散射儀檢測(cè)納米脂質(zhì)體的粒徑分布,結(jié)果見圖4。

    圖3 DSPE-PEG5000-Aptamer的電泳圖譜Fig.3 Electrophorogram of DSPE-PEG5000-Aptamer

    圖4 納米脂質(zhì)體的粒徑分布Fig.4 Particalsize distribution of liposome nanocarrier

    由圖4 可看出,納米脂質(zhì)體的平均粒徑為130 nm。

    以鹽酸阿霉素濃度(c)為橫坐標(biāo)、OD550(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5),擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:A=0.01337c+0.0014,R2=0.99964。

    圖5 鹽酸阿霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of doxorubicin hydrochloride

    將納米脂質(zhì)體用透析袋透析后,收集透析液,測(cè)得550nm(鹽酸阿霉素的最大吸收波長(zhǎng))處吸光度為0.095,由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得鹽酸阿霉素濃度為7μg·mL-1,即透析液體系(100 mL)的鹽酸阿霉素含量為700μg(0.7mg),據(jù)此計(jì)算包封率為70.8%。進(jìn)一步算得載藥體系中鹽酸阿霉素的濃度為0.34 mg·mL-1。

    2.3 載藥體系進(jìn)入細(xì)胞的情況(圖6)

    圖6 載藥體系在乳腺癌細(xì)胞MCF-7(a、b)及正常細(xì)胞Vero(c、d)中的熒光顯微照片F(xiàn)ig.6 Fluorescence microscopy of drug delivery system in breast cancer cell MCF-7(a,b)and normal cell Vero(c,d)

    由圖6可看出,在乳腺癌細(xì)胞MCF-7(圖6a、b)中有較強(qiáng)的黃綠熒光(FAM)和紅色熒光(DOX),而在正常細(xì)胞Vero(圖6c、d)中只能見到微弱的熒光,說明構(gòu)建的載藥體系對(duì)癌細(xì)胞有較強(qiáng)的靶向選擇性。

    2.4 細(xì)胞的凋亡情況

    凋亡試劑Annexin-V-FLUOS主要針對(duì)細(xì)胞膜的磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine,PS),PS在細(xì)胞死亡和凋亡時(shí)從膜內(nèi)外翻到膜外,與Annexin-V-FLUOS結(jié)合后發(fā)綠光,流式檢測(cè)時(shí)為FL1綠光通道(激發(fā)波長(zhǎng)488nm,發(fā)射波長(zhǎng)533nm);PI不能通過正常和早期凋亡的細(xì)胞膜,但是晚期和死亡的細(xì)胞由于膜受體破壞,PI能通過膜并與細(xì)胞核結(jié)合,發(fā)出紅光,流式檢測(cè)時(shí)為FL2紅光通道(激發(fā)波長(zhǎng)535nm,發(fā)射波長(zhǎng)615nm)。

    細(xì)胞經(jīng)藥物和凋亡試劑盒處理后,進(jìn)行流式檢測(cè),結(jié)果見圖7。

    圖7 乳腺癌細(xì)胞MCF-7(a)和正常細(xì)胞Vero(b)的凋亡情況Fig.7 Apoptosis of breast cancer cell MCF-7(a)and normal cell Vero(b)

    由圖7 可知,Vero 細(xì)胞經(jīng)過藥物處理4h 后,95.9%的細(xì)胞處于正常細(xì)胞象限E3,而乳腺癌細(xì)胞MCF-7的正常細(xì)胞降低到31.4%(A3象限),死亡細(xì)胞(A1 象限)為50.3%,死亡和凋亡的細(xì)胞(A2)為15.1%。

    2.5 藥物的細(xì)胞毒性

    用WST 檢測(cè)藥物對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7 和正常細(xì)胞Vero的毒性,結(jié)果見圖8。

    由圖8可知,藥物對(duì)Vero細(xì)胞活性的影響較小,隨著藥物濃度的增加,細(xì)胞活性下降得比較緩慢;藥物對(duì)MCF-7細(xì)胞活性影響較大,當(dāng)藥物濃度從6.8μg·mL-1(20μL)增加到8.5μg·mL-1(25μL)時(shí),細(xì)胞活性急劇下降;當(dāng)藥物濃度繼續(xù)增加到17μg·mL-1(50μL)時(shí),細(xì)胞活性沒有繼續(xù)下降。表明8.5 μg·mL-1的鹽酸阿霉素可以使一個(gè)6孔板的細(xì)胞(約1.5×106個(gè))發(fā)生凋亡。

    圖8 藥物對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7和正常細(xì)胞Vero的毒性Fig.8 Drug cytotoxicity on breast cancer cell MCF-7and normal cell Vero

    3 結(jié)論

    通過核酸適配體修飾,利用聚乙二醇化的DSPE自組裝構(gòu)建了納米脂質(zhì)體靶向載藥體系,并進(jìn)行了載藥體系的靶向毒性研究,納米脂質(zhì)體的平均粒徑為130nm,對(duì)鹽酸阿霉素藥物的包封率為70.8%。組裝材料中DSPE-PEG5000的PEG 鏈比DSPE-PEG2000的長(zhǎng),可以使適配體充分暴露在載體表面,利于和癌細(xì)胞結(jié)合。載體具有體內(nèi)被動(dòng)靶向作用,即可以通過血液循環(huán)滲漏進(jìn)入細(xì)胞間隙比較大的腫瘤新生血管,從而提高藥物在腫瘤組織的富集濃度。另外,適配體的修飾進(jìn)一步提高了載體對(duì)乳腺癌細(xì)胞的主動(dòng)靶向性,提高了載體進(jìn)入乳腺癌細(xì)胞的能力。研究表明,構(gòu)建的載藥體系對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7具有較好的靶向性,所使用的DSPE是FDA 已批準(zhǔn)進(jìn)入臨床的材料,可以加快臨床研究的轉(zhuǎn)化,為開發(fā)乳腺癌的臨床靶向治療藥物奠定了基礎(chǔ)。

    [1]SVENSON S.Clinical translation of nanomedicines[J].Current Opinion in Solid State and Materials Science,2012,16(6):287-294.

    [2]WAGNER A,PLATZGUMMER M,KREISMAYR G,et al.GMP Production of liposomes-A new industrial approach[J].Journal of Liposome Research,2006,16(3):311-319.

    [3]JIN E L,ZHANG B,SUN X R,et al.Acid-active cell-penetrating peptides forinvivotumor-targeted drug delivery[J].J Am Chem Soc,2013,135(2):933-940.

    [4]GUO W J,LEE T,SUDIMACK J,et al.Receptor-specific delivery of liposomesviafolate-PEG-chol[J].Journal of Liposome Research,2000,10(2-3):179-195.

    [5]ZHAO X,LI H,LEE R J.Targeted drug deliveryviafolate receptors[J].Expert Opin Drug Deliv,2008,5(3):309-319.

    [6]LU Y J,LOW P S.Folate-mediated delivery of macromolecular anticancer therapeutic agents[J].Advanced Drug Delivery Reviews,2002,54(5):675-693.

    [7]MURA S,BUI D T,COUVREUR P,et al.Lipid prodrug nanocar-riers in cancer therapy[J].Journal of Controlled Release,2015,208:25-41.

    [8]XING H,TANG L,YANG X,et al.Selective delivery of an anticancer drug with aptamer-functionalized liposomes to breast cancer cellsinvitroandinvivo[J].J Mater Chem B.Mater Biol Med,2013,1(39):5288-5297.

    [9]LI L,HOU J,LIU X,et al.Nucleolin-targeting liposomes guided by aptamer AS1411for the delivery of siRNA for the treatment of malignant melanomas[J].Biomaterials,2014,35(12):3840-3850.

    [10]CAO Z,TONG R,MISHRA A,et al.Reversible cell-specific drug delivery with aptamer-functionalized liposomes[J].Angew Chem Int Ed,2009,48(35):6494-6498.

    [11]KANG H,O′DONGOGHUE M B,LIU H,et al.A liposomebased nanostructure for aptamer directed delivery[J].Chem Commun,2010,46(2):249-251.

    [12]ZHOU J H,ROSSI J J.Cell-specific aptamer-mediated targeted drug delivery[J].Oligonucleotides,2011,21(1):1-10.

    [13]SUNDAEAM P,KURNIAWAN H,BYRNE M,et al.Therapeutic RNA aptamers in clinical trials[J].European Journal of Pharmaceutical Sciences,2013,48(1-2):259-271.

    [14]RIZZIERI D,STOCKERL-GOLDSTEIN A,WEI A,et al.Longterm outcomes of responders in a randomized,controlled phaseⅡtrial of aptamer AS1411in AmL[R].American Society of Clinical Oncology,2010,28:6557.

    [15]ROSENBERG J E,DRABKIN H A,LARA P,et al.A phaseⅡ,single-arm study of AS1411in metastatic renal cell carcinoma(RCC)[R].American Society of Clinical Oncology,2010,28:4590.

    [16]SOUNDARARGJAN S,CHEN W,SPICER E K,et al.The nucleolin targeting aptamer AS1411destabilizes Bcl-2 messenger RNA in human breast cancer cells[J].Cancer Research,2008,68(7):2358-2365.

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