多菌種混合制曲提高麥曲品質(zhì)*

余培斌，張波，陸健，陳建新

1(江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝及技術(shù)國家工程實驗室，江蘇無錫，214122)

2(江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫，214122)3(浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江杭州，310018)

麥曲是以小麥為原料，經(jīng)過粉碎、加水、拌和、成型、堆放，在一定的溫度和濕度的環(huán)境條件下，富集培養(yǎng)釀酒有益微生物而制成的糖化發(fā)酵劑。在工廠的實際生產(chǎn)中，根據(jù)制曲工藝的不同，將黃酒麥曲分為生麥曲和熟麥曲。生麥曲根據(jù)生料成型過程是通過機械還是人工又分為手工曲和機制曲。生麥曲接種方式為自然接種，由于生麥曲網(wǎng)羅了自然界的多種微生物，形成了特定的微生物群落，多種微生物相互作用，代謝產(chǎn)物豐富，所釀成酒口味醇厚，香氣較濃。但生麥曲由于是自然培養(yǎng)，主要產(chǎn)酶微生物生長較弱，曲中主要酶類酶活都較低，在實際生產(chǎn)中用量較大，且釀造過程中發(fā)酵緩慢，殘?zhí)歉?，后續(xù)處理時，壓榨困難［1］，同時生麥曲的制曲時間長且受季節(jié)限制，這些缺陷都嚴(yán)重制約著黃酒的規(guī)?；a(chǎn)。20世紀(jì)60年代初浙江的一些黃酒廠為達(dá)到提高出酒率，節(jié)約糧食，降低成本的目的，同時也為適應(yīng)黃酒機械化的要求，開始推廣應(yīng)用熟麥曲。熟麥曲是將小麥蒸熟殺死原料中的大多數(shù)微生物，接種純種的米曲霉蘇-16進(jìn)行培養(yǎng)，制曲過程中利用通風(fēng)機供給空氣，調(diào)節(jié)溫、濕度，促使米曲霉在較厚的曲料上生長繁殖并大量積累代謝產(chǎn)物，熟麥曲培養(yǎng)條件可人為控制，制曲時間較短僅需44 h左右，且麥曲的液化力、糖化力、蛋白質(zhì)分解力遠(yuǎn)高于生麥曲。在黃酒釀造過程中，能夠縮短發(fā)酵周期，提高原料利用率，但由于菌種較為單一，酶系簡單，微生物有益代謝產(chǎn)物較少，熟麥曲釀成的黃酒會產(chǎn)生一股特殊的熟麥味，口感較淡薄，香氣較差，對黃酒的質(zhì)量有一些影響。

為了結(jié)合生麥曲和傳統(tǒng)熟麥曲的優(yōu)勢，將生物強化技術(shù)應(yīng)用于黃酒熟麥曲的制作過程中，通過傳統(tǒng)的生物學(xué)手段從黃酒麥曲及黃酒廠環(huán)境中篩選影響麥曲品質(zhì)的主要微生物，多菌種混合制作黃酒熟麥曲。一方面，它可以大大提高水解酶(主要為α-淀粉酶，糖化酶，蛋白酶)的酶活，彌補傳統(tǒng)生麥曲糖化力弱，用量大的缺陷;另一方面，多菌種混合麥曲，由于菌種多樣，較傳統(tǒng)熟麥曲代謝產(chǎn)物豐富，形成大量的風(fēng)味前體物質(zhì)，可緩解傳統(tǒng)熟麥曲菌種單一，所釀黃酒口味寡淡，雜味較重的狀況。因此，多菌種制作黃酒熟麥曲，對于黃酒行業(yè)提高原料利用率和生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，同時保證黃酒質(zhì)量具有重要的實際意義。

在前期的研究中［2］，作者從酒廠環(huán)境中分離得到1株米曲霉(編號真菌ZW12)，與米曲霉蘇-16混合接種制備了強化曲，并優(yōu)化了制曲條件，在提高酶活方面有較好的效果，但在改善黃酒風(fēng)味方面效果欠佳。本文以酒廠環(huán)境中分離得到的細(xì)菌入手，篩選優(yōu)良的制曲菌株，采用細(xì)菌與真菌混合接種制備強化曲，并探討其對黃酒釀造的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基

1.1.1.1 斜面培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基:取去皮馬鈴薯200 g，切塊，加1 000 mL蒸餾水，煮沸20 min后紗布過濾，補加蒸餾水至1 000 mL，加葡萄糖20 g，瓊脂20 g，pH 自然。

LB培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，酵母膏10，NaCl 5，瓊脂20，pH自然。

1.1.1.2 初篩培養(yǎng)基

產(chǎn)淀粉酶微生物初篩培養(yǎng)基(g/L):可溶性淀粉3，蛋白胨10，牛肉膏3 ～5，NaCl 5，瓊脂20，pH 7.2 ～7.4。

產(chǎn)蛋白酶微生物初篩培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏5，蛋白胨 10，NaCl 5，脫脂奶粉 3，瓊脂 20，pH 7.0 ～7.2。

1.1.2 原料與試劑

(1)粉碎小麥由紹興某黃酒廠制曲車間提供，麩皮購自無錫三里橋農(nóng)貿(mào)市場。初篩菌株從紹興某黃酒廠環(huán)境中分離得到，由實驗室保藏。

(2)試劑:3，5-二硝基水楊酸、福林試劑、淀粉、三氯乙酸、酪素、Na2CO3、瓊脂粉等均為分析純，甲酸己酯、乙醚、戊烷為色譜純，購自上海國藥化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 高產(chǎn)淀粉酶及蛋白酶微生物的篩選

(1)初篩:取9 cm滅菌過的培養(yǎng)皿，每個加入初篩培養(yǎng)基20 mL，將原有保藏的菌種點植法接種到培養(yǎng)皿中，每皿點種5株細(xì)菌，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3 d，觀察并定期測量菌落周圍水解透明圈大小。

(2)復(fù)篩:根據(jù)初篩結(jié)果，從平板中挑選透明圈明顯的菌株制作種子培養(yǎng)液，做純種熟麥曲，以糖化酶、α-淀粉酶、酸性蛋白酶酶活為篩選指標(biāo)，挑選酶活最高者作為目標(biāo)菌株。

1.2.2 菌種鑒定

(1)菌株形態(tài)鑒定:根據(jù)伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊進(jìn)行分類鑒定。

(2)細(xì)菌16S rDNA基因測序分析:細(xì)菌總DNA的提取采用試劑盒，PCR等擴(kuò)增引物，PCR反應(yīng)體系和程序，產(chǎn)物割膠回收，16S rDNA分子的回收，T-A克隆等試驗的具體方法及操作參考文獻(xiàn)［3］。最后將比對正確的單陽性克隆子送上海生工測序，測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行Blast序列比對，找出對應(yīng)序列的種屬信息。

1.2.3 制曲菌種的制備

(1)真菌菌種的接種使用孢子懸浮液，制備方法為:將活化后菌種的分生孢子用無菌水洗入三角瓶中，在超凈臺上四層擦鏡紙過濾，旋渦振蕩均勻，血球計數(shù)板計數(shù)，孢子濃度調(diào)為107個/mL。接種量以孢子懸浮液體積與原料質(zhì)量比值計算(v/w)。

(2)細(xì)菌菌種的接種使用液體種子培養(yǎng)液，培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，細(xì)菌生長曲線的繪制參照文獻(xiàn)［4］進(jìn)行。接種量以細(xì)菌培養(yǎng)液體積與原料質(zhì)量比值計算(v/w)。

1.2.4 純種熟麥曲制曲工藝流程

參照某黃酒企業(yè)生產(chǎn)實際而定。

具體制曲工藝要點見參考文獻(xiàn)［5］。

1.2.5 麥曲粗酶液制備

參照文獻(xiàn)［2］

1.2.6 麥曲酶活的測定及定義

酶活的測定方法參照文獻(xiàn)［2］，酶活的定義為:

(1)糖化酶酶活定義:1 g干曲經(jīng)緩沖液提取后的粗酶液，在40℃ pH 4.6條件下，1 h分解可溶性淀粉產(chǎn)生1 mg葡萄糖為1個酶活單位(U/g)。

(2)α-淀粉酶酶活定義:1 g干曲經(jīng)緩沖液提取后的粗酶液，在60℃pH 4.6條件下，每分鐘分解淀粉產(chǎn)生1 mg麥芽糖為1個酶活單位(U/g)。

(3)蛋白酶酶活定義:1 g干曲經(jīng)緩沖液提取后的粗酶液，在40℃條件下1 min水解酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸為1個酶活單位(U/g)。

1.2.7 氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)定量分析黃酒香氣物質(zhì)

(1)樣品前處理方法:取50 mL酒樣加入5 g NaCl使其飽和，加入50 μL內(nèi)標(biāo)溶液(L-薄荷醇質(zhì)量濃度為192.50 μg/L、丙酸辛酯質(zhì)量濃度為398.5 μg/L、甲酸己酯質(zhì)量濃度為378.34 μg/L)混勻，然后用50 mL萃取劑［V(乙醚)∶V(戊烷)=2∶1］萃取3次，分別為20、15、15 mL，然后將50 mL萃取液用氮氣溫和吹掃濃縮到10 mL左右。

(2)GC-MS 條件:參照文獻(xiàn)［6］。

1.2.8 黃酒理化指標(biāo)的測定

參照 GB/T 13662-2008［7］。

1.3 麥曲培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.3.1 細(xì)菌與真菌混合制取接種方法

通過借鑒在多菌種混合發(fā)酵飼料領(lǐng)域采用的細(xì)菌滯后接種方法，經(jīng)過前期的摸索和實踐，確定混合接種方法為:真菌菌種先接入培養(yǎng)，濕度設(shè)定在較高水平，一段時間后接入細(xì)菌，將濕度降低，升溫至一定溫度培養(yǎng)一段時間后放入45℃烘干出曲。

1.3.2 單因素實驗方法

(1)細(xì)菌菌種添加時間的確定:將篩選得到的細(xì)菌菌種使用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，根據(jù)細(xì)菌生長曲線及計數(shù)結(jié)果調(diào)節(jié)OD值，使菌懸液濃度為107個/mL，參照文獻(xiàn)［2］中優(yōu)化的真菌制曲條件，接入真菌開始制曲，真菌培養(yǎng)(20，24，28，32，36，40，44，48 h)后接入細(xì)菌菌種，接種量最初設(shè)定為1%，細(xì)菌接入后調(diào)整培養(yǎng)溫度至37℃，濕度80%。48 h后出曲烘干，測定麥曲酶活，確定細(xì)菌菌種的最佳接入時間。

(2)細(xì)菌接入后培養(yǎng)溫度的確定:在(1)單因素的基礎(chǔ)上，研究培養(yǎng)溫度對混合菌種產(chǎn)酶的影響，細(xì)菌接入后，將制曲溫度設(shè)定為 30，31，32，33，34，35，36，37℃，接種量1%，濕度80%。48 h后出曲烘干，測定麥曲酶活，確定細(xì)菌與真菌混合培養(yǎng)的最佳溫度。

(3)細(xì)菌菌種接種量的確定:在前兩個單因素的基礎(chǔ)上，確定細(xì)菌菌種的接種量，接種量分別取1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%，研究細(xì)菌接種量對麥曲酶活的影響，確定真菌與細(xì)菌混合培養(yǎng)中細(xì)菌菌種的最佳接種量。

1.3.3 均勻設(shè)計優(yōu)化細(xì)菌與真菌混合制曲條件

選定對真菌和細(xì)菌混合制曲產(chǎn)酶影響較大的3個因素:培養(yǎng)溫度、細(xì)菌接種量、細(xì)菌接入時間作為試驗因素，每個因素設(shè)定8個水平，按照DPS 9.5軟件的試驗設(shè)計功能確定的3因素8水平混合水平均勻設(shè)計方案進(jìn)行試驗，設(shè)置2個平行樣品，取平均值。

1.4 小型黃酒釀造工藝

浸米:28℃保溫條件下浸米3 d。

蒸飯:上汽后蒸25 min左右，無生心，用潮濕的手摸飯不粘手即可。

酒母制備:取實驗室保藏黃酒速釀酵母斜面1支，接入1 mL液體麥汁培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，轉(zhuǎn)移到裝有9 mL麥汁培養(yǎng)基的試管進(jìn)行二級活化，培養(yǎng)過夜后轉(zhuǎn)移到裝有90 mL麥汁培養(yǎng)基的三角瓶培養(yǎng)過夜進(jìn)行三級活化，接種用三級種子液。

拌曲:飯冷卻至室溫，拌曲接種(配方質(zhì)量比:糯米∶水為1∶1.7，麥曲為糯米量的15%，速釀酒母為糯米量的11.4%)。

發(fā)酵:30℃主酵3～4 d，每天攪拌2次;12 h稱重1次，記錄數(shù)據(jù)。15℃后酵20 d，每2～3 d稱量1次，記錄數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)淀粉酶及蛋白酶細(xì)菌菌種的篩選

出發(fā)菌株為2010～2012年間從紹興某黃酒廠環(huán)境中分離得到的127株細(xì)菌，經(jīng)平板初篩得到產(chǎn)酶能力較強菌株18株。

將初篩得到的18株細(xì)菌制純種熟麥曲，培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)時間為48 h，溫度37℃，濕度95%，接種量4%，培養(yǎng)過程中需要間歇性搖晃。培養(yǎng)結(jié)束后，45℃烘干10 h出曲，測定3種主要水解酶類酶活，進(jìn)行復(fù)篩。得產(chǎn)酶能力較強菌株5株，編號分別為:MRS8G，MRS12，A49，D19，D38。5 株細(xì)菌的產(chǎn)酶能力見表1。

表1 不同細(xì)菌菌株酶活比較Table 1 Comparison of enzyme activities of different bacteria

2.2 細(xì)菌菌株的分子鑒定

使用Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，以基因組DNA為模板，采用細(xì)菌通用引物27F和1492R擴(kuò)增序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證無誤后，割膠回收，TakaRa試劑盒回收DNA分子，T-A克隆，挑取陽性克隆子，PCR驗證無誤后送上海生工有限公司測序。所測的序列代入GeneBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，得到的相似序列的登陸號、菌株名稱及相似性見表2?？梢钥闯?，5株細(xì)菌的序列比對相似性都達(dá)到了99%及以上，因此可以確定MRS8G，MRS12，A49為解淀粉芽孢桿菌;D38，D19為枯草芽孢桿菌。

表2 復(fù)篩細(xì)菌分子鑒定結(jié)果Table 2 Molecule genetics test of bacteria

從表2中可以發(fā)現(xiàn)，復(fù)篩得到的細(xì)菌主要為芽孢桿菌?？莶菅挎邨U菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、抗菌素等物質(zhì)。在工業(yè)生產(chǎn)中，是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生產(chǎn)菌，解淀粉芽孢桿菌是一種與枯草芽孢桿菌親緣性很高的細(xì)菌，在產(chǎn)酶方面與枯草芽孢桿菌十分相似，產(chǎn)淀粉酶能力較強。

2.3 制曲細(xì)菌菌種的確定

按照1.3.1中確定的細(xì)菌與真菌混合接種方法，在真菌接入后不同時間點(24，28，32，36，40，44 h)分別接入細(xì)菌菌種，接種量1%，細(xì)菌接入后，將溫度升高至37℃培養(yǎng)，總制曲時間到達(dá)48 h后，開始烘干，水分含量降到25%以下出曲，測定主要水解酶酶活，通過比較確定用于制曲的細(xì)菌菌種，結(jié)果如圖1所示。

圖1 各時間點添加不同細(xì)菌麥曲酶活比較Fig.1 Comparison of enzyme activities of different bacteria in different time points

總體比較添加解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌后麥曲樣品的酶活，可以發(fā)現(xiàn)前者效果比后者好。同時在制曲過程中發(fā)現(xiàn):①添加枯草芽孢桿菌后麥曲樣品會產(chǎn)生一種較難聞的氣味，添加的時間越早，這種氣味越重，嚴(yán)重影響麥曲的感官品評;雖然添加解淀粉芽孢桿菌的麥曲樣品也會產(chǎn)生少許氣味，相比而言要弱得多，只要添加的時間控制準(zhǔn)確，這種氣味對麥曲曲香影響不大。②添加枯草芽孢桿菌發(fā)酵一段時間后，曲料會嚴(yán)重發(fā)黏、結(jié)團(tuán)，影響通氣性，對真菌菌種生長不利。綜合考慮選取解淀粉芽孢桿菌作為制曲菌種。

2.4 真菌與細(xì)菌混合制曲培養(yǎng)條件優(yōu)化

在DPS 9.5系統(tǒng)中，輸入因子數(shù)和水平數(shù)，設(shè)定DPS系統(tǒng)隨機優(yōu)化過程的最大迭代次數(shù)和尋優(yōu)運行時間(min)，進(jìn)行均勻試驗設(shè)計并利用系統(tǒng)自帶的優(yōu)化均勻設(shè)計對已得的均勻設(shè)計表進(jìn)行優(yōu)化(表3)。

表3 3因素8水平均勻試驗設(shè)計方案Table 3 Table of uniform design(U8(83))

試驗方案的中心化偏差CD=0.102 4，為了降低均勻試驗設(shè)計的中心化偏差，更好地建立回歸模型，將試驗次數(shù)設(shè)定為水平數(shù)的2倍，即16次試驗，采用DPS 9.5系統(tǒng)中的混合水平均勻試驗設(shè)計制作均勻設(shè)計表并優(yōu)化，試驗方案的中心化偏差CD=0.078 4，通過預(yù)實驗確定因素的高低水平值，輸入均勻設(shè)計表中生成試驗方案，按照試驗方案試驗，結(jié)果如表4。

表4 3因素8水平混合水平均勻試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 4 Table of mixed level uniform experimental design and result(U16(83))

分別以糖化酶酶活、α-淀粉酶酶活、酸性蛋白酶酶活為考察對象，對均勻設(shè)計試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行二次逐步回歸擬合分析，獲得對3個考察因素的多元回歸方程。

(1)以糖化酶酶活為考察對象，對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項式逐步回歸分析。得回歸方程為:

對模型進(jìn)行顯著性檢驗，結(jié)果如表5。

表5 對糖化酶回歸方程的顯著性分析Table 5 Analyses of significance of regress equtation about glucoamylase

其中，相關(guān)系數(shù)R=0.973 7，F(xiàn)值=12.22，顯著水平P=0.003 2，方程顯著，說明該方程能很好地擬合出各因素對糖化酶酶活的影響，對方程取一階偏導(dǎo)值，得到糖化酶酶活最高時的制曲條件，即:培養(yǎng)溫度36℃，細(xì)菌接種量3.5%，細(xì)菌接入時間為36 h，預(yù)測糖化酶最優(yōu)結(jié)果1 428.06 U/g。

(2)以α-淀粉酶為考察對象，得回歸方程:

對模型進(jìn)行顯著性檢驗，其中:相關(guān)系數(shù)R=0.977 1，F(xiàn) 值 =14.03，顯著水平 P=0.002 2，方程顯著，說明該方程能很好地擬合出各因素對α-淀粉酶酶活的影響，對方程取一階偏導(dǎo)值，得到α-淀粉酶酶活最高時的制曲條件，即:培養(yǎng)溫度36℃，細(xì)菌接種量3.5%，細(xì)菌接入時間為36 h，預(yù)測α-淀粉酶最優(yōu)結(jié)果15.5 U/g。

(3)以酸性蛋白酶為考察對象，得回歸方程為:

對模型進(jìn)行顯著性檢驗，其中:相關(guān)系數(shù)R=0.964 5，F(xiàn) 值 =8.89，顯著水平 P=0.007 5，方程顯著，說明方程能很好地擬合出各因素對酸性蛋白酶酶活的影響，對方程取一階偏導(dǎo)值，得到酸性蛋白酶酶活最高時的制曲條件，即:培養(yǎng)溫度35℃，細(xì)菌接種量4%，細(xì)菌接入時間為28 h，預(yù)測酸性蛋白酶最優(yōu)結(jié)果656.27 U/g。

對回歸模型進(jìn)行驗證:制曲條件為培養(yǎng)溫度36℃，細(xì)菌接種量3.5%，細(xì)菌接入時間為36 h，試驗重復(fù)3次，取平均值。糖化酶、α-淀粉酶、酸性蛋白酶酶活分別為1 425.95、14.45、427.88 U/g。與模型預(yù)測吻合較好，表明模型能夠較好地預(yù)測試驗結(jié)果。

2.5 強化麥曲與普通麥曲的比較

2.5.1 酶活力的比較

對于黃酒工廠來說，麥曲的理化指標(biāo)反映的是麥曲作為粗酶制劑在黃酒釀造過程中轉(zhuǎn)化淀粉質(zhì)原料和蛋白質(zhì)原料的能力，在實驗室的檢測過程中主要測定麥曲糖化酶、α-淀粉酶和酸性蛋白酶酶活來反映轉(zhuǎn)化能力的大小。測定的樣品分別為紹興某酒廠的手工生麥曲、機制生麥曲、米曲霉蘇-16純種熟麥曲(熟麥曲1)、米曲霉蘇-16與米曲霉ZW12混合熟麥曲(熟麥曲2)、以及細(xì)菌與真菌混合熟麥曲(熟麥曲3)。結(jié)果如圖2所示。

圖2 幾種麥曲樣品3種主要酶活的比較Fig.2 Comparison of enzyme activities of different wheat Qu

從圖2可見，與生麥曲相比，熟麥曲糖化酶活提高不是特別明顯，只提高15%左右，而液化型淀粉酶即α-淀粉酶有了顯著提高，提高了150%，這是由于小麥原料對酶活的影響。小麥中雖沒有α-淀粉酶，卻存在豐富的 β-淀粉酶［8］，β-淀粉酶能夠水解 α-1.4-糖苷鍵，從淀粉鏈非還原性端開始，依次切下一個麥芽糖分子，所以小麥本身存在一定的糖化酶酶活。麥芽、甘薯、大豆粕中β-淀粉酶的最適作用溫度為60～65℃，鈍化溫度為70℃［9］，甘薯與小麥中的β-淀粉酶為同一類。生麥曲制曲過程中溫度最高不會超過55℃，β-淀粉酶在這樣的溫度下比較穩(wěn)定，而且生麥曲在制曲過程中水分較低，在低水分下酶不易失活，使β-淀粉酶得到保存。周恒剛［10］在研究生麩曲糖化酶酶活比熟麩曲高的原因時認(rèn)為與麩皮中β-淀粉酶部分保存有關(guān)。這也從另一個方面說明了生麥曲中β-淀粉酶的存在，β-淀粉酶在某種程度上豐富了生麥曲酶系組成，這也可能是使用生麥曲能生產(chǎn)出質(zhì)量較好黃酒的原因之一。

比較生麥曲和熟麥曲產(chǎn)酸性蛋白酶能力，熟麥曲酸性蛋白酶有很大的提高，這是因為:熟麥曲為熟料接種，人工培養(yǎng)，強化了微生物的生長優(yōu)勢，產(chǎn)酸性蛋白酶的真菌能夠大量繁殖并產(chǎn)酶。比較幾種熟麥曲的產(chǎn)酶能力可以發(fā)現(xiàn):隨著制曲微生物的增加，3種酶酶活都有不同幅度提高，特別是能夠影響黃酒風(fēng)味前體物質(zhì)形成的酸性蛋白酶提高最為明顯，從而表明多菌種混合接種的熟麥曲較單一菌種的熟麥曲更利于黃酒品質(zhì)的提高。

2.5.2 發(fā)酵結(jié)束后黃酒理化指標(biāo)檢測

表5是發(fā)酵結(jié)束后，添加5種麥曲樣品所釀黃酒的幾項主要指標(biāo)，根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 13662-2008)中對黃酒的分類，試驗釀造的5種黃酒均屬于傳統(tǒng)型干黃酒，5種麥曲釀造的黃酒中除熟麥曲1，2，3中pH值略高于標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的3.5～4.6外，基本各項指標(biāo)均符合國家標(biāo)準(zhǔn)，其中3種熟麥曲所釀的黃酒中α-氨基態(tài)氮含量約為國標(biāo)定義的優(yōu)級干黃酒標(biāo)準(zhǔn)(≥0.5)的4倍，分析原因為:一方面，熟麥曲本身短肽含量和游離氨基酸含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于生麥曲，隨著麥曲的添加進(jìn)入酒體中;另一方面，熟麥曲酶活高，釀造過程中原料糖化較徹底，促進(jìn)了酵母的大量繁殖，后期酵母自溶也會產(chǎn)生大量α-氨基態(tài)氮。

表5 不同麥曲對黃酒釀造的影響Table 5 The influence of different wheat Qu in rice wine brewing

研究發(fā)現(xiàn)，與米曲霉蘇-16純種熟麥曲相比，細(xì)菌與真菌混合熟麥曲酒精度相對提高17.4%，具有很高的潛在應(yīng)用價值。

2.5.3 黃酒風(fēng)味物質(zhì)檢測

通過GC-MS定量試驗對添加不同麥曲黃酒樣品中揮發(fā)性香氣化合物進(jìn)行定量分析，檢測出的香氣化合物主要為醇類、酯類、脂肪酸、芳香族化合物、此外還有部分酚類及其衍生物、酯化合物、硫化物等。

圖3列出了添加不同麥曲釀造所得黃酒樣品中揮發(fā)性物質(zhì)總含量情況。添加手工曲釀造的黃酒中揮發(fā)性化合物含量最高，達(dá)到122 423.62 μg/L，分析原因為:手工曲為生料，小麥原料本身也含有較多的香氣成分，比較添加幾種熟麥曲的黃酒樣品中揮發(fā)性化合物含量，發(fā)現(xiàn)隨著麥曲中接入菌種的增多，所釀造的黃酒中揮發(fā)性化合物總量也不斷增加，并且增加部分主要為酸類化合物，是由于熟麥曲3中酶活較高，釀造過程中糖化、液化速度較快，使得酵母較快完成發(fā)酵過程而衰老，抑制雜菌能力減退，后期產(chǎn)酸細(xì)菌大量繁殖，酸類化合物合成增多。

圖3 不同黃酒樣品揮發(fā)性香氣成分總含量Fig.3 Amount of volatiles quantified in different rice wine

在測定出的揮發(fā)性化合物中，含量最多的物質(zhì)是乙酸和苯乙醇，他們對黃酒香氣的形成有比較重要的貢獻(xiàn)，熟麥曲1釀造的黃酒中未檢測到苯乙醇。從化合物種類上看，醇類、酸類和酯類化合物是含量較多的3類化合物，特別是揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)不僅含量豐富并且數(shù)量也較多，包括乙酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸辛酯、甲氧基乙酸乙酯、苯乙酸酯、鄰氨基苯甲酸肉桂酯等10幾種，幾種麥曲樣品釀造的黃酒樣品相比而言，熟麥曲1和熟麥曲2酒樣中酯類化合物種類和含量都少于熟麥曲3和手工曲酒樣。酸類化合物中乙酸和異丁酸在幾種酒樣中普遍存在，但相比而言熟麥曲3酒樣中含量和數(shù)量都較多，還包括甲氧基乙酸、N-乙酰胞壁酸、乙酰氧基乙酸、D-絲氨酸等多種其他酸類。總體來說，熟麥曲3釀造的黃酒中香氣物質(zhì)明顯增多，較接近手工曲釀造的黃酒，但是香氣物質(zhì)較集中，實際生產(chǎn)中要控制好麥曲用量，平衡好發(fā)酵速度，才能保證較好的黃酒質(zhì)量。

3 結(jié)論

(1)對從酒廠環(huán)境中分離得到的細(xì)菌進(jìn)行篩選，獲得了5株產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶能力較強的菌株，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定，主要為芽孢桿菌屬微生物。

(2)均勻設(shè)計優(yōu)化細(xì)菌與真菌混合制曲條件為:培養(yǎng)溫度36℃，真菌與細(xì)菌接種量分別為5.5%和3.5%，細(xì)菌接入時間為真菌菌種培養(yǎng)36 h后，接入細(xì)菌后強化麥曲3種主要水解酶酶活較米曲霉蘇-16純種熟麥曲分別提高了38.6%，106%，100%。

(3)將強化后的麥曲應(yīng)用于黃酒釀造，實驗結(jié)果顯示:強化麥曲能夠加快黃酒釀造速度，縮短主酵時間，原料利用較徹底，酒精度相對提高17.4%，提高了原料利用率。由于強化麥曲屬于細(xì)菌與真菌混合接種，彌補了單一菌種熟麥曲的劣勢，黃酒樣品指標(biāo)測試結(jié)果表明:強化麥曲所釀造的黃酒中氨基態(tài)氮含量大量增加，是生麥曲釀造的黃酒樣品的7倍，同時黃酒樣品中揮發(fā)性物質(zhì)總含量也有所增加，與單一菌種熟麥曲相比，更有助于保持黃酒風(fēng)味。

［1］ 壽泉洪.生麥曲和熟麥曲在黃酒生產(chǎn)中的應(yīng)用研究［D］.無錫:江南大學(xué)，2006:12-18.

［2］ 余培斌，陳亮亮，張波，等.雙菌種制曲改善黃酒麥曲品質(zhì)的研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38(9):1-6.

［3］ 張中華.紹興黃酒麥曲中微生物群落結(jié)構(gòu)的研究［D］.無錫:江南大學(xué)，2012:10-16.

［4］ 王剛.微生物發(fā)酵改善菜籽粕品質(zhì)的初步研究［D］.無錫:江南大學(xué)，2011:3-15.

［5］ 謝廣發(fā).黃酒釀造技術(shù)［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社2010:51-54.

［6］ 羅濤，范文來，徐巖，等.我國江浙滬黃酒中特征揮發(fā)性物質(zhì)香氣活力研究［J］.中國釀造，2009(2):14-18.

［7］ GB/T 13662-2000.黃酒［S］.

［8］ 釀酒編輯部.白酒生產(chǎn)技術(shù)［J］.釀酒增刊，1982.

［9］ 顧國賢.釀造酒工藝學(xué)［M］.第2版.北京:中國輕工業(yè)出版社，2007:454-517.

［10］ 周恒剛.根霉漫談［J］.釀酒科技，1993(3):7-11.