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    花生熱激蛋白AhHSP70與熱激因子AhHSF基因的克隆及表達分析

    2015-12-22 18:40李翠侯蕾任麗張燁鄭奕雄王興軍
    山東農(nóng)業(yè)科學 2015年4期
    關(guān)鍵詞:序列分析基因克隆基因表達

    李翠+侯蕾+任麗+張燁+鄭奕雄+王興軍

    摘要:熱激蛋白(heat shock proteins,HSPs)和熱激轉(zhuǎn)錄因子(heat shock factors.HSFs)在植物熱脅迫信號轉(zhuǎn)導和耐熱性的產(chǎn)生過程中發(fā)揮了重要作用。本研究從花生轉(zhuǎn)錄組文庫中篩選到HSP70、HSF的eDNA片段,通過序列比對在花生全基因組序列中獲得這兩個基因的基因組序列,根據(jù)序列信息設(shè)計引物,以花生葉片eDNA為模板擴增全長ORF并進行生物信息學分析結(jié)果顯示,AhHSP70基因的ORF全為1 962 bp,編碼653個氨基酸,分子質(zhì)量為72.45 kD,理論等電點pl為4.93;AhHSF基因的ORF全長為1 212 bp,編碼403個氨基酸,分子質(zhì)量為46.03 kD,理論等電點pl為4.85。AhHSP70與AhHSF均不具有信號肽,為可溶性蛋白,二級結(jié)構(gòu)中有大量無規(guī)則卷曲。利用這兩個基因的氨基酸序列分別與來源于其他物種HSP70、HSF的氨基酸序列進行同源比對,并構(gòu)建進化樹進行親緣關(guān)系分析,結(jié)果表明,AhHSP70與大豆GmHSP70親緣關(guān)系較近,與番茄SlHSP70親緣關(guān)系比較遠;AhHSF與菜豆PaHSF親緣關(guān)系較近,而與蒺藜苜蓿MtHSF的親緣關(guān)系較遠。利用實時熒光定量PCR對AhHSP70和AhHSF在熱脅迫情況下的表達進行分析,結(jié)果表明這兩個基因在42℃高溫條件下表達量顯著升高,AhHSP70在高溫脅迫3 h后表達明顯升高,熱處理24 h和48 h后,表達量為對照的 50倍和135倍;轉(zhuǎn)錄因子AhHSP在高溫脅迫3 h后表達明顯升高,高溫處理6 h后達到最高,隨后下降。本研究初步驗證了花生熱激蛋白和熱激因子基因在花生響應(yīng)高溫脅迫中的作用。

    關(guān)鍵詞:花生;熱激蛋白;熱激因子;基因克?。恍蛄蟹治?;基因表達

    中圖分類號:S565.203.2 文獻標識號:A 文章編號:1001-4942(2015)04-0001-07

    收稿日期:2015-01-30

    基金項目:國家自然科學基金項目(21376281);國家“863”計劃項目(2013AA102602);山東省生物資源創(chuàng)新項目;濟南市科技創(chuàng)新項目(20l102033);山東省自主創(chuàng)新成果轉(zhuǎn)化專項(2012ZHZXIA0418)

    熱激蛋白(heat shock proteins,HSPs)是一類進化保守的多肽,在機體受到高低溫、干旱、鹽漬、缺氧、機械損傷等多種環(huán)境脅迫時誘導合成[1],其中高溫足誘導HSPs合成的主要因素[2],故又稱應(yīng)激蛋白或熱休克蛋白。HSPs作為一種分子伴侶,能夠及時將受熱損傷的蛋白聚集,協(xié)助其肽鏈的折疊,促使其復性從而恢復體內(nèi)正常蛋白的功能[3]。張建國等[4]研究發(fā)現(xiàn),HSPs的積累水平與生物的耐熱性呈顯著正相關(guān)。熱激因子(heat shock factors,HSFs)是生物體內(nèi)調(diào)節(jié)熱激應(yīng)答的一類轉(zhuǎn)錄因子,主要存在于細胞核內(nèi),能激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄,在植物熱脅迫信號轉(zhuǎn)導和耐熱性的產(chǎn)生過程中發(fā)揮了重要的作用[5]。

    HSPs作為一類逆境脅迫蛋白,可以被多種逆境所誘導,并能夠減輕脅迫引起的傷害,Lurie等[6]還發(fā)現(xiàn)HSPs蛋白具有交叉保護的功能。Tissieres等[7]首次在黑腹果蠅中發(fā)現(xiàn)熱激蛋白HSPs,隨后發(fā)現(xiàn)動物、植物、微生物都能合成HSPs。在生物體內(nèi)熱激蛋白有多種形式,例如泛索(ubiquitin)是一類組成型表達的熱激蛋白,蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulphide - isomerase,PID))也被認為是一種熱激蛋白[8]。根據(jù)分子量大小的不同,可將HSPs分為5個家族,即HSP110、HSP90、HSP70、HSP60和小分子HSP[9]。其中HSP90具有調(diào)節(jié)作用,可作用于激素受體,保證受體呈無活性狀態(tài)[10]。HSP70是HSPs家族中最為保守也是最重要的一類蛋白[11],是目前研究最深入的一類蛋白,在依賴ATP的蛋白質(zhì)折疊和裝配中起作用。HSP70結(jié)構(gòu)包括N端ATPase結(jié)合區(qū)以及C端多肽結(jié)合區(qū),N端序列高度保守,具有結(jié)合并水解ATP的活性[12,13]。HSP60最早被稱為分子伴侶,線粒體HSP60主要參與了核編碼的線粒體蛋白質(zhì)的加工、定位和裝配,小分子HSP在熱激及其恢復時,在細胞質(zhì)、細胞核以及細胞器之間運動,保護細胞免受高溫傷害,修補被損傷的蛋白。小分子熱激蛋白N端序列在不同物種中差異較大,C端則高度保守[14]。植物熱激蛋白可以在不同的器官中被誘導,可在根、莖、葉、種子以及幼苗中產(chǎn)生,也可在體外單個細胞中產(chǎn)生,此外,它們也可定位于不同的細胞器中。

    典型的熱激轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)包括N端的DNA結(jié)合域(DBD)、寡聚化結(jié)構(gòu)域(OD)、核定位信號(NLS)、核輸出信號(NES)和C端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。植物熱激轉(zhuǎn)錄因子可通過形成回文發(fā)卡結(jié)構(gòu),特異結(jié)合熱激蛋白基因啟動子中高度保守的熱激元件,控制熱激蛋白基因的表達[4]。如熱脅迫條件下,擬南芥中的HSF可調(diào)節(jié)HSP110、HSP70和小分子HSP的表達[15]。根據(jù)表達特性不同,熱激轉(zhuǎn)錄因子可分為組成型和誘導型兩種,一般參與脅迫應(yīng)答的主要是誘導型熱激轉(zhuǎn)錄因子。最早的熱激轉(zhuǎn)錄因子是在酵母中被克隆得到的,隨后在果蠅和哺乳動物中發(fā)現(xiàn)并克隆[17]。在植物中,道德是在番茄中克隆[18],目前在擬南芥、水稻、玉米、大豆等植物中均開始了對該基因家族的研究[16,19,20]。

    本試驗從花生葉片中克隆了AhHSP70和AhHSF的全長編碼序列,分別對其進行生物信息學分析,并利用實時定量PCR技術(shù)在mRNA水平檢測了高溫脅迫對花生AhHSP70和AhHSF表達的影響,了解熱激蛋白在花生抗逆脅迫中的作用,為探討花生響應(yīng)高溫的分子機理、選育耐高溫的花生新品種奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    供試材料為花生耐旱品種仲愷花1號,由仲愷農(nóng)業(yè)工程學院種子科學與工程研究所提供。大腸桿菌(Escherichia coli)菌種DH5α為山東省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究中心保存。瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化科技有限公司;T4 DNA連接酶、Tap DNA聚合酶購自Fermentas公司;pMD18-T載體、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA酶、實時熒光定量PCR試劑盒FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)購自羅氏試劑公司,LA Taq DNA聚合酶購自寶生物工程(大連)有限公司。PCR引物合成由上海生工生物工程股份有限公司完成。endprint

    1.2 試驗方法

    1.2.1 42℃高溫處理 將仲愷花1號在溫室中培養(yǎng),待其幼苗長出2周左右,選取18株長勢基本一致的花生幼苗,每3株作為一個重復,進行42℃持續(xù)高溫處理,分別于處理0、3、6、12、24、48 h對葉片進行取樣,迅速置于液氮并于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 總RNA的提取與eDNA的合成 高溫處理不同時間的花生葉片總RNA的提取采用CTAB-LiCl法,用CTAB提取液裂解研磨好的植物組織,氯仿/飽和酚抽提,去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì),LiCl、無水乙醇沉淀RNA,隨后進行DNA消化,獲得總RNA。用紫外可見分光光度計測定RNA的濃度,上樣2 μg瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的RNA,在Alpha Imager PE型凝膠成像系統(tǒng)上觀察拍照。按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTM Ⅱ 1st Strand eDNA Synthesis Kit)說明進行反轉(zhuǎn)錄獲得eDNA。

    1.2.3 AhHSP70和AhHSF基因eDNA全長序列的克隆 從花生轉(zhuǎn)錄組序列中篩選到HSP70和HSF基因的eDNA片段,通過同源查找花生全基因組序列(未發(fā)表數(shù)據(jù))獲得兩個基因的基因組序列,根據(jù)基因組序列中預測的編碼區(qū)設(shè)計引物,以花生葉片eDNA為模板克隆兩個基因的ORF全長,分別命名為AhHSP70和AhHSF。

    PCR擴增基因全長的反應(yīng)體系(50 μl):1 μL的eDNA模板,5 U/μL Pfu高保真DNA聚合酶0.5 μL,5×Buffer 5 μl,2.5 mmol/L dNTP 4 μL,正反向引物各2 μL以及ddH2O 35.5μL。

    PCR反應(yīng)程序:94℃預變性3 min;94℃變性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸2 min,35個循環(huán);72℃延伸10 min,保存溫度為4℃。

    反應(yīng)結(jié)束后進行1%瓊脂糖凝膠電泳,目的片段回收純化后平末端加A,加A產(chǎn)物與pMD18-T載體連接,轉(zhuǎn)入DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞,后經(jīng)菌液PCR檢測,挑取含有目的片段的菌液在山東省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)中心測序中心進行測序,得到HSP70和HSF的ORF序列。所使用的引物序列見表1。

    1.2.4 AhHSP70和AhHSF序列的生物信息學分析 利用DNAStar軟件將測得的序列翻譯成氨基酸序列,用DNAMAN軟件分析其氨基酸序列的二級結(jié)構(gòu)、親水性/疏水性以及跨膜結(jié)構(gòu);用MEGA5.0軟件分別對其氨基酸構(gòu)建進化樹,進行進化分析;在線軟件Protparatam工具(http://web.expasy.org/protparam/)分析其理化性質(zhì);在線工具PSORT(http://psort.nibb.ae.jp/form.html)預測其亞細胞定位;Signal P 3.0在線軟件預測其信號肽;SMART和InterPro在線軟件對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域進行分析預測.

    1.2.5 AhHSP70和AhHSF基因的表達分析 利用qRT-PCR分析花生經(jīng)過高溫處理O、3、6、l2、24、48 h后基因的表達。以組成型表達的花生Actin基因作為內(nèi)參,實時定量PCR引物為AhHSP70realF、AhHSP70realR和AhHSFrealF、AhHSFrealR(表1)。采用FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)按說明書進行操作。用ABI PRISM 7900HT實時定量PCR儀進行反應(yīng),反應(yīng)程序為:95℃預變性10 s;95℃ 15 s,60℃ 1 min,40個循環(huán);溶解曲線分析:95℃ 15 s,60℃ 1 min,95℃ 30 s,60℃ 15 s。重復試驗3次。根據(jù)溶解曲線檢測PCR產(chǎn)物的特異性?;虮磉_差異通過2-△△CT方法計算。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 AhHSP70和AhHSF基因克隆及進化樹分析

    以花生葉片eDNA為模板擴增AhHSP70和AhHSF開放讀碼框,擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析。由圖可見,擴增條帶的長度分別為2 000 bp和1 500 bp左右。同收目的片段末端加A后與pMD18-T載體連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,選取陽性菌落進行測序,經(jīng)正反向拼接,AhHSP70基因的全長ORF為1 962 bp,編碼含653個氨基酸的肽鏈;AhHSF基因的全長ORF為1 212 bp,編碼含403個氨基酸的肽鏈。

    從GenBank獲得大豆、水稻、豌豆等植物的熱激蛋白HSP70和HSF序列,利用DNAMAN軟件分別對不同植物來源的HSP70和HSF進行同源性分析,并利用MEGA5.0軟件構(gòu)建進化樹(圖2a、b)。結(jié)果表明,AhHSP70與大豆和豌豆的HSP70親緣關(guān)系較近,處于同—分支,而與小麥、棉花、番茄等的HSP70親緣關(guān)系較遠;AhHSF與菜豆和紫苜蓿的HSF親緣關(guān)系比較近,而與蒺藜苜蓿和大豆等的HSF親緣關(guān)系較遠

    2.2 AhHSP70和AhHSF蛋白的理化性質(zhì)、細胞定位分析

    使用Protparatam在線工具分析AhHSP70和AhHSF蛋白的理化性質(zhì),結(jié)果顯示AhHSP70蛋白的分子質(zhì)量為71.45 kD,理論等電點pI為4.93。在氨基酸構(gòu)成中,相對含量較多的是Ala、Glu、Gly和Lys,分別占9.2%、8.6%、8.90%和8.3%??偟膸ж撾姾傻臍埢ˋsp+Glu)有102個,帶正電荷的殘基(Arg+Lys)有86個。AhHSF分子質(zhì)量為46.03 kD,理論等電點pI為4.85。在氨基酸構(gòu)成中,含量較多的是Ser、Glu、Leu和Asp,分別占12.2%、9.7%、7.7%和6.7%??偟膸ж撾姾傻臍埢ˋsp+Glu)有66個,帶正電倚的殘基(Arg+Lys)有40個。

    通過DNAMAN軟件分別對AhHSP70、AhHSF兩個蛋白序列疏水性/親水性以及它們的跨膜結(jié)構(gòu)域進行預測和分析,結(jié)果表明,AhHSP70與AhHSF肽鏈中親水氨基酸分布都比較均勻,并且數(shù)量大于疏水氨基酸(圖3),且兩者均不含跨膜結(jié)構(gòu)域??梢酝茢郃hHSP70和AhHSF均為可溶性蛋白。endprint

    亞細胞定位預測結(jié)果顯示,AhHSP70和AhHSF蛋白在細胞核定位的概率均可達0.76,因此,推測AhHSP70和AhHSF定位于細胞核的可能性比較大。運用Signal P 3.0在線軟件對AhHSP70和AhHSF蛋白序列信號肽進行預測分析,結(jié)果顯示這兩個蛋白均無信號肽。

    2.3 AhHSP70和AhHSF二級結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)域的預測及分析

    用DNAMAN軟件對花生AhHSP70和AhHSF蛋白序列的二級結(jié)構(gòu)進行預測 結(jié)果顯示,AhHSP70和AhHSF蛋白序列中,均有α-螺旋、無則卷曲、β-折疊三種二級結(jié)構(gòu),其中無規(guī)則卷曲是AhHSP70和AhHSF蛋白中最大量的二級結(jié)構(gòu),α-螺旋和β-折疊分布于整個蛋白質(zhì)分子中。通過SMART和InterPro工具在線軟件預測分析表明,AhHSP70蛋白C端391~548 aa處為底物結(jié)合位點區(qū)域.637~646 aa處是一段低復雜性區(qū)段(Lowe-complexity region,LCR)。AhHSF蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中,N端10~103 aa處具有典型的DBD結(jié)構(gòu)域,內(nèi)部存在一個螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋的疏水結(jié)構(gòu),該疏水結(jié)構(gòu)可以精確定位并識別啟動子區(qū)熱激元件(HSE),在HSP基因轉(zhuǎn)錄時DBD區(qū)域可與HSE結(jié)合,從而調(diào)控熱激蛋白基因的表達[21]。C端有一段保守的的卷曲螺旋區(qū)域(coiled coil region)以及LCR。

    2.4 AhHSP70和AhHSF基因的表達分析

    實時熒光定量PCR分析結(jié)果表明,花生在42℃高溫脅迫條件下,AhHSP70和AhHSF兩個基因表達量均顯著增加。基中AhHSP70高溫處理3 h時表達量開始升高,24 h時表達量大幅度升高,48 h后仍繼續(xù)升高,表達量達到處理前的135倍,說明AhHSP70在高溫脅迫下表達顯著升高,響應(yīng)熱脅迫長時間誘導。AhHSF在高溫脅迫3 h表達顯著升高,在高溫脅迫6 h表達量達到最高,為處理前的624倍,隨后下降,但到48 h表達量仍高達處理前的23倍(圖4)。

    3 討論

    植物在生長發(fā)育過程中會受到各種逆境脅迫的影響,體內(nèi)會產(chǎn)生一系列復雜的防御機制來進行自我保護,如在高溫等脅迫條件下,生物體內(nèi)熱激蛋白合成發(fā)生變化,降低生物體在脅迫中受到的傷害,是一種有效的防御措施。目前已有很多植物的熱激蛋白和熱激轉(zhuǎn)錄因子基因被克隆,并研究了它們在植物抵御逆境脅迫中的作用。

    本研究利用花生轉(zhuǎn)錄組和全基因組序列結(jié)果,從花生葉片中克隆獲得AhHSP70和AhHSF的完整ORF,通過氨基酸序列同源性比對分析表明,AhHSP70與豆科植物大豆GmHSP70親緣關(guān)系較近,AhHSF與豆科植物菜豆PaHSF序列相似性較高。亞細胞定位分析顯示高溫處理情況下AhHSP70和AhHSF主要定位于細胞核中,推測熱激蛋白AjHSP70可能參與核內(nèi)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運、折疊及解折疊的作用,而熱脅迫條件下熱激轉(zhuǎn)錄因子AhHSF進入細胞核從而調(diào)控下游基因表達對AhHSP70和AhHSF蛋白結(jié)構(gòu)域的預測分析表明,AhHSP70 C端具有底物結(jié)合位點,可能參與蛋白質(zhì)的折疊、轉(zhuǎn)運、跨膜運輸以及蛋白質(zhì)降解調(diào)控等過程,與行使分子伴侶的功能有關(guān);AhHSF蛋白結(jié)構(gòu)的N端具有DNA結(jié)合區(qū)域,與調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān)。

    HSPs作為一種分子伴侶型的應(yīng)激蛋白,能夠?qū)ν饨绛h(huán)境刺激做出應(yīng)答反應(yīng),減少高溫對生物體的傷害,有效地提高生物體對惡劣環(huán)境的適應(yīng)能力[22,23]。此外,HSPs能夠提高細胞的應(yīng)激能力,具有保護細胞或機體免受損傷的作用。近年來的研究表明,除高溫之外,其他環(huán)境脅迫如干旱、低溫等也會誘導HSPs的產(chǎn)生。另外,正常情況下生物體內(nèi)也會有HSPs的存在。本研究利用qRT-PCR對AhHSP70和AhHSF基因的表達分析顯示,在受到42℃熱脅迫條件下花生葉片中AhHSP70在3 h表達量開始升高,24 h以后表達量持續(xù)大幅度升高。大豆中的研究結(jié)果顯示,熱處理3~5 min就可以檢測到大豆幼苗中熱激蛋白mRNA的積累,l~2 h達到高峰,6 h后mRNA水平顯著下降,12 h表達量幾乎為零[24]。擬南芥中對HSP70家族多個基因表達分析的結(jié)果顯示,除了mtHsc70-1(屬于擬南芥中線粒體HSP70家族)和cpHsc70-1(屬于擬南芥中葉綠體HSP70家族)兩個基因,其他基因在40℃熱處理后表達上調(diào),多數(shù)基因在處理30 min表達量就上升到最大,之后緩慢下降,如HSP70-2基因,少數(shù)基因在60 min時表達量最高,之后下降,如HSP70基因[25]。玉米中也有類似的情況.熱激蛋白的誘導合成只持續(xù)4 h,隨后下降。而本試驗中,AhHSP70在高溫處理48 h仍持續(xù)高表達,且受誘導時間周期延長。因此,熱激蛋白在不同植物體內(nèi)的表達模式有所差異,花生中AhHSP70可能在持續(xù)高溫下對調(diào)控植物的生長起到重要作用。對熱激因子的表達在植物中也有研究,其響應(yīng)熱激脅迫的周期普遍較短。陳先知等[26]發(fā)現(xiàn)對一黃瓜進行2 h熱處理后,全基因組中的熱激轉(zhuǎn)錄因子表達水平存在很大差異,大部分轉(zhuǎn)錄因子表達量顯著上升。擬南芥中AtHsfA2在正常條件下基本檢測不到表達,37℃熱處理0.5 h到1 h表達量最高,隨后明顯降低,處理12 h表達量降低為零[6]。本試驗中,AhHSF在高溫脅迫3 h時表達量顯著升高,到6 h時達到最高,隨后表達量顯著下降,可能是由于在高溫初期,AhHSF的表達上調(diào)激活下游相關(guān)熱激蛋白的表達,隨著熱處理時間延長,熱激蛋白的高表達可能會對其表達具有抑制作用,因此,表達量有所下降.這與宮本賀等[27]在麝香百合中的研究結(jié)果相似,但麝香百合熱激轉(zhuǎn)錄因子表達量下降后又出現(xiàn)上升趨勢,可以看出AhHSF在不同植物中表達模式也是有差異的根據(jù)以上結(jié)果推測AhHSF在花生感受高溫脅迫的初期行使調(diào)控作用,表明AhHSF是一個受高溫誘導且在高溫環(huán)境中起調(diào)節(jié)作用的熱激轉(zhuǎn)錄因子。

    4 結(jié)論

    本研究克隆到花生熱激蛋白AhHSP70和熱激因子AhHSF的基因全長ORF,通過實時熒光定量PCR分析高溫處理不同時間AhHSP70與AhHSF的表達,結(jié)果顯示,AhHSP70對熱刺激初期不敏感,長時間高溫誘導后上調(diào)劇烈;在高溫條件下AhHSF表達水平快速上調(diào),隨后快速下調(diào)。該結(jié)果為進一步研究熱激蛋白與轉(zhuǎn)錄因子的基因功能奠定了基礎(chǔ),為闡明其在花生適應(yīng)逆境脅迫的作用機理具有重要作用。endprint

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