18°P高濃釀造抗葡萄糖阻遏效應(yīng)啤酒酵母的選育

郭立蕓

1(北京燕京啤酒股份有限公司技術(shù)中心，北京，101300)2(燕京啤酒釀造技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，101300)

啤酒高濃釀造(very high gravity，VHG)是指在啤酒釀造過(guò)程中糖化得到較高濃度的麥芽汁(15～18°P)，在發(fā)酵以后的工序中再用含CO2的脫氧水稀釋到正常濃度(10～12°P)的釀造技術(shù)。高濃釀造后稀釋技術(shù)，可以在投資和運(yùn)行成本降低的情況下，增加產(chǎn)量20%～40%，實(shí)現(xiàn)高濃釀造有著顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益［1］。但是由于VHG麥汁中存在更高濃度的可發(fā)酵性糖，導(dǎo)致發(fā)酵初期酵母細(xì)胞承受更高的滲透壓并且在發(fā)酵后期承受更高的乙醇毒性［2］。這些環(huán)境壓力在很大程度上限制了啤酒的發(fā)酵速度，酵母活性也明顯降低，同樣也降低了酵母的再次發(fā)酵活性(即酵母的重復(fù)利用)［3］，通過(guò)定向馴化選育耐高濃度的優(yōu)良啤酒酵母可克服VHG釀造的劣勢(shì)。

啤酒發(fā)酵過(guò)程中，當(dāng)麥汁中含有葡萄糖濃度高于0.2% ～0.5% 時(shí)，會(huì)限制酵母對(duì)麥芽糖的利用，只有低于此濃度限制才會(huì)解除［4］，但會(huì)降低酵母吸收利用麥芽糖和麥芽三糖的速率，造成發(fā)酵遲緩。而在超高濃發(fā)酵的麥汁中往往添加一定比例的啤酒糖漿，葡萄糖濃度會(huì)明顯提高，阻遏效應(yīng)加劇，最終出現(xiàn)發(fā)酵不徹底等現(xiàn)象。因此，如果對(duì)酵母進(jìn)行特定的篩選，使其能夠在較高葡萄糖濃度下提高對(duì)麥芽糖的利用速率，就可以在超高濃條件下提高發(fā)酵速度，縮短發(fā)酵時(shí)間，最終改善啤酒的品質(zhì)［5-7］。2-脫氧-D-葡萄糖(2-DG)是葡萄糖的結(jié)構(gòu)類似物，酵母吸收后不能利用，卻可以對(duì)酵母產(chǎn)生葡萄糖阻遏效應(yīng)且不能解除［8］。因此，通過(guò)在以麥芽糖為惟一碳源并添加有2-DG的培養(yǎng)基中可實(shí)現(xiàn)抗葡萄糖阻遏酵母菌株的篩選。

本研究首先從燕京12°P釀酒酵母菌株出發(fā)，通過(guò)定向自然選育獲得18°P耐超高濃釀造菌株，在此基礎(chǔ)上，將18°P高濃酵母菌株在添加2-DG抑制劑的酵母浸膏蛋白胨平板上梯度培養(yǎng)、抗性平板分離初篩以及復(fù)篩，使這些突變株表現(xiàn)出耐受較高的滲透壓和酒精的能力，并適用于高濃釀造的抗葡萄糖阻遏效應(yīng)的啤酒酵母菌株，并將該菌株進(jìn)行100 L微釀啤酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，以期獲得1株高濃釀造抗葡萄糖阻遏效應(yīng)啤酒酵母。

1 材料與方法

1.1 材料

(1)實(shí)驗(yàn)用菌株:12°P燕京釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株YJ0002，由燕京集團(tuán)科研中心提供。

(2)實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)):A-18°P高濃釀造定向馴化培養(yǎng)基:由14°P冷麥汁加糖漿調(diào)濃制成，保藏用固體培養(yǎng)基加入2%瓊脂粉制成;B-濃度梯度培養(yǎng)基:由18°P和25°P麥汁添加2%瓊脂，先將25°P培養(yǎng)基鋪入微傾放置的培養(yǎng)皿內(nèi)，使鋪好的培養(yǎng)基在培養(yǎng)皿內(nèi)一側(cè)成15°角，待凝固后水平放置培養(yǎng)皿，再將18°P培養(yǎng)基鋪入，直到培養(yǎng)基表面水平為止;C-酵母浸膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(YPM):酵母浸出物1%，蛋白胨2%，1%麥芽糖，0.05%的2-DG，2%瓊脂。

1.2 主要儀器設(shè)備

高效氣相色譜儀，美國(guó)Agilent6890型;啤酒檢測(cè)儀，奧地利Anton paar DMA4500型;酸度計(jì)，意大利哈納PH211型;色度計(jì)，德國(guó)DRLANGE;顯微鏡，日本OLYMPUS CX-41型;分光光度計(jì)，日本島津UV-2550;恒溫水浴鍋，美國(guó)Polyscience;水浴振蕩器，哈東聯(lián)HZS-H型;生化培養(yǎng)箱，日本三洋MIR254上海一恒LRH250;全溫振蕩器，哈東聯(lián)HZQ-Q型;酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-rad model 550。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分析測(cè)定方法

雙乙酰、酒精度測(cè)定見(jiàn)《啤酒工業(yè)手冊(cè)》［9］;酵母死亡率測(cè)定采用亞甲基藍(lán)染色法［10］。

主要風(fēng)味物質(zhì)含量測(cè)定采用頂空氣相色譜法［11］;可發(fā)酵性糖測(cè)定采用高效液相色譜法［12］;AP酸化力測(cè)定見(jiàn)參考文獻(xiàn)［13］。

1.3.2 18°P超高濃釀造啤酒酵母的定向選育

1.3.2.1 18°P超高濃釀造啤酒酵母的馴化

將12°P燕京酵母YJ0002由斜面接入12°P無(wú)菌麥汁(25 mL)中，在25℃下150 r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(大約36 h)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌懸液培養(yǎng)液1 mL接種至18°P高濃馴化培養(yǎng)基中，并在25℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，重復(fù)上述操作進(jìn)行定向馴化，馴化至第11代。每代檢測(cè)對(duì)數(shù)期酵母細(xì)胞數(shù)和酵母細(xì)胞活性，確定性能良好代數(shù)的菌種，將菌種進(jìn)行斜面保存。

1.3.2.1 耐18°P超高濃釀造啤酒酵母的篩選

將上述性能良好代數(shù)酵母菌選取1 mL培養(yǎng)液連續(xù)梯度稀釋涂布至18°P麥汁固體培養(yǎng)基平板上，選取較大菌落。將大菌落挑取1環(huán)放在裝有10 mL 18°P無(wú)菌麥汁的試管中，在25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。再將活化菌液進(jìn)行稀釋，將10-4菌液在18～20°P梯度平板上進(jìn)行涂布。于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。在高濃區(qū)選取生長(zhǎng)強(qiáng)壯的菌落，完成一次分離篩選。重復(fù)分離篩選10次，最后從高濃區(qū)選取生長(zhǎng)迅速?gòu)?qiáng)壯的菌株移接在18°P斜面中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 超高濃抗葡萄糖阻遏效應(yīng)酵母菌株的分離與篩選

1.3.3.1 抗葡萄糖阻遏效應(yīng)突變株的分離

將選育出的18°P高濃釀造菌株菌懸液涂布于添加有0.05%的2-DG的YPM平板中，25℃培養(yǎng)2～3 d。將長(zhǎng)出的菌落再在上述平板中劃線培養(yǎng)分離1次，找出單菌落進(jìn)行單菌落分離。同時(shí)接種10 mL液體試管進(jìn)行活化，采用梯度稀釋法分離單菌落。重復(fù)第3步，連續(xù)分離3代，選出最好菌落。

1.3.3.2 酒精耐受能力實(shí)驗(yàn)

按表1所列酒精濃度將馴化菌株菌懸液在每個(gè)濃度中接入0.1 mL，每個(gè)濃度做2個(gè)平行，于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，觀察杜氏管中產(chǎn)氣情況。

表1 酒精含量分配表Table 1 Alcohol content distribution table

1.3.3.3 高通量篩選

將抗葡萄糖阻遏效應(yīng)突變株活化24 h后接種0.2 mL到48孔板培養(yǎng)，然后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)其OD值，進(jìn)行高通量篩選。

1.3.4 100 L微釀發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

將分離得到的抗葡萄糖阻遏效應(yīng)的啤酒酵母菌株進(jìn)行三角瓶發(fā)酵選育后，進(jìn)行100 L微釀實(shí)驗(yàn)。將挑選的最優(yōu)菌和出發(fā)菌進(jìn)行100 L啤酒小型發(fā)酵，麥汁濃度18.2°P，發(fā)酵溫度為(14±0.5)℃，接種酵母濃度為(20±5)×106個(gè)/mL。跟蹤檢測(cè)雙乙酰、酒精度、降糖情況、酵母數(shù)的變化。發(fā)酵結(jié)束后檢測(cè)發(fā)酵度、pH值、總酸、苦味質(zhì)、AP值、風(fēng)味物質(zhì)等相關(guān)發(fā)酵指標(biāo)。

2 結(jié)果與討論

2.1 18°P超高濃釀造啤酒酵母的定向選育結(jié)果

2.1.1 酵母細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果

以燕京12°P釀酒酵母(S.cerevisiae)YJ0002為對(duì)照菌株，經(jīng)11代傳代定向馴化后，分別編記為 C1～C11傳代后，其在對(duì)數(shù)期酵母細(xì)胞數(shù)和酵母細(xì)胞活性見(jiàn)圖1。

圖1 18°P高濃釀造馴化各代數(shù)酵母細(xì)胞數(shù)(對(duì)數(shù)期)和細(xì)胞活性(AP)值Fig.1 The yeast count and acid power of C0-C11 under the very high gravity brewing

由圖1可知，馴化代數(shù)C1-C4階段，對(duì)數(shù)期酵母數(shù)緩慢增長(zhǎng)，酵母細(xì)胞活性AP值略有增加，馴化代數(shù)C5-C8階段，對(duì)數(shù)期酵母數(shù)呈現(xiàn)基本穩(wěn)定趨勢(shì)，同時(shí)，酵母細(xì)胞活性基本穩(wěn)定，其中C8的酵母細(xì)胞數(shù)和酵母細(xì)胞活性表現(xiàn)良好。馴化代數(shù)C9-C11階段，酵母細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活性呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。因此選取馴化代數(shù)C8階段進(jìn)行梯度稀釋平板篩選。

2.1.2 定向馴化后的菌落及細(xì)胞形態(tài)

將經(jīng)過(guò)10次篩選后的C8代菌株挑取少量用無(wú)菌水進(jìn)行稀釋后，涂布于18°P麥汁培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)48 h后其菌落狀態(tài)和細(xì)胞狀態(tài)分別見(jiàn)圖2(稀釋10-4)。培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)馴化菌株較對(duì)照菌株菌落生長(zhǎng)快、菌落大。

圖2 對(duì)照菌株和馴化菌株菌落形態(tài)照片(培養(yǎng)48 h)Fig.2 The colony morphology photograph of control stain and experimental strain

圖2表明馴化菌株適合在18°P麥汁培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)，細(xì)胞在高滲透壓的條件下，仍保持很高的生理活性，菌落大而飽滿。而對(duì)照菌株則不適應(yīng)在此濃度下生長(zhǎng)。

從圖3可以看出，馴化過(guò)的酵母形態(tài)呈圓形，酵母形態(tài)飽滿正常，而對(duì)照菌株出現(xiàn)了大量形態(tài)異常的細(xì)胞。這表明未經(jīng)馴化的對(duì)照菌株對(duì)高滲透壓、高酒精環(huán)境表現(xiàn)出了極大的不適應(yīng)，高滲透壓與高酒精造成細(xì)胞變形。馴化后的菌株適應(yīng)高濃環(huán)境，形態(tài)未見(jiàn)異常。

圖3 對(duì)照菌株和馴化菌株細(xì)胞形態(tài)照片(40×10倍)Fig.3 The cellular morphology of control stain and experimental strain

2.2 超高濃抗葡萄糖阻遏效應(yīng)酵母菌株的分離與篩選結(jié)果

2.2.1 平板分離獲取抗葡萄糖阻遏效應(yīng)啤酒酵母

將上述分離馴化得到的C8代酵母菌株連續(xù)梯度稀釋涂布于添加有0.05%的2-DG的YPM平板中，在稀釋梯度10-6和10-7條件下獲得抗2-DG的高濃釀造的單菌落酵母，生長(zhǎng)情況如圖4所示。

圖4 YPM平板分離菌株培養(yǎng)照片(48 h)Fig.4 The Purification strain cultured on YPM culture medium

2.2.2 酒精耐受能力測(cè)試結(jié)果

將分離到的抗葡萄糖阻遏效應(yīng)的啤酒酵母進(jìn)行耐酒精實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)10 d后的結(jié)果如表2所示。

從表2可以看出，馴化后的菌株在酒精濃度(乙醇體積分?jǐn)?shù))為13%的試管中仍有氣泡產(chǎn)生，證明馴化菌株能夠耐受13%的酒精濃度，而對(duì)照菌株的耐酒精濃度為10%。因此得出，經(jīng)過(guò)馴化的菌株耐酒精能力能力提高了3%，最高可以耐受13%的酒精。

表2 耐酒精實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results for ethanol resistance experiment

2.2.3 高通量篩選結(jié)果

將馴化菌株分離培養(yǎng)得到2 545個(gè)菌株，將其接種48孔板發(fā)酵，測(cè)其生長(zhǎng)OD值。經(jīng)過(guò)逐級(jí)篩選獲得30株菌進(jìn)行量筒發(fā)酵(重復(fù)5次)，最終突變株G2和G9的降糖速度、乙醇生成、酵母增殖和死亡率表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定的突變性狀。

2.3 篩選菌株的發(fā)酵性能結(jié)果(100 L微釀)

2.3.1 酵母增殖、乙醇生成、發(fā)酵速率、雙乙酰檢測(cè)

在18°P高濃發(fā)酵過(guò)程中，對(duì)照菌株YJ0002和馴化菌株G2、G9的乙醇濃度、酵母增殖、雙乙酰還原和發(fā)酵速率隨時(shí)間的變化曲線如圖5～圖8所示。

圖5 酵母增殖曲線圖Fig.5 Yeast proliferation curve

圖6 發(fā)酵速率曲線圖Fig.6 Fermentation rate

圖7 酒精生成曲線圖Fig.7 The curve for ethanol production

從圖5～圖8可以看出:在18°P發(fā)酵過(guò)程中，酵母數(shù)的變化反應(yīng)了酵母在超高濃麥汁中的生長(zhǎng)與繁殖情況，對(duì)糖的利用率和最終的發(fā)酵度都有不可忽視的作用。馴化菌株酵母峰值明顯高于對(duì)照菌株。與對(duì)照菌株YJ0002相比，馴化菌株G2和G9表現(xiàn)出更快的發(fā)酵速率，發(fā)酵速率(發(fā)酵初期)分別提高了10.96%和15.11%，G2和G9菌株在發(fā)酵的第9天殘?zhí)菨舛冗_(dá)到4.5°P和4.46°P，較之于對(duì)照菌株發(fā)酵11d殘?zhí)菨舛?.61°P，分別縮短發(fā)酵時(shí)間42 h和50 h，因此可以提高高濃釀造的生產(chǎn)效率。發(fā)酵初期酒精的生成速率分別比對(duì)照菌株增加了10.52%和14.24%，雙乙酰是反映啤酒成熟度的指標(biāo)，G2菌株和G9菌株的雙乙酰峰值高于對(duì)照菌株，這是由于G2和G9酵母數(shù)的增殖倍數(shù)比出發(fā)菌株大，導(dǎo)致雙乙酰前驅(qū)物大量合成的結(jié)果，與對(duì)照菌株相比，G2和G9菌株雙乙酰還原時(shí)間分別提前38 h和50 h。酵母數(shù)的變化反映了酵母在超高濃麥汁中的生長(zhǎng)與繁殖情況，對(duì)糖的利用率和最終的發(fā)酵度都有不可忽視的作用。馴化菌株酵母明顯高于對(duì)照菌株。

圖8 雙乙酰還原曲線圖Fig.8 The curve for reduction of diacetyl

2.3.2 AP值的檢測(cè)結(jié)果

酸化力(AP)法被認(rèn)為是評(píng)估酵母活性的有效方法之一［12］。AP值大小與酵母的發(fā)酵活性相關(guān)，特別是在極端環(huán)境下用來(lái)評(píng)價(jià)酵母活性。發(fā)酵結(jié)束后收集酵母泥檢測(cè)馴化菌株的AP值如圖9所示。

圖9 18°P發(fā)酵結(jié)束后 YJ0002、G2、G9的 AP值圖Fig.9 The acid power of YJ0002，G2，G9 after fermentation

從圖9可以看出，馴化菌株G2和G9的AP值均比對(duì)照菌株YJ0002高，這一結(jié)果表明G2和G9在傳代發(fā)酵過(guò)程中可以保持較高的活性。

2.3.3 風(fēng)味物質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果

在18°P發(fā)酵結(jié)束后對(duì)照菌株YJ0002和馴化菌株G2、G9的啤酒風(fēng)味物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 啤酒風(fēng)味物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果 (單位:mg/L)Table 3 The results of flavor compound detection

從表3可以看出，相對(duì)于對(duì)照菌株 YJ0002，隨著麥汁濃度增加乙酸乙酯濃度顯著增加，高級(jí)醇濃度顯著降低，破壞了啤酒的風(fēng)味協(xié)調(diào)性。這一結(jié)果與Piddocke等人［14］的研究結(jié)論相同。啤酒中的酯含量不能過(guò)高或過(guò)低，酯含量過(guò)高會(huì)有異常的香氣，過(guò)低又會(huì)使啤酒寡淡無(wú)味。因此啤酒中的酯含量要適當(dāng)。

在18°P發(fā)酵過(guò)程中，突變株G2和G9發(fā)酵的啤酒表現(xiàn)出較低濃度的總酯和適宜濃度的總高級(jí)醇。并且G2和 G9生產(chǎn)的VHG啤酒的口感較 YJ0002有了顯著的改善。G2和G9生成的啤酒具有更加協(xié)調(diào)醇香和果味。馴化菌株G2和G9乙醛含量低于出發(fā)菌株，這表明馴化菌株對(duì)乙醛的還原能力強(qiáng)于出發(fā)菌株。啤酒中的乙醛含量過(guò)高會(huì)有生青味，因此要求菌株對(duì)乙醛的還原能力越強(qiáng)越好。

2.3.4 常規(guī)理化指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果

發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液的pH、總酸、苦味質(zhì)、酒精度和真實(shí)發(fā)酵度檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 理化指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果Table 4 The chemical index result after fermentation

馴化后的菌株G2和G9發(fā)酵液的發(fā)酵度比對(duì)照菌株提高了6%和7%，其他指標(biāo)基本與對(duì)照菌株YJ0002相近，基本上保持了對(duì)照菌株的優(yōu)良性狀。

2.3.5 感官品評(píng)

將高濃發(fā)酵酒稀釋到10°P，組建由國(guó)家級(jí)品酒師2人、國(guó)家啤酒評(píng)委3人、公司級(jí)品酒師2人的品評(píng)小組，將小組平均成績(jī)記為樣品感官評(píng)價(jià)結(jié)果。對(duì)啤酒樣品進(jìn)行感官特征、感官質(zhì)量評(píng)價(jià)，表5為感官品評(píng)結(jié)果。

表5 感官品評(píng)結(jié)果Table 5 The rusults of sensory evaluation

從感官指標(biāo)品評(píng)結(jié)果來(lái)看，菌株YJ0002有臭酵母味，而馴化菌株則G2和G9沒(méi)有。這是因?yàn)樵诤蠼推诮湍杆劳雎蔬^(guò)高，酵母自溶所造成。

3 結(jié)論

本研究以釀酒酵母 YJ0002為出發(fā)菌株對(duì)其進(jìn)行18°P定向馴化后，在添加2-DG的YPM分離抗葡萄糖阻遏效應(yīng)酵母突變株，采用高通量進(jìn)行初篩復(fù)篩，并進(jìn)行微釀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。定向傳代培養(yǎng)后C8代酵母表現(xiàn)出較好的酵母增殖和AP活性，分離得到的抗阻遏效應(yīng)酵母突變株菌生長(zhǎng)迅速，細(xì)胞在高滲透壓的條件下，仍保持很高的生理活性，菌落大而飽滿。經(jīng)高通量篩選獲得的G2和G9兩株菌，在100L微釀發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵速率、酵母增殖、風(fēng)味物質(zhì)較出發(fā)菌株有了明顯改善。

(1)分離得到的抗葡萄糖阻遏效應(yīng)的超高濃啤酒酵母菌株最高可耐受13%的酒精濃度。

(2)突變株G2和G9的發(fā)酵初期的酒精生成速率分別比初始菌株YJ0002提高10.52%和14.24%。

(3)突變株G2和G9發(fā)酵速率(發(fā)酵初期)分別提高了10.96%和15.11%，分別縮短發(fā)酵時(shí)間42 h和50 h，發(fā)酵度分別提高了6%和7%。

(4)在發(fā)酵結(jié)束時(shí)突變株G2和G9的AP值較初始菌株YJ0002高，酵母細(xì)胞活性增加。

(5)相對(duì)于初始菌株YJ0002，在VHG條件下，突變株G2和G9生產(chǎn)的啤酒表現(xiàn)出較低濃度的乙酸乙酯和適宜濃度的高級(jí)醇，且G2和G9生成VHG啤酒的口感較YJ0002有了顯著的改善。感官品評(píng)G2和G9酵母菌株產(chǎn)酒風(fēng)味:酯香較明顯;YJ0002有輕微酵母臭。

［1］ 任海波.超高濃釀造技術(shù)研究及其在啤酒生產(chǎn)中的應(yīng)用［D］.烏魯木齊:新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

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