小鼠促排卵-體外受精動物模型的建立

馮 清，史鴻志，林 燕，雷承泳

(1、贛州市人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，江西贛州341000；2、秦皇島市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)科，河北秦皇島066000)

小鼠促排卵-體外受精動物模型的建立

馮 清1，史鴻志2，林 燕1，雷承泳1

(1、贛州市人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，江西贛州341000；2、秦皇島市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)科，河北秦皇島066000)

目的建立小鼠促排卵-體外受精動物模型。方法腹腔注射不同劑量促排卵藥物促使昆明小鼠排卵，分析各組劑量下獲取的卵-冠-丘復(fù)合物和MⅡ卵子數(shù)以確定較佳劑量組合。再用微滴法受精+微滴法培養(yǎng)、四孔板法授精+四孔板法培養(yǎng)、四孔板法授精+微滴法培養(yǎng)3種方法實施小鼠體外受精技術(shù)。比較各組的受精率、卵裂率、囊胚率確定較佳受精、培養(yǎng)方法。結(jié)果⑴6～8周齡昆明小鼠采用尿促性腺激素（HMG）8U+絨促性腺激素(HCG)8U劑量組合獲得卵子數(shù)目最多，成熟度最好(P＜0.05)；⑵四孔板法授精+四孔板法培養(yǎng)受精率最高，但卵裂率、囊胚率與其它兩組無顯著性差異。四孔板法授精+微滴法培養(yǎng)既能方便受精操作也有利于胚胎單個追蹤觀察。結(jié)論6～8周齡昆明小鼠采用HMG8U+HCG8U劑量組合能最有效獲取卵子；四孔板法授精+微滴法培養(yǎng)是體外受精技術(shù)的較佳方法。

促排卵技術(shù)；體外受精技術(shù)；小鼠卵；模型

小鼠促排卵-體外受精動物模型的建立是臨床開展體外輔助生殖相關(guān)技術(shù)的首要內(nèi)容。它的建立有利于生殖實驗室人員在現(xiàn)有實驗環(huán)境下熟悉體外受精-胚胎移植操作過程，檢測胚胎培養(yǎng)環(huán)境，優(yōu)化體外受精流程，為臨床體外輔助生殖相關(guān)技術(shù)的盡快開展提供實踐依據(jù)和工作基礎(chǔ)。

本實驗旨在探索昆明小鼠促排卵藥物HMG和HCG的較佳劑量組合和建立小鼠體外受精技術(shù)的穩(wěn)定方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物6～8周SPF級昆明小鼠（動物許可證號：SCXK（贛）2011-0001，江西中醫(yī)學(xué)院實驗動物中心）母鼠65只，體重27.58～34.21g，5只一籠飼養(yǎng)；公鼠20只，體重32.25～35.87g，單獨飼養(yǎng)。在安靜、清潔環(huán)境中飼養(yǎng)，自由攝食飲水，12h光照周期。1.2主要儀器體視顯微鏡（Nikon SMZ800），倒置顯微鏡（Nikon Ti-S1000），CO2培養(yǎng)箱（Labotect C200），鐘表鑷，眼科剪等。

1.3 實驗試劑HMG（麗珠集團麗珠制藥廠），HCG (麗珠集團麗珠制藥廠)，G系列序貫培養(yǎng)液（瑞典瑞利芙公司），透明質(zhì)酸酶（瑞典瑞利芙公司）。

1.4 促排卵藥物劑量分組同一批次母鼠隨機分成A（HMG6U+HCG6U），B（HMG7U+HCG7U），C（HMG8U+HCG8U），D（HMG9U+HCG9U），E（HMG10U +HCG10U）5組，每組3只。于當天晚上19：30注射腹腔HMG相應(yīng)單位，48h后腹腔注射HCG相應(yīng)單位。60~62h后頸椎脫臼法處死母鼠，于輸卵管壺腹部撿出卵-冠-丘復(fù)合物，用透明質(zhì)酸酶消化顆粒細胞并計數(shù)各組MⅡ卵子數(shù)。

1.5 體外受精培養(yǎng)方式分組同一批次母鼠50只，隨機分成A（微滴法授精+微滴法培養(yǎng)），B（四孔板法授精+四孔板法培養(yǎng)），C（四孔板法授精+微滴法培養(yǎng)）三組。實驗方法參照文獻[1-3]方法并改良。

實驗步驟：第一天，母鼠晚19：30注射HMG，48h后注射HCG。第三天早上8：00頸椎脫臼法處死公鼠。取公鼠附睪尾及輸精管于預(yù)熱培養(yǎng)液中。在體視鏡下用1ml無菌注射針劃破附睪尾，并用鑷子從輸精管中擠出精液。巴斯德吸管吸取精子懸液于另一盛有0.5ml預(yù)平衡的洗精受精液（G-IVF）試管中，放入培養(yǎng)箱中獲能1h。加精前用計數(shù)板計算精子濃度和活力。HCG注射13~14h后處死母鼠，迅速剝離出輸卵管并放入預(yù)熱的取卵胚胎處理液（GMOPs）培養(yǎng)液中。在體視鏡下用鐘表鑷夾住靠近輸卵管膨脹部位的漏斗部并使之靠近皿底，另一端用1ml無菌注射針頭撕破膨脹部位釋放卵-冠-丘復(fù)合物。巴斯德吸管吸取卵-冠-丘復(fù)合物于另一預(yù)平衡的G-IVF培養(yǎng)皿中清洗數(shù)次再移入四孔板中（每孔0.5mlG-IVF，蓋油，已預(yù)平衡）或微滴皿中（每個微滴0.2mlG-IVF，蓋油，已預(yù)平衡）。加精時間在HCG注射后14~16h，加精濃度調(diào)至2~5×106/ml。加精后6~8h拆卵觀察雙原核及第二極體情況。將正常受精卵挑出移入預(yù)平衡的卵裂胚培養(yǎng)液（G-1）四孔板或微滴皿中。第四天早上8：00觀察早卵裂情況。第五天早上8：00觀察四細胞胚胎情況并制備囊胚培養(yǎng)液（G-2）四孔板或微滴皿。第六天早上8：00觀察桑椹胚情況并將胚胎移入G-2四孔板或微滴皿。第七天早上8：00觀察囊胚形成情況。第八天早上8：00再次觀察囊胚形成情況。

1.6 統(tǒng)計方法受精率=雙原核胚胎數(shù)/獲卵數(shù)，卵裂率=胚胎卵裂數(shù)/受精胚胎數(shù)，囊胚形成率=囊胚數(shù)/胚胎卵裂數(shù)。采用SPSS 14.0統(tǒng)計軟件，各組間均數(shù)和標準差（）的比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 促排卵藥物劑量分組結(jié)果5組促排卵藥物劑量分組結(jié)果表明：6~8周齡的昆明小鼠隨著促排卵藥物劑量的增加，卵子數(shù)目呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。C組劑量組合不僅能獲得更多的卵子數(shù)目而且成熟卵子數(shù)也更多。各組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 促排卵藥物劑量分組小鼠獲卵情況（）

表1 促排卵藥物劑量分組小鼠獲卵情況（）

劑量分組只數(shù)體重（g)卵-冠-丘復(fù)合物數(shù)目MⅡ卵數(shù)ABCDE 33333 F值P值28.84±0.66 29.09±0.12 29.32±0.67 29.65±1.33 29.06±0.65 0.46 0.765 11.66±1.53 13.00±2.64 24.00±2.52 16.33±1.53 10.67±3.06 15.98 0.0002 6.67±0.58 6.00±2.00 18.33±2.08 8.33±1.53 6.00±3.61 16.94 0.0002

2.2 體外受精培養(yǎng)方式分組3組受精培養(yǎng)方式結(jié)果表明：B組受精率高于A，C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。各組卵裂率，囊胚率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表2 體外受精培養(yǎng)方式分組小鼠各項指標情況（）

表2 體外受精培養(yǎng)方式分組小鼠各項指標情況（）

劑量分組只數(shù)體重（g)受精率（%）ABC 8 22 20 F值P值29.85±1.47 29.84±2.15 30.49±2.33 0.549 0.5813 60.38±6.98 71.95±19.56 61.38±9.61 3.81 0.0425卵裂率（%）囊胚率（%）97.73±4.55 98.26±2.96 99.85±0.56 2.64 0.0819 86.39±3.06 84.96±12.83 86.57±3.15 0.191 0.827

3 討論

人類輔助生殖技術(shù)是借鑒小鼠促排卵體外受精模型而建立起來的[4]。小鼠促排卵技術(shù)是小鼠體外受精技術(shù)實施的基礎(chǔ)。小鼠促排卵藥物一般是孕馬血清促性腺激素PMSG和人絨毛膜促性腺激素HCG。每只小鼠注射劑量從5~10U不等[5-7]。促排卵效果不僅與小鼠品系、周齡、體重有關(guān)，還與促排卵藥物的種類、劑量、廠家、批次、注射間隔時間等有關(guān)[8-11]。本實驗購買同一批次SPF級性成熟昆明小鼠適應(yīng)本舍光照周期和飲食條件一周后再分組實驗。因此小鼠品系、周齡、體重對促排卵技術(shù)的影響不大。本實驗將作用相似的HMG代替PMSG，更能模擬人類輔助生殖技術(shù)的促排卵用藥模式。劑量分組結(jié)果顯示小鼠的排卵數(shù)量和質(zhì)量隨促排卵藥物劑量的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。這種趨勢在人類促排卵技術(shù)中也存在。杜秀雅等[12]認為促排卵引起多個卵泡發(fā)育，卵泡周圍氧濃度降。卵泡長期缺氧可能影響卵泡液中的生長因子從而影響卵子的發(fā)育和質(zhì)量。據(jù)此推測：昆明小鼠促排卵藥物劑量有某個閾值能最大限度地刺激卵子生長同時卵泡周圍的氧濃度總量限定了這些卵子的數(shù)目。C組劑量正好在這一閾值內(nèi)，故本實驗的后期實驗采用了該組劑量。

微滴法受精培養(yǎng)指單個卵子或胚胎單獨受精或培養(yǎng)。該法操作繁瑣但便于單個卵子或胚胎的觀察，具有連續(xù)性和獨立性[13]。四孔板受精培養(yǎng)指將多個卵子或胚胎一起受精或培養(yǎng)，培養(yǎng)液的量較微滴法多。該法操作方便簡單且被證實有利于囊胚的培養(yǎng)[14]。本實驗結(jié)果顯示微滴法比四孔板法受精率更低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。原因可能為微滴法操作時間更長，卵子暴露于外界的時間更長。卵子周圍溫度和滲透壓的改變更劇烈，卵子的成熟和發(fā)育受到損傷。3組的卵裂率、囊胚率差異不顯著。原因可能為受精后胚胎在不斷發(fā)育生長，各種細胞器和細胞膜功能在增強。胚胎抵御外界因素改變的能力較卵子強。卵裂能力和囊胚形成能力由胚胎的發(fā)育潛質(zhì)決定。在熟練操作下，培養(yǎng)方式并不能改變胚胎的發(fā)育潛質(zhì)。王利紅等[15]認為胚胎發(fā)育潛質(zhì)差異在胚胎接種時就存在。本實驗的培養(yǎng)方式分組結(jié)果提示本科室在開展人類體外受精技術(shù)時可采用四孔板法受精，微滴法培養(yǎng)胚胎相結(jié)合的方法。這既有利于保護卵子的發(fā)育潛能又有利于單個胚胎的追蹤觀察和篩選優(yōu)質(zhì)胚胎。

總之，通過小鼠促排卵體外受精技術(shù)模型的構(gòu)建，實驗室人員摸索了適合本中心的體外受精培養(yǎng)方式，熟練了體外受精操作流程，為臨床輔助生殖技術(shù)的順利開展奠定扎實的工作基礎(chǔ)。

[1]孫青元，陳大元主譯.小鼠胚胎操作實驗手冊[M].第3版.北京：北京工業(yè)出版社，2006：420-422.

[2]Matson PL，Graefling J，Junk SM，et al.Cryopreservation of oocytes and embryos：use of a mouse model to investigate effects upon zona hardness and formulate treatment strategies in an in-vitro fertilization programme[J].Human Reproduction，1997，12(7)：1550-1553. [3]Xu JS，Chan ST，Lee HJ，et al.Differential growth，cell proliferation，and apoptosis of mouse embryo in variousculture media and in coculture in mice[J].Mol Reprod Dev，2004，68(1)：72-80.

[4]劉平，喬杰主編.生殖醫(yī)學(xué)實驗室技術(shù)[M].北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2013：323-324.

[5]邱卓琳，李紅，毛向明，等.不同劑量促排卵激素對昆明小鼠卵子及胚胎發(fā)育的影響[J].廣東醫(yī)學(xué)雜志，2012，33(3)：325-327.

[6]高建明，侯文元，焦占海，等.小鼠超數(shù)排卵效果分析[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報，2000，15(1)：25-28.

[7]Su P，Wu JC，Sommer JR，et al.Conditional induction of ovulation in mice[J].Biol Reprod，2005，73(4)：681-687.

[8]Ménézo YJR，F(xiàn)rancois Hérubel.Mouse and bovine models for human IVF[J].Reproductive BioMedicine Online 2002，4(2)：170-175.

[9]孫新明，魏泓，趙永聚，等.昆明小鼠成熟卵母細胞體外受精及受精卵體外培養(yǎng)的研究[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2005，5（3)：130-132.

[10]Luo C，Zuniga J，Edison E，et al.Superovulation strategies for 6 commonly used mousestrains[J].Am Assoc Lab Anim Sci，2011，50 (4)：471-478.

[11]Choi KH，Joo BS，Sun ST，et al.Administration of visfatin during superovulation improves developmental competency of oocytes and fertility potential in aged female mice[J].Fertil Steril，2012，97(5)：1234-1241.

[12]杜秀雅，馬華剛.促排卵對小鼠卵巢組織中缺氧誘導(dǎo)因子-1ɑ的影響[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志，2015，24(3)230-233.

[13]黃國寧，孫海翔主編.體外受精-胚胎移植實驗室技術(shù)[M].人民衛(wèi)生出版社出版，2012：210.

[14]Walker SK，Heard TM.In vitro culture of sheep embryos without co-culture：successes and perspectives[J].Theriogenology，1992，37 (1)：111.

[15]王利紅，連方.兩種2-細胞鼠胚體外培養(yǎng)方法的比較[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2009，19(11)：67-69.

Establishment of the controlled ovarian hyperstimulation(COH)-in vitro fertilization(IVF)murine animalmodel

FENG Qing，SHI Hongzhi，LIN Yan，et al.
People’s Hosiptal of Ganzhou，Ganzhou Jiangxi 341000，China.

Objective To establish a controlled ovarian hyperstimulation(COH)-in vitro fertilization(IVF)model in mice. MethodsIntraperitoneal injection of different dosage of hormone（HMG6U+HCG6U，HMG7U+HCG7U，HMG8U+HCG8U，HMG9U+HCG9U and HMG10U+HCG10U）were carried out to stimulate Kunming mice ovulation，then the quantity of oocytecorona-cumulus complexes and MⅡoocytes in different groups were analyzed to get the preferred dose combinations.Furthermore，Three methods including micro-drops fertilization and micro-drops cultivation，4-well dishes fertilization and micro-drops dishes cultivation，4-well dishes fertilization and 4-well dishes cultivation were used in vitro fertilization technique.The fertility rate，cleavage rate and blastocyst rate were compared in different groups to choose better fertilization and cultivation method.Results⑴The biggest amount and the best quality of oocytes were found in Kunming mice of 6-8 weeks of age injected with HMG8U and HCG8U(P＜0.05)；⑵The fertility rate of 4-well dishes fertilization and 4-well dishes cultivation was significantly higher than the other two groups.However，the cleavage rate，blastocyst rate had no significant difference between the other two groups.4-well dishes fertilization and micro-drops dishes cultivation were convenient and available to observe embryo fertilized single trail as well.Conclusions HMG8U and HCG 8U were found out to be the most effective acquisition of oocytes in Kunming mice aged 6-8 weeks.4-well dishes fertilization and micro-drops dishes cultivation was the preferred method of in vitro fertilization techniques.

Controlled ovarian hyperstimulation；In vitro fertilization；Mouse oocyte；Model

R-332

A

1674-1129(2015)06-0714-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2015.06.007

2015-09-28；

2015-10-27)

贛州市指導(dǎo)性科技計劃項目（編號：20120410）

馮清，女，出生于1984年5月，碩士，主管技師，研究方向：生殖醫(yī)學(xué)與遺傳醫(yī)學(xué)。