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    mRNA降解與血痕遺留時(shí)間相關(guān)性探索

    2015-11-28 00:57:28皮建華
    關(guān)鍵詞:血痕逆轉(zhuǎn)錄遺留

    龍 兵,羅 楊,皮建華,周 豪

    (1.四川警察學(xué)院 四川瀘州 646000;2.瀘州市公安局 四川瀘州 646000)

    案發(fā)時(shí)間的判斷對(duì)于案件的偵破具有十分重要的意義。血痕是現(xiàn)場非常常見的生物物證,通常能夠比較準(zhǔn)確地反映案發(fā)時(shí)間。血痕遺留時(shí)間的推斷一直是刑事科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)[1-4]。

    RNA是分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),同時(shí)受到法醫(yī)學(xué)研究者的關(guān)注。許多研究報(bào)道機(jī)體組織RNA會(huì)隨著死亡時(shí)間的延長而發(fā)生降解,降解與死亡時(shí)間具有一定的相關(guān)性[5-7]。這些研究大多以組織器官為研究對(duì)象,關(guān)于血痕RNA降解的研究相對(duì)較少。本次研究以管家基因β-actin和血液中特異性表達(dá)的HBB為目的基因,18s rRNA為內(nèi)參基因,探討血痕在離體72小時(shí)時(shí)間內(nèi)mRNA的降解情況。

    一、材料與方法

    (一)樣本。

    采集6名個(gè)體靜脈血(3名男性,3名女性),各1mL,EDTA抗凝。取20μL血液滴于吸水濾紙上,共制作42份樣本,室溫保存,分別于0.5h、2h、6h、12h、24h、48h、72h后提取RNA。

    (二)儀器與試劑。

    采用TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)提取RNA。采用Bioneer逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增采用的試劑盒為Roche公司FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)熒光定量試劑盒,擴(kuò)增儀器為AB-7500實(shí)時(shí)定量PCR儀。

    (三)方法。

    1.RNA抽提。剪取制作的血痕于1.5mL離心管,加入0.5mLTRIzol試劑,室溫下震蕩混勻5min,加0.1mL氯仿,混勻,放置3min; 12000g離心15min;取上清,加入250μL異丙醇,混勻,12000g離心10min;棄上清,加入75%乙醇1mL,7500g離心5min。棄上清,短暫室溫干燥,加入DEPC水溶解,-80保存。實(shí)驗(yàn)操作均在冰上進(jìn)行,離心均為-4℃低溫離心。

    2.RNA逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系為5μL模板RNA,基因特異性逆轉(zhuǎn)錄引物濃度為20pmol,總反應(yīng)體系為20μL。 反應(yīng)條件為50℃保溫1h,95℃變性5min。

    表1 逆轉(zhuǎn)錄基因特異性引物

    3.實(shí)時(shí)定量PCR。HBB、β-actin和18s rRNA的擴(kuò)增引物見表2。實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系:5μL SYBR Green,前后引物終濃度均為0.5μM,總反應(yīng)體系為10μL。

    表2 HBB、β-actin和18s rRNA擴(kuò)增引物

    擴(kuò)增條件為:

    ?

    (四)數(shù)據(jù)分析。

    以實(shí)時(shí)定量PCR的CT值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,分析軟件為Excel2007、GraphPad Prism5。

    二、結(jié)果

    (一)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

    聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染檢測PCR擴(kuò)增片段,片段大小與預(yù)期大小相符合,見圖1。

    圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖

    從左至右分別為Marker、18s rRNA、β-actin、HBB。

    (二)RNA降解與血痕遺留時(shí)間的相關(guān)性。

    獲得各樣本實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增CT值,HBB、18s rRNA、β-actin實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線見圖2。

    圖2 實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線

    從左至右分別為HBB、18s rRNA、β-actin。

    以18s rRNA為內(nèi)參計(jì)算ΔCT值,即ΔCT=CT(target mRNA)-CT(reference DNA)[8],建立ΔCT值與血痕遺留時(shí)間的相關(guān)性。結(jié)果顯示在72小時(shí)時(shí)間內(nèi),血痕β-actin、HBB基因mRNA具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性,mRNA降解與血痕遺留時(shí)間沒有相關(guān)性(p>0.05)。HBB、β-actin基因mRNA降解與血痕遺留時(shí)間的相關(guān)性見圖3、圖4。

    圖3 HBB基因mRNA降解與血痕遺留時(shí)間相關(guān)性(r=0.4325,p=0.3324)

    圖4 β-actin基因mRNA降解與血痕遺留時(shí)間相關(guān)性(r=0.3985,p=0.3759)

    三、討論

    RNA在細(xì)胞內(nèi)以多種形式存在,主要包括mRNA、tRNA、rRNA等。18s rRNA與核糖體蛋白緊密結(jié)合,受到核糖體蛋白的保護(hù),穩(wěn)定性強(qiáng),不易發(fā)生降解[9]。許炎等[10],在研究中發(fā)現(xiàn)血痕18s rRNA在8-15天都沒有發(fā)生明顯降解。研究中,我們以18s rRNA為內(nèi)參對(duì)HBB和β-actin兩個(gè)目的基因CT值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,能夠更加準(zhǔn)確的觀察血痕mRNA的降解情況,更好的反映mRNA降解與血痕遺留時(shí)間的相關(guān)性。

    許多研究報(bào)道機(jī)體死亡后細(xì)胞mRNA在數(shù)天甚至數(shù)小時(shí)內(nèi)發(fā)生快速降解[7,11]。我們在研究中發(fā)現(xiàn)血痕HBB和β-actin基因mRNA在72小時(shí)時(shí)間內(nèi)都保持了很強(qiáng)的穩(wěn)定性,這與機(jī)體在死亡后細(xì)胞mRNA降解有很大差異。我們認(rèn)為導(dǎo)致血痕mRNA降解速度慢的原因,一方面可能與血痕在濾紙上迅速干燥,RNA酶以及相關(guān)因子的活性降低有關(guān);另一方面,可能與實(shí)驗(yàn)環(huán)境相對(duì)理想化,受到外界的污染相對(duì)較小有關(guān)。該研究涉及的血痕遺留時(shí)間相對(duì)較短,在以后的研究中,我們將進(jìn)一步延長血痕遺留時(shí)間,同時(shí)探討溫度、濕度等因素對(duì)血痕RNA降解的影響。

    [1]Bremmer RH,De Bruin KG,Van Gemert MJ,et al.Forensic quest for age determination of bloodstains[J].Forensic science international,2012,216(1-3):1-11.

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