車前草對呼吸道合胞病毒體外抑制作用的研究

黃筱鈞，張朝貴

1．湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院(湖北恩施445000)

2．湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院(湖北恩施445000)

呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)屬于副粘病毒科肺炎病毒屬，是引起嬰幼兒和兒童下呼吸道感染最主要的病原體，每年約40%～50%住院治療的嬰幼兒毛細(xì)支氣管炎和25%的嬰幼兒肺炎是RSV感染所致。同時，RSV也常引起成人特別是老年人的呼吸道感染［1］。最常用藥物利巴韋林因其毒副作用和耐藥性，臨床應(yīng)用受到較大限制。目前尚無特效抗RSV藥物，疫苗研究也無突破性進(jìn)展。中國中藥材資源極其豐富，開發(fā)治療RSV感染的中藥受到廣泛關(guān)注。車前草為車前科多年生草本植物，主要化學(xué)成分是黃酮類、苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜及其苷類、三萜及甾醇類，具有降血脂、抗氧化、抗病原微生物等作用，對金黃色葡萄球菌、皰疹病毒、腺病毒都有一定的抑制作用［2］，抗呼吸道病毒的研究較少。為了進(jìn)一步開發(fā)車前草的藥效，本實驗利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和MTT法，以Hep-2細(xì)胞為細(xì)胞模型，對車前草醇提液體外抗RSV作用進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1．1 實驗材料

1．1．1 藥物 車前草購于恩施藥材公司，為恩施道地藥材，醇提法制備車前草冷藏備用。陽性對照藥物利巴韋林注射液(100 g/L)，貴州天地藥業(yè)責(zé)任有限公司生產(chǎn)(批號H20067579)。

1．1．2 細(xì)胞與病毒 人咽喉癌上皮細(xì)胞Hep-2為四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心微生物教研室保存。細(xì)胞生長液為10%FBS MEM液，細(xì)胞維持液為2%FBS MEM液。呼吸道合胞病毒(RSV)Long株，由四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心提供。

1．1．3 主要儀器 酶標(biāo)儀(北京普朗新技術(shù)有限公司)，倒置生物顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Becton Dickinson，USA)。

1．2 實驗方法

1．2．1 RSV感染性滴度測定 Hep-2細(xì)胞復(fù)蘇后傳代3次，調(diào)整細(xì)胞為 1．0×104/mL，接種至 96孔板。用細(xì)胞維持液將RSV作10倍系列稀釋，然后接種至Hep-2細(xì)胞，每孔0．1 mL，每一稀釋度重復(fù)4孔，對照組加維持液，37℃、5%CO2培養(yǎng)2 h，更換細(xì)胞維持液。每天觀察、記錄各組細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，至CPE不再進(jìn)展。按照Reed-Muench法計算病毒的半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量(TCID50)。

1．2．2 車前草對Hep-2細(xì)胞的毒性測定 以1．0g/mL車前草為原液，用細(xì)胞維持液倍比稀釋，濃度為0．078、0．156、0．312、0．625、1．25、2．5、5．0、10 g/L，每孔0．1 mL，分別加入Hep-2單層細(xì)胞中，每一稀釋濃度重復(fù)4孔，同時設(shè)陰性對照和陽性對照，37℃、5%CO2培養(yǎng)，每天觀察CPE，并測定570 nm波長下的吸光度(A值)。

1．2．3 車前草對RSV體外抑制作用 實驗分3組，抑制增殖組:0．1 mL 100TCID50RSV與單層Hep-2細(xì)胞37℃、5%CO2作用2 h，洗去未結(jié)合的病毒后加入不同濃度的車前草液;抑制吸附組:不同濃度車前草液與單層Hep-2細(xì)胞作用2 h，洗去未結(jié)合的車前草，加入 100 TCID50RSV;直接殺傷組:100TCID50RSV與不同濃度的車前草液37℃混合作用1 h，然后將混合液直接加入單層Hep-2細(xì)胞中孵育1 h，用PBS洗去未結(jié)合的病毒和藥物，再加入細(xì)胞維持液。3組加樣完成后37℃、5%CO2培養(yǎng)72 h。

1．2．4 CPE觀察 “-”為細(xì)胞生長正常，無CPE產(chǎn)生;“±”為少于10%的細(xì)胞出現(xiàn)CPE;“+”為25%的細(xì)胞出現(xiàn)CPE;“++”為50%的細(xì)胞出現(xiàn)CPE;“+++”為75%的細(xì)胞出現(xiàn)CPE;“++++”為75%以上的細(xì)胞出現(xiàn)CPE。

1．2．5 MTT法 每日觀察細(xì)胞生長情況，當(dāng)病毒對照組CPE達(dá)到“++++”時，測定570 nm波長下的吸光度(A值)，計算出細(xì)胞存活率和病毒抑制率。細(xì)胞存活率=(藥物組平均A值/細(xì)胞對照組平均A值)×100%，病毒抑制率=(實驗組平均A值-病毒對照組平均A值)/(藥物組平均A值-病毒對照組平均A值)×100%。

1．3 統(tǒng)計學(xué)處理 根據(jù)Reed-Muench法計算病毒的50%組織細(xì)胞感染量(TCID50)、車前草致Hep-2細(xì)胞半數(shù)中毒濃度(TC50)、車前草對RSV致Hep-2 CPE產(chǎn)生50%抑制的濃度，即車前草的半數(shù)有效量(IC50)，抗病毒指數(shù) (TI)，TI=TC50/IC50。應(yīng)用SPSS13．0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，進(jìn)行t檢驗及ANOVA檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 RSV感染性滴度測定 本實驗使用的RSV Long株致 Hep-2 細(xì)胞 TCID50=10-8/0．1 mL。

2．2 車前草對Hep-2細(xì)胞的毒性測定 不同濃度的車前草接種于單層Hep-2細(xì)胞后細(xì)胞皺縮，呈圓形或橢圓形，壁增厚，折光性增強(qiáng)，5 d后Hep-2細(xì)胞脫落、碎裂，懸浮在培養(yǎng)液表面，吸光度值下降。隨著車前草濃度的增加，對Hep-2細(xì)胞的毒性增強(qiáng)，死亡細(xì)胞數(shù)增加，細(xì)胞存活率下降。車前草和利巴韋林的 TC50分別為 4．57 g/L、0．38 g/L。

2．3 車前草對Hep-2細(xì)胞內(nèi)RSV增殖的抑制作用車前草實驗組CPE程度均低于病毒對照組，在濃度0．0625～8．0 g/L，隨著藥物濃度的增加，對 RSV 抑制率明顯增高 (表1)。車前草抑制 RSV的 IC50=0．285 g/L，比TC50值小，說明車前草的使用安全，TI為 16．04。利巴韋林注射液 IC50=0．0356 g/L ，TI為10．67，車前草的安全性比實驗用利巴韋林注射液高，車前草與利巴韋林對RSV在Hep-2細(xì)胞內(nèi)的增殖作用差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0．05)。

2．4 車前草對RSV吸附Hep-2細(xì)胞的抑制作用車前草濃度為 1．0 g/L時 Hep-2細(xì)胞 CPE達(dá)到50%，4．0 g/L時25%細(xì)胞出現(xiàn) CPE。

2．5車前草對RSV的直接殺傷作用 車前草濃度≥8．0 g/L時細(xì)胞生長良好，排列規(guī)則，僅有少量衰老細(xì)胞，病毒對照組CPE達(dá)到“++++”時，細(xì)胞內(nèi)顆粒物增多，細(xì)胞變大，脫落，說明車前草對RSV具有直接殺傷作用。

表1 車前草和利巴韋林對RSV增殖的抑制作用±s，n=4)

表1 車前草和利巴韋林對RSV增殖的抑制作用±s，n=4)

車前草 利巴韋林濃度/g·L-1 CPE細(xì)胞存活率/%濃度/g·L-1 CPE細(xì)胞存活率/%0．0625 ++++ 2．01±1．01 0．025 ++++ 7．85±3．22 0．125 +++ 15．2±1．31 0．05 +++17．38±1．56 0．25 ++ 34．12±3．25 0．1 ++ 35．32±2．32 0．5 + 65．16±4．12 0．2 ++ 46．34±2．71 1．0 + 90．13±2．67 0．4 + 83．43±4．31 2．0 ± 95．32±2．22 0．8 ± 93．78±1．55 4．0 - 96．67±2．31 1．6 - 97．63±1．12 8．0 - 100 3．2 - 100

圖1 車前草醇提液對RSV的吸附抑制和直接殺傷作用

3 討論

人類的傳染病約75%是由病毒引起的，但目前抗病毒的藥物非常有限，且療效不確定。中藥治療病毒感染性疾病尤其在免疫調(diào)節(jié)、抑制疾病的發(fā)展方面顯示出優(yōu)勢，其來源廣泛，價格便宜，毒性低，安全范圍廣，具有廣闊的應(yīng)用前景。實驗研究發(fā)現(xiàn)甘草、龍膽、敗醬草、連翹等對RSV有良好的抑制作用［3］。本實驗在體外細(xì)胞水平研究了車前草醇體液抗RSV的作用，實驗結(jié)果證實車前草使用安全，對RSV有明顯的抑制作用，與利巴韋林抗病毒效果無顯著性差異(P＞0．05)，細(xì)胞毒性比利巴韋林低，抗RSV指數(shù)比利巴韋林高，拓展了車前草的藥效。濃度在 0．0625～8．0 g/L，隨著車前草濃度的增加，對RSV的抑制率明顯增高，藥物在4．0 g/L時，CPE能完全抑制。

抗病毒藥物主要作用于病毒復(fù)制周期(吸附、穿入、脫殼、生物合成、裝配與釋放)某個或多個環(huán)節(jié)，達(dá)到抗病毒的目的。車前草能干擾病毒致病的多個環(huán)節(jié)，不僅能抑制病毒的增殖，也阻斷RSV感染和直接殺傷RSV，3組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。車前草能抑制RSV的吸附過程，可能是其活性成分與RSV競爭結(jié)合Hep-2細(xì)胞表面的特異性受體，導(dǎo)致RSV吸附能力降低;車前草抑制RSV生物合成的可能機(jī)制是其成分競爭病毒復(fù)制酶和/或反轉(zhuǎn)錄酶，從而抑制病毒DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程;車前草也能直接殺滅病毒，可能是由于車前草含有能破壞RSV包膜的有效成分或活性化合物。已有研究證實中藥能調(diào)節(jié)RSV感染引起的Th1/Th2失衡，抑制 IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ 的過表達(dá)來調(diào)控TLRS信號傳導(dǎo)通路達(dá)到抗RSV感染的效果［3-5］。下一步將提取車前草的活性成分，進(jìn)行各成分抗RSV研究，選擇有效成分結(jié)合體內(nèi)外實驗從細(xì)胞因子和蛋白、基因水平探索車前草的抗病毒機(jī)制。

［1］ Cramer H．Antisense approaches for inhibiting respiratory syncystial virus［J］．Expert Opin Biol Ther，2005，5:207-220．

［2］ 楊亞軍，周秋貴，曾紅，等．車前草化學(xué)成分及新生物活性研究進(jìn)展［J］．中成藥，2011，33:1771-1776．

［3］ 張沛，趙霞．中醫(yī)藥對呼吸道合胞病毒感染Th1、Th2漂移影響的研究進(jìn)展［J］．遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2010，12:38-40．

［4］ 李俊蓮，李艷彥，高鵬，等．麻黃加術(shù)湯對呼吸道合胞病毒感染小鼠血清IL-2，IFN-γ的影響［J］．中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19:196-199．

［5］ 李濤，戴啟剛，汪受傳．呼吸道合胞病毒與TLR3、TLR4的關(guān)系及其在中醫(yī)藥研究進(jìn)展［J］．中華中醫(yī)藥雜志，2014，29:211-213．