丙型肝炎病毒1a、1b 和2a 型 E1E2原核質(zhì)粒的構(gòu)建和序列分析

丙型肝炎病毒1a、1b和2a型E1E2原核質(zhì)粒的構(gòu)建和序列分析

胥冰黃峰霍慧春1

(陜西中醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)系免疫及檢驗(yàn)教研室，陜西咸陽(yáng)712046)

摘要〔〕目的構(gòu)建陜西地方株丙型肝炎病毒(HCV)1a、1b和2a型包膜糖蛋白E1E2的原核質(zhì)粒并測(cè)序比對(duì)。方法采用逆轉(zhuǎn)錄-巢式聚合酶鏈反應(yīng)(RT- nest PCR)擴(kuò)增獲得HCV 1a、1b和2a型E1E2片段，與pMD-18 simple vector連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α，小量提取質(zhì)粒DNA并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與Gene bank中其他標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)以獲取同源性數(shù)據(jù)。同時(shí)重點(diǎn)分析E2蛋白高變區(qū)(HVR)1和2氨基酸序列。MEGA 4軟件繪制種系進(jìn)化樹(shù)圖。結(jié)果成功擴(kuò)增約2 kb的目的片段并構(gòu)建原核質(zhì)粒，測(cè)序結(jié)果正確。1b亞型E1E2的核苷酸和氨基酸序列的同源性最差。HCV E2的HVR1和2的序列比對(duì)顯示，同種基因亞型在HVR 1的變異性最大，而HVR 2的序列變異性不顯著。不同基因亞型的毒株在HVR 1和2的變異性極大，而1b亞型在HVR 1和2的變異性比1a和2a型突出。結(jié)論陜西地方株HCV 1b型E1E2區(qū)比1a和2a型更易發(fā)生突變，1b型E2的HVR變異性更顯著。

關(guān)鍵詞〔〕丙型肝炎病毒；包膜糖蛋白；基因型；序列分析

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R512.6〔

基金項(xiàng)目：陜西科學(xué)技術(shù)廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目資助(No.SJ08C232)

1陜西綏德名州鎮(zhèn)衛(wèi)生院

第一作者：胥冰(1968-)，女，碩士，副教授，主要從事中醫(yī)藥免疫學(xué)研究。

丙型肝炎主要是由丙型肝炎病毒(HCV)經(jīng)血液傳播引起的一種疾病，丙型肝炎所致肝硬化和肝癌以老年患者居多〔1〕。HCV為單股正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)約9.6 kb。由于HCV所依賴(lài)的RNA聚合酶缺乏校正功能，導(dǎo)致基因組在序列上表現(xiàn)出極大的異質(zhì)性，因此，依據(jù)序列同源性的差異，可將HCV區(qū)分為6種主要的基因型和不同的亞型。各種基因型和亞型的分布存在一定的地域差異，在我國(guó)以1型和2型為主〔2〕。在HCV基因組中，以包膜糖蛋白E1E2區(qū)的變異度最大，而E1E2在病毒吸附宿主細(xì)胞和保護(hù)性免疫方面具有重要作用〔3〕。本研究對(duì)陜西省HCV 1a、1b和2a型毒株的E1E2區(qū)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增并構(gòu)建原核質(zhì)粒，將E1E2測(cè)序結(jié)果與已發(fā)表的毒株進(jìn)行同源性比對(duì)分析。

1材料與方法

1.1質(zhì)粒、菌種和主要試劑DH5a感受態(tài)細(xì)菌由本校生化教研室制備。AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司)。LA Taq DNA聚合酶、pMD18-T Simple Vector和DNA Marker(Takara公司)。DNA凝膠純化和質(zhì)粒小量提取試劑盒(Axygen公司)。

1.2血標(biāo)本三份HCV血清取自陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院丙型肝炎患者，均為男性，年齡63～71歲。

1.3方法

1.3.1HCV RNA提取和cDNA合成采用異硫氰酸胍-酚-氯仿法從血清樣本中提取HCV RNA，全部RNA溶于10 μl DEPC水中。按照AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)，加入隨機(jī)引物及AMV逆轉(zhuǎn)錄酶于42 ℃水浴中逆轉(zhuǎn)錄60 min，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA保存于-20℃。

1.3.2HCV E1E2的引物及PCR擴(kuò)增以Gene Bank中HCV H77(1a)、HCV-J(1b)和JFH1(2a)株序列為模板，參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)擴(kuò)增E1E2 基因序列的引物，見(jiàn)表1。引物均由上海生物工程公司合成。

采用巢式PCR法，按照LA Taq DNA聚合酶說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。將4 μl cDNA加入PCR體系(LA Taq酶、DEPC水中，加入正向和反向的外引物共50 μl，第一輪PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 4 min；94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 3 min，35循環(huán)；72℃延伸10 min。取第一輪PCR產(chǎn)物5 μl加入50 μl體系中，加正向和反向的內(nèi)引物進(jìn)行第二輪PCR，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增終產(chǎn)物取3 μl于1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外成像儀觀察結(jié)果。

1.3.3原核質(zhì)粒的構(gòu)建凝膠純化HCV E1E2目的條帶，與pMD18-T Simple Vector進(jìn)行TA克隆連接，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)菌，涂布Amp + LB 平板中，37 ℃孵育過(guò)夜，挑取陽(yáng)性克隆，擴(kuò)增后小量提取并純化質(zhì)粒。純化后的質(zhì)粒DNA送上海生物工程公司測(cè)序鑒定。

1.3.4序列比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)分析將所獲得HCV1a、1b、2a型 E1E2的核苷酸序列及氨基酸序列分別與已報(bào)道的1a：H77(AF009606)、HC-J1(D10749)；1b：HCV-J(D90208)、HC-C2(D10934)；2a：JFH1(AB047639)、HC-J6(D00944)的E1E2序列進(jìn)行同源性比較。并且利用MEGA 4軟件繪制種系進(jìn)化樹(shù)。

表1HCV E1E2引物的序列及位置

引物極性位置(nt)序列(5'-3')1)長(zhǎng)度1a外引物S1-1/A1-1+/-42～61/2670～2689CCCCTGTGAGGAACTACTGTACCCACCTACCCTTCAGATA2648bp內(nèi)引物S1-2/A1-2+/-597～614/2641～2659TATGGCAATGAGGGTTGCCAGAAGAACACGAGGAAGG2063bp1b外引物S2-1/A2-1+/-74～92/2658～2676TGGCGTTAGTATGAGTGTTCCAGCCTGCCTTTGATGTA2603bp內(nèi)引物S2-2/A2-2+/-585～603/2631～2649TATGGCAACGAGGGTATGGCGCAGAAGAACACGAGGAA2065bp2a外引物S3-1/A3-1+/-85/2770～2786TGGCGTTAGTATGAGTGTCGGCGTCATAAGCATAAGCC2703bp內(nèi)引物S3-2/A3-2+/+721～739/2770～2786CCGACCTCATGGGGTACATGCGTCATAAGCATAAGCC2056bp

1)引物位置參考標(biāo)準(zhǔn)株：1a：HCV H77株；1b：HCV J株；2a：JFH1株

2結(jié)果

2.1逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果HCV1a、1b和2a亞型E1E2區(qū)段的RT-PCR產(chǎn)物全長(zhǎng)約為2 kb，圖1為擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖，條帶清晰，大小符合預(yù)期。

M:250 bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；N：陰性對(duì)照；WXR-1a、LSG-1b和ZKX-2a為不同HCV基因型標(biāo)本的陽(yáng)性結(jié)果 圖1　HCV E1E2擴(kuò)增終產(chǎn)物電泳圖

2.2HCV E1E2序列比對(duì)將E1E2測(cè)序序列上傳Gene Bank網(wǎng)站，與對(duì)應(yīng)的基因亞型序列進(jìn)行BLAST比對(duì)?？梢?jiàn)1b亞型的核苷酸和氨基酸序列的同源性最差。見(jiàn)表2。同時(shí)分析HCV E2的高變區(qū)(HVR)1和2的序列變異?？梢?jiàn)同種基因亞型在HVR 1的變異性最大，而HVR 2的序列變異性不顯著。不同基因亞型的毒株在HVR 1和HVR 2的變異性極大。1b亞型在HVR 1和HVR 2的變異性比1a和2a型突出。見(jiàn)圖2。

2.3HCV E1E2的種系進(jìn)化樹(shù)可見(jiàn)WXR、LSG、ZKX分別為1a、1b和2a亞型毒株。1a與1b亞型在種系進(jìn)化樹(shù)中距離較近，與2a亞型距離較遠(yuǎn)。見(jiàn)圖3。

表2同種亞型E1E2區(qū)核苷酸及氨基酸的同源性比較(%)

E1E2WXR-1aH77 HC-J1LSG-1bHCVJ HC-C2ZKX-2aJFH1 HC-J6核苷酸90.589.365.466.596.287.8氨基酸92.791.687.189.097.288.9

HVR1區(qū)HVR2區(qū)

圖2HVR序列比對(duì)

圖3HCV E1E2種系進(jìn)化樹(shù)3討論

HCV感染可造成急性、慢性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌等〔4〕。全球HCV的感染率約為3%。我國(guó)抗-HCV陽(yáng)性率約為3.2%，共有近4 000萬(wàn)人感染HCV〔2〕。龐大的感染人群加上HCV病毒感染的慢性、隱匿、無(wú)疫苗可用等特點(diǎn)，給社會(huì)發(fā)展帶來(lái)沉重的疾病和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。HCV存在6種基因型和多種亞型，基因組間的變異性較大，以包膜糖蛋白區(qū)(E1E2蛋白)的變異度最高〔5〕。對(duì)HCV E1E2蛋白的研究是肝病研究的焦點(diǎn)問(wèn)題，有助于解答HCV與宿主細(xì)胞的吸附感染機(jī)制以及保護(hù)性疫苗的研發(fā)等。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)中國(guó)陜西地方毒株HCV 1b亞型E1E2核苷酸序列與HCV-J株、HC-C2株比較，同源性較差，但比對(duì)其氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)同源性較高。說(shuō)明該1b亞型毒株E1E2區(qū)核苷酸突變頻率極高，但多是同義突變。同時(shí)，在相同亞型與不同亞型間比較E2蛋白的HVR 1和2序列，發(fā)現(xiàn)1b亞型的變異性比1a和2a型突出。這些結(jié)果說(shuō)明HCV 1b亞型病毒的包膜糖蛋白區(qū)更易發(fā)生突變，造成復(fù)雜的準(zhǔn)種現(xiàn)象，從而逃避的機(jī)體的免疫識(shí)別，也影響臨床干擾素(IFN)治療的療效〔6〕。

HCV E2蛋白的高變區(qū)存在中和抗原表位，該抗原表位能夠誘導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)，產(chǎn)生保護(hù)性抗體，從而阻止HCV的感染。但是高變區(qū)序列呈現(xiàn)高度變異性，易發(fā)生抗原漂移，導(dǎo)致HCV逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的識(shí)別監(jiān)控，引起丙型肝炎的慢性化〔2〕。本研究顯示相同亞型病毒的E2蛋白的高變區(qū)變異較小，相同亞型的基因低變異率為研發(fā)同亞型毒株的疫苗提供了條件，但是機(jī)體產(chǎn)生的保護(hù)性抗體可能存在株特異性，在其他亞型病毒的免疫保護(hù)作用較弱或無(wú)保護(hù)作用。提示對(duì)HVR 1和2的抗原表位綜合比對(duì)，研發(fā)多價(jià)多肽疫苗或復(fù)合基因疫苗，可能會(huì)對(duì)不同亞型毒株的感染起到交叉免疫保護(hù)作用。

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〔2013-11-21修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)