測(cè)序技術(shù)發(fā)展?fàn)顩r及相關(guān)專利分析

毛舒燕，梁婧文

測(cè)序技術(shù)發(fā)展?fàn)顩r及相關(guān)專利分析

毛舒燕*，梁婧文*

基因是生物體的遺傳信息載體，其遺傳和表達(dá)影響生物體的繁衍及各種生命活動(dòng)。對(duì)于人類而言，個(gè)體基因組DNA 序列突變往往會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生，獲取個(gè)體的基因組DNA 信息將有助于疾病的預(yù)防、診斷和治療［1］。正因如此，科學(xué)家們奉獻(xiàn)了無數(shù)心血研究 DNA 或RNA 測(cè)序技術(shù)，以期解密這些神奇的生命密碼。于此同時(shí)，基因測(cè)序所帶來的巨大經(jīng)濟(jì)利益也使得更多科研機(jī)構(gòu)和企業(yè)積極投身于這項(xiàng)改變世界的事業(yè)，企業(yè)乃至國(guó)家之間的競(jìng)爭(zhēng)愈演愈烈。

1 專利申請(qǐng)概況

1.1 DNA 測(cè)序技術(shù)全球?qū)＠暾?qǐng)趨勢(shì)

自 20世紀(jì) 80 年代，開始有 DNA 測(cè)序技術(shù)的相關(guān)專利申請(qǐng)?zhí)岢?。?WPI 數(shù)據(jù)庫(kù)中專利申請(qǐng)的最早優(yōu)先權(quán)日和最早公開日統(tǒng)計(jì)，自 1984 年起，全球 DNA 測(cè)序技術(shù)相關(guān)專利申請(qǐng)共計(jì) 1257 項(xiàng)；通過分類號(hào)和人工瀏覽去噪，針對(duì)測(cè)序方法、設(shè)備和試劑的專利申請(qǐng)共計(jì) 344 項(xiàng)（圖 1數(shù)據(jù)截至 2014 年 9 月 14 日）［2］；這期間出現(xiàn)了兩個(gè)高潮階段，主要集中在 1998 - 2004 年和 2006 - 2013 年，正好對(duì)應(yīng)了第二代和第三代測(cè)序技術(shù)的興起。

第一代測(cè)序技術(shù)出現(xiàn)于 20世紀(jì) 70 年代，專利申請(qǐng)相對(duì)較少，直至 1995 年第一臺(tái)測(cè)序儀上市以及人類基因組測(cè)序計(jì)劃的啟動(dòng)和進(jìn)行，人們逐漸意識(shí)到現(xiàn)有測(cè)序技術(shù)的不足之處，也認(rèn)識(shí)到測(cè)序技術(shù)在疾病診斷領(lǐng)域的巨大價(jià)值，專利的申請(qǐng)量逐漸增多。至 2000 年前后，第二代 DNA 測(cè)序技術(shù)興起，短時(shí)間內(nèi)的專利申請(qǐng)量急劇升高，指征著有關(guān)DNA 測(cè)序的核心技術(shù)或理念的出現(xiàn)，以及人們對(duì)于 DNA測(cè)序技術(shù)發(fā)展的集中關(guān)注。第三代 DNA 測(cè)序技術(shù)興起于2006 年后，相關(guān)專利產(chǎn)出量基本延續(xù)了 1998 - 2004 年之間的快速增長(zhǎng)趨勢(shì)，維持著較高的專利產(chǎn)出水平，反映出DNA 測(cè)序技術(shù)的研究熱度仍在延續(xù)。

圖1 近 30 年來全球測(cè)序技術(shù)相關(guān)專利年度申請(qǐng)量趨勢(shì)

圖2 DNA 測(cè)序技術(shù)全球重要專利技術(shù)產(chǎn)出地

1.2 DNA 測(cè)序技術(shù)專利產(chǎn)出分布

專利申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)國(guó)別/地區(qū)和最早申請(qǐng)國(guó)別/地區(qū)通常是該項(xiàng)專利技術(shù)的研發(fā)地，通?？烧J(rèn)為是該項(xiàng)技術(shù)的產(chǎn)出地，體現(xiàn)了各國(guó)家或地區(qū)的科研實(shí)力以及專利保護(hù)意識(shí)的強(qiáng)弱［2］。圖 2 展示了 DNA 測(cè)序技術(shù)的專利產(chǎn)出地分布情況，數(shù)據(jù)顯示，美國(guó)、日本、歐洲專利局（是指首次申請(qǐng)是通過歐洲專利局遞交，這部分專利申請(qǐng)主要來自歐盟國(guó)家）、英國(guó)和韓國(guó)的專利申請(qǐng)量分列全球前 5 位，其中美國(guó)的申請(qǐng)量遠(yuǎn)超過其他國(guó)家，占全球前十位國(guó)家總申請(qǐng)量的 57.8%，這說明 DNA 測(cè)序技術(shù)領(lǐng)域呈現(xiàn)出美國(guó)一家獨(dú)大的態(tài)勢(shì)。因此，做 DNA 測(cè)序技術(shù)相關(guān)的研發(fā)，對(duì)美國(guó)專利進(jìn)行分析和研究都是非常必要的。而我國(guó)在該領(lǐng)域?qū)＠暾?qǐng)量位列全球第 6，表明我國(guó)具有一定的科研能力，專利保護(hù)意識(shí)也在逐漸加強(qiáng)。

2 技術(shù)發(fā)展歷程

測(cè)序技術(shù)最早可以追溯到 20世紀(jì) 50 年代，早在1954 年就已經(jīng)出現(xiàn)了關(guān)于早期測(cè)序技術(shù)的報(bào)道，圖 3 展示了測(cè)序技術(shù)的基本發(fā)展歷程。

2.1 第一代測(cè)序技術(shù)——鏈終止法和化學(xué)降解法

2.1.1 鏈終止法 1975 年由桑格（Sanger）和考爾森（Coulson）開創(chuàng)了鏈終止法（dideoxy chain-termination method）。其核心原理是：由于 ddNTP 的 2' 和 3' 位都不含羥基，其在 DNA 的合成過程中不能形成磷酸二酯鍵，因此可以用來中斷 DNA 合成反應(yīng)，在 4 個(gè) DNA 合成反應(yīng)體系中分別加入一定比例帶有放射性同位素標(biāo)記的ddNTP，通過凝膠電泳和放射自顯影后可以根據(jù)電泳帶的位置確定待測(cè)分子的 DNA 序列［3］。

2.1.2 化學(xué)鏈降解法 1976 - 1977 年馬克西姆（Maxam）和吉爾伯特（Gilbert）發(fā)表了化學(xué)測(cè)序法（鏈降解），此項(xiàng)方法基于對(duì)核堿基特異性地進(jìn)行局部化學(xué)改性，接下來在改性核苷酸毗鄰的位點(diǎn)處 DNA 骨架發(fā)生斷裂，由于經(jīng)純化的 DNA 可被直接使用，馬克西姆-吉爾伯特測(cè)序法迅速得到了推廣。但由于其技術(shù)復(fù)雜、大量使用危險(xiǎn)藥品及難于擴(kuò)大規(guī)模的缺陷，逐漸被市場(chǎng)淘汰。

2.1.3 鳥槍法 1980 年，桑格又發(fā)明了“鳥槍法測(cè)序”，將大分子 DNA 片段隨機(jī)打斷成小片段，分別測(cè)序后，再利用小片段之間的重疊段進(jìn)行拼接，從而讀出原來的長(zhǎng)片段的序列［4］。該技術(shù)為第二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

第一代測(cè)序技術(shù)最大的貢獻(xiàn)在于，在 2001 年完成了首個(gè)人類基因組圖譜。但因其成本高、速度慢、通量低，且需要大量專業(yè)技術(shù)人員全程操作等不足，隨著時(shí)代的進(jìn)步，越來越無法滿足科學(xué)研究和生產(chǎn)應(yīng)用的需要。

2.2 第二代測(cè)序技術(shù)——邊合成邊測(cè)序

2.2.1 GS FLX 系統(tǒng) GS FLX 系統(tǒng)的關(guān)鍵技術(shù)在于單鏈DNA 結(jié)合在水油包被的直徑約 28 μm 的磁珠上進(jìn)行獨(dú)立的 PCR 反應(yīng)。其測(cè)序原理是基于焦磷酸測(cè)序法，通過檢測(cè)每一個(gè)聚合 dNTP 攜帶的熒光信號(hào)對(duì) DNA 序列進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。該技術(shù)核心專利申請(qǐng) WO02077287 于 1999 年提出（最早優(yōu)先權(quán)日），請(qǐng)求保護(hù)用于 DNA 測(cè)序的裝置和方法，對(duì)其核心技術(shù)進(jìn)行了全面的展示和披露。

2.2.2 Solexa 和 Hiseq系統(tǒng) Solexa 和 Hiseq 系統(tǒng)的關(guān)鍵技術(shù)在于利用單分子陣列實(shí)現(xiàn)在小型芯片（flow cell）上進(jìn)行橋式 PCR 反應(yīng)。在生成新 DNA 互補(bǔ)鏈時(shí)，由于新的可逆阻斷技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)每次只合成一個(gè)堿基，并標(biāo)記熒光基團(tuán)，再利用相應(yīng)的激光激發(fā)熒光基團(tuán)，捕獲激發(fā)光，從而讀取堿基信息［4］。該技術(shù)在專利申請(qǐng) WO9844151 中公開，專利申請(qǐng) WO0063437中主要對(duì)檢測(cè)熒光信號(hào)的方法進(jìn)行了保護(hù)。

2.2.3 SOLiD 系統(tǒng) SOLiD 系統(tǒng)則以四色熒光標(biāo)記寡核苷酸的連續(xù)連接合成為基礎(chǔ)，取代了傳統(tǒng)的聚合酶連接反應(yīng)，用連接法測(cè)序獲得基于“雙堿基編碼原理”的 SOLiD 顏色編碼序列，使得每一個(gè)堿基都被檢測(cè)兩次，提高了系統(tǒng)準(zhǔn)確性［4］。其核心專利申請(qǐng) US4811218、WO9001562 和WO200713706 分別在 1989 年和 2006 年提出，請(qǐng)求保護(hù)了用于 DNA 測(cè)序的設(shè)備和方法。

第二代測(cè)序技術(shù)是迄今為止發(fā)展最為成熟、使用最為廣泛的 DNA 高通量測(cè)序手段，在基因組大規(guī)模測(cè)序和基因診斷治療中功不可沒，但是其不足也日益凸顯，如讀長(zhǎng)較短，PCR 擴(kuò)增偏差等。在這種情況下，以單分子測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ)的第三代測(cè)序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。

2.3 第三代測(cè)序技術(shù)——單分子測(cè)序

圖3 DNA 測(cè)序技術(shù)發(fā)展歷程

2.3.1 并行單分子合成測(cè)序技術(shù) 該技術(shù)以 HelicosBiosciences 公司的 tSMSTM（true single molecular sequencing）技術(shù)平臺(tái)為代表，測(cè)序原理為：通過 DNA 剪切以及添加多聚 A 尾產(chǎn)生 DNA 片段，然后與固定在流動(dòng)單元的poly-T 寡核苷酸進(jìn)行雜交，對(duì)每個(gè)新添加的 dNTP 的熒光標(biāo)記進(jìn)行測(cè)序［5］。

2000 年至今，該公司申請(qǐng)基因測(cè)序相關(guān)專利申請(qǐng)多達(dá)51 項(xiàng)，涵蓋測(cè)序試劑、測(cè)序方法、測(cè)序設(shè)備、檢測(cè)方法等多個(gè)領(lǐng)域；相比于其他公司，該公司更側(cè)重于對(duì)測(cè)序試劑的改進(jìn)研發(fā)，相關(guān)專利申請(qǐng)達(dá) 13 項(xiàng)之多。雖然其專利申請(qǐng)進(jìn)入多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，但并沒有在中國(guó)進(jìn)行布局。

2.3.2 SMRT 技術(shù) SMRT 技術(shù)是基于邊合成邊測(cè)序的思想，進(jìn)行單分子實(shí)時(shí)測(cè)序，具體利用“零模式波導(dǎo)（zeromode wave-guides，ZMWs）”小孔測(cè)序芯片完成，該小孔直徑只有幾十個(gè)納米，激光無法直接穿過小孔，而會(huì)在小孔處發(fā)生衍射，通過檢測(cè)分散到各個(gè) ZMW 小孔的 DNA片段的熒光標(biāo)記來判定 dNTP 的種類［5］。

Pacific Biosciences 公司 SMRT 技術(shù)的核心專利申請(qǐng)為 WO2006083751，首次披露了測(cè)序所使用的芯片結(jié)構(gòu)和熒光信號(hào)檢測(cè)方法；專利申請(qǐng) WO2007019582、US2007206187、WO2007041342 分別對(duì)光學(xué)信號(hào)的監(jiān)測(cè)方法和系統(tǒng)、設(shè)備、反應(yīng)所使用的試劑進(jìn)行了改進(jìn)。2006 年后還有很多圍繞核心技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)的專利申請(qǐng)，分別涉及DNA 聚合酶的錨定連接、熒光信號(hào)檢測(cè)方法、熒光染料、反應(yīng)試劑等方面；2008 年專利申請(qǐng)量達(dá)到最高峰，全球范圍內(nèi)共 116 件。

2.3.3 納米孔單分子技術(shù) Oxford Nanopore Technologies公司研發(fā)的測(cè)序技術(shù)為水解測(cè)序法，其核心是基于納米孔單分子實(shí)時(shí)讀取技術(shù)，檢測(cè)單堿基短暫的影響流過納米孔的電流變化，從而檢測(cè)出 DNA 序列信息［5］。

Oxford Nanopore Technologies 公司自 2006 - 2007 年開始研發(fā)納米孔單分子測(cè)序技術(shù)，并在研究初期就提出專利申請(qǐng)，分別涉及脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)（WO2009077734）、能夠穿透脂質(zhì)雙分子層進(jìn)行電學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)的傳感器（WO2008102120）、核酸外切酶和孔的構(gòu)建體（WO2010004265）、核酸外切酶的改造（GB0901751D0）等；直至 2010 年才公開了其核心專利申請(qǐng) WO2010004273，具體保護(hù)了用于 DNA 測(cè)序的 Nanopore；并在此之后，逐步對(duì)其核心技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)完善，包括脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)的改進(jìn)、Nanopore 測(cè)序平臺(tái)、計(jì)算方法的改進(jìn)等。

2.3.4 基于 FRET的測(cè)序技術(shù) 基于熒光共振能量傳遞（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）的測(cè)序儀最初由 VisiGen Biotechnologies 公司開發(fā)，基本原理是先將被供體熒光基團(tuán)修飾的 DNA 聚合酶和 DNA 模板分子固定在固體表面，在被不同顏色的受體熒光基團(tuán)標(biāo)記的核苷酸摻入時(shí)，會(huì)釋放一個(gè) FRET 信號(hào)，使 DNA 分子發(fā)光，而發(fā)光的顏色則提示了堿基的類別［5］。涉及該技術(shù)的專利申請(qǐng)共 7 件，公開號(hào)為：WO2004059011、US7906280、US2007202521、KR20110132131、US2012219961、WO2011090745、WO0125480，申請(qǐng)人來自多個(gè)公司，其中僅有一件醫(yī)療生物系統(tǒng)有限公司的專利申請(qǐng) CN1391615進(jìn)入中國(guó)。

2.3.5 半導(dǎo)體測(cè)序技術(shù) 2010 年底 Ion Torrent 公司推出了一種基于半導(dǎo)體芯片的新一代革命性測(cè)序平臺(tái)—— Ion Torrent PGM。該測(cè)序平臺(tái)的技術(shù)核心為離子流半導(dǎo)體技術(shù)，即使用了一種布滿小孔的高密度半導(dǎo)體芯片，一個(gè)小孔就是一個(gè)測(cè)序反應(yīng)池，當(dāng) DNA 聚合酶把核苷酸聚合到延伸中的 DNA 鏈上時(shí)，會(huì)釋放出一個(gè)氫離子，反應(yīng)池中的 pH 發(fā)生改變，從而讀出 DNA 序列［6］。其測(cè)序過程是通過檢測(cè)H+信號(hào)的變化來獲得序列的堿基信息。該技術(shù)核心專利申請(qǐng) 5 件，公開號(hào)為 WO2010016937、WO2010138188、WO2010138187、WO2010047804、WO2010008480，涵蓋遞送試劑的流控系統(tǒng)、多步驟電化學(xué)反應(yīng)的裝置、中心測(cè)序裝置、分析裝置、減噪方法等各個(gè)技術(shù)領(lǐng)域，并有 4 件核心專利申請(qǐng)進(jìn)入中國(guó)。

通過上述第三代測(cè)序技術(shù)介紹可以看出，第三代測(cè)序技術(shù)因?yàn)椴恍枰蕾?PCR 擴(kuò)增，克服了 PCR 對(duì)測(cè)序的影響，很好地解決了第二代測(cè)序技術(shù)難以克服的重復(fù)片段的測(cè)序問題，技術(shù)優(yōu)勢(shì)明顯，擁有更廣闊的應(yīng)用前景。

2.4 第三代測(cè)序技術(shù)比較

圖4 第三代測(cè)序技術(shù)主要申請(qǐng)人分析

對(duì)上述第三代測(cè)序技術(shù)持有者的專利申請(qǐng)情況和其進(jìn)入中國(guó)的專利申請(qǐng)數(shù)量（項(xiàng)）進(jìn)行總結(jié)和比較發(fā)現(xiàn)（以上專利申請(qǐng)的檢索均在 Sipoabs 數(shù)據(jù)庫(kù)中完成，以申請(qǐng)人為檢索入口），大部分技術(shù)的核心專利申請(qǐng)都進(jìn)入中國(guó)，但進(jìn)入中國(guó)的專利申請(qǐng)占其專利申請(qǐng)總量比例較?。▓D 4）。Pacific Biosciences 公司無疑成為了第三代測(cè)序技術(shù)中的龍頭老大，而專利申請(qǐng)數(shù)量不多的 Ion Torrent 也獲得了較高的市場(chǎng)占有量，這同各個(gè)測(cè)序技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)、適用范圍、測(cè)序成本都有著密不可分的關(guān)系，表 1 詳細(xì)比較了第三代測(cè)序技術(shù)的性能和優(yōu)缺點(diǎn)。

表1 第三代測(cè)序技術(shù)性能比較

表2 三代測(cè)序技術(shù)適用范圍比較

表3 主流測(cè)序平臺(tái)的測(cè)序成本比較

2.5 三代測(cè)序技術(shù)總結(jié)

表 2 選取代表性測(cè)序方法和平臺(tái)對(duì)比了三代測(cè)序技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)和適用范圍（第三代測(cè)序方法以 Ion Torrent 為例），該表反映出測(cè)序技術(shù)的發(fā)展脈絡(luò)和方向，也體現(xiàn)了測(cè)序技術(shù)應(yīng)用的新需求，由大規(guī)?；蚪M測(cè)序到小規(guī)模染色體、轉(zhuǎn)錄組、直至具體基因的測(cè)序。而若要將測(cè)序技術(shù)推廣應(yīng)用于疾病診斷，由患者買單，那么如何降低測(cè)序成本就成為了開發(fā)者必須攻克的難關(guān)。通過總結(jié)目前市場(chǎng)主流測(cè)序平臺(tái)的測(cè)序成本（表 3），也不難看出為何 Ion Torrent 能從第三代測(cè)序技術(shù)中脫穎而出，其測(cè)序成本的低廉無法不受到市場(chǎng)的青睞。

3 主要申請(qǐng)人分析

由圖 2 可看出，測(cè)序技術(shù)領(lǐng)域主要被國(guó)外申請(qǐng)人所占據(jù)，國(guó)內(nèi)申請(qǐng)人涉足此行業(yè)時(shí)間較短，多為購(gòu)買國(guó)外儀器設(shè)備進(jìn)行下游應(yīng)用和開發(fā)。因此，選取在測(cè)序技術(shù)領(lǐng)域占據(jù)龍頭地位的 Illumina、一直期望兼并 Illumina 并與之抗衡的Roche 和第三代測(cè)序儀的成功代表 Ion Torrent 作為重點(diǎn)申請(qǐng)人，對(duì)其技術(shù)開發(fā)歷程、專利申請(qǐng)情況、市場(chǎng)份額進(jìn)行如下分析。

3.1 Illumina

Illumina 公司成立于 1998 年，最初是以基因分型和微列陣為主要技術(shù)和研發(fā)方向。經(jīng)過 16 年的發(fā)展，該公司2014 年被評(píng)為“全球創(chuàng)新企業(yè) 50 強(qiáng)”。到目前為止，其擁有了基因組測(cè)序儀市場(chǎng) 70% 的份額，是名副其實(shí)的測(cè)序儀大鱷。作為創(chuàng)新企業(yè)榜首的 Illumina 公司非常重視其在全球范圍內(nèi)的專利布局，不僅通過自主研發(fā)獲得專利技術(shù)，頻繁的收購(gòu)活動(dòng)也使其積累了大量的專利技術(shù)財(cái)富。其中最重要的一次收購(gòu)即為 2007 年斥資 6 億美元購(gòu)買了擁有先進(jìn)基因測(cè)序技術(shù)的 Solexa 公司，收獲了其全部測(cè)序技術(shù)專利，并因此推出了其第一代的 Genome Analyzer 測(cè)序系統(tǒng)。隨后，又陸續(xù)收購(gòu)了生產(chǎn)基因測(cè)序試劑的 Epicentre 公司（2011 年）、專注于染色體篩選診斷的 Bluegnome 公司（2012 年）、專注于繁殖和遺傳健康的 Verinata 公司（2013年）、專注微流樣品處理的 Advanced Liquid Logic 公司（2013 年）、專注于基因組信息學(xué)的 NextBio 公司（2013年）［7］。

截至 2014 年 3 月，在 Sipoabs 數(shù)據(jù)庫(kù)中，申請(qǐng)人Illumina 公司，包括其收購(gòu)的其他公司，全球共申請(qǐng) 11259 件專利，專利數(shù)量呈逐年穩(wěn)定增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，并在美國(guó)、歐洲、中國(guó)均有專利布局。就專利技術(shù)領(lǐng)域分布而言，其專利涉及液滴操作、射流裝置、測(cè)試樣品儲(chǔ)存器件、測(cè)序系統(tǒng)、測(cè)試成像方法、樣品加熱器件、數(shù)據(jù)分析方法、核苷酸合成等與測(cè)序平臺(tái)相關(guān)的全方位的技術(shù)領(lǐng)域，完美體現(xiàn)了其技術(shù)的全面性及相應(yīng)的知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)的全面性。2010 年以后，Illumina相繼推出了升級(jí)后的 HiSeq 2000、HiSeq 2500 以及新一代小型 Miseq 高性能測(cè)序儀，進(jìn)一步降低了測(cè)序成本，使得1000 美元測(cè)出全基因組序列成為可能。其中 Miseq 高性能測(cè)序儀更是因其卓越的性能和小型化的優(yōu)勢(shì)，使其應(yīng)用領(lǐng)域更加寬廣，受到更多非實(shí)驗(yàn)室用戶的追捧。具有這些技術(shù)上的優(yōu)勢(shì)，就不難解釋，Illumina 為何能夠坐擁基因組測(cè)序儀市場(chǎng) 70% 的份額，并讓其最大的競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手羅氏（Roche）不惜重金想要將其收入麾下［8］。

3.2 Roche

相比 Illumina，Roche 在測(cè)序技術(shù)領(lǐng)域的開拓則沒有那么順利。2007 年 3 月，羅氏診斷（Roche Diagnostics）與CuraGen 公司簽訂協(xié)議，以 1.55 億美元的現(xiàn)金和股票收購(gòu)454 Life Science——超高通量基因組測(cè)序系統(tǒng) Genome Sequencer 20 System 的擁有者。由于 GS FLX 測(cè)序系統(tǒng)具備高通量、高靈敏度、讀長(zhǎng)較長(zhǎng)、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，其甫一問世就獲得廣泛關(guān)注；但由于其高昂的使用費(fèi)用，推廣應(yīng)用受到局限。自 2008 - 2009 年，以 Heliscope、Nanopore、Ion Torrent 等為代表的第三代測(cè)序技術(shù)興起，其讀長(zhǎng)可達(dá)1000 bp，準(zhǔn)確率為 96% ～ 98%，測(cè)序通量較 GS FLX 小，但其每循環(huán)的耗時(shí)大大縮短，測(cè)序費(fèi)用也更為低廉，這對(duì)GS FLX 測(cè)序市場(chǎng)造成了較大沖擊。羅氏雖沒有透露 454業(yè)務(wù)的收入情況，但隨著第三代測(cè)序技術(shù)銷量的上升，454測(cè)序儀已經(jīng)被推到了市場(chǎng)邊緣。2013 年起，羅氏公司開始關(guān)閉 454 生命科學(xué)測(cè)序業(yè)務(wù)，并表示“454 測(cè)序儀將在2016 年被逐步淘汰”。

自 2010 年起，羅氏開始追趕新一輪的測(cè)序技術(shù)浪潮，與 IBM 和 DNA Electronics 結(jié)成聯(lián)盟，并在 2012 年初敵意收購(gòu) Illumina，不過 Illumina 拒絕了該收購(gòu)要約；同年底，羅氏再次同 Illumina 進(jìn)行協(xié)商，但交易仍未達(dá)成。羅氏與 IBM 和 DNA Electronics 的合作也并不長(zhǎng)久，2013年即宣布結(jié)束，并停止了在半導(dǎo)體測(cè)序和納米孔測(cè)序技術(shù)上的研發(fā)努力。

種種挫折并沒有打消羅氏對(duì)測(cè)序新技術(shù)的追求渴望，并更加堅(jiān)定地確信測(cè)序技術(shù)將在未來的生命科學(xué)和診斷領(lǐng)域扮演至關(guān)重要的角色。2013 年 9 月，羅氏與 Pacific Biosciences 達(dá)成協(xié)議，投資高達(dá) 7500 萬(wàn)美元與 Pacific Biosciences 合作開發(fā)以 PacBio SMRT 技術(shù)為基礎(chǔ)的診斷產(chǎn)品。2014 年 6 月 2 日，羅氏宣布將以 1.25 億美元的現(xiàn)金和高達(dá) 2.25 億美元的里程碑費(fèi)用收購(gòu)美國(guó)納米孔測(cè)序公司的 Genia Technologies。

截至 2014 年 9 月，在 Sipoabs 數(shù)據(jù)庫(kù)中，以申請(qǐng)人ROCHE +、關(guān)鍵詞 sequenc + 為入口、以申請(qǐng)人 454 life tech+、Genia 為入口進(jìn)行檢索發(fā)現(xiàn)，羅氏所擁有的 DNA 測(cè)序相關(guān)專利申請(qǐng)共有 103 項(xiàng)，核心專利全部進(jìn)入中國(guó)。而其擁有的第三代 Genia 測(cè)序技術(shù)實(shí)質(zhì)為單分子納米孔測(cè)序方法，有望降低測(cè)序成本，并提高測(cè)序的速度、準(zhǔn)確性和靈敏度。

3.3 Ion Torrent

2010 年 10 月，美國(guó)《福布斯》雜志以封面文章報(bào)道了 Ion Torrent 公司企業(yè)家喬納森·羅森伯格（Jonathan Rothberg）和他發(fā)明的基因解碼器（decoder）。這種基于硅芯片的個(gè)人染色體檢測(cè)儀（personal genome machine，PGM）是當(dāng)今世上體積最小、檢測(cè)成本最低的上市產(chǎn)品，可在 2 h之內(nèi)，高精度解讀 1000 萬(wàn) nt，這款儀器的售價(jià)僅為 5 萬(wàn)美元，是目前常用測(cè)序儀售價(jià)的 1/10。2011 年 5 月德國(guó)腸出血性大腸桿菌疫情爆發(fā)，華大基因組的科學(xué)家僅用三天的時(shí)間就完成了對(duì)這種新型細(xì)菌的基因組測(cè)序和分析，該項(xiàng)目的負(fù)責(zé)人稱，快速測(cè)序很大程度上得益于第三代測(cè)序儀Ion Torrent［4］。作為一家創(chuàng)業(yè)公司，Ion Torrent 非常重視其核心技術(shù)的知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)，在 Sipoabs 數(shù)據(jù)庫(kù)中，以申請(qǐng)人為入口進(jìn)行檢索，在從 2007 年到 2010 年 3 年間共申請(qǐng)了 11 項(xiàng) 45 件專利，其中有發(fā)明專利 7 項(xiàng)，多項(xiàng)專利申請(qǐng)分別進(jìn)入了美國(guó)、英國(guó)、中國(guó)、日本、印度、新加坡等國(guó)。也正是因?yàn)榭瓷掀鋵氋F的專利技術(shù)資源，生物產(chǎn)業(yè)巨擘生命技術(shù)公司（Life Technologies）于 2013 年 8 月用價(jià)值3.75 億美元的資金和股票收購(gòu)了 Ion Torrent。2014 年 2 月3 日 Thermo Fisher 宣布收購(gòu)了生命技術(shù)公司。

4 我國(guó)測(cè)序技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀

作為生物基因產(chǎn)業(yè)鏈最上游的產(chǎn)業(yè)，基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展必將起到龍頭作用，不斷推動(dòng)下游基因應(yīng)用產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，隨著基因檢測(cè)與醫(yī)療診斷的結(jié)合，其市場(chǎng)價(jià)值更是空前的高漲，成為各個(gè)國(guó)家及大型企業(yè)積極投資和發(fā)展的重要領(lǐng)域。

4.1 國(guó)內(nèi)測(cè)序技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀

從上文的分析我們可以看出，新一代的高通量測(cè)序技術(shù)的研究開發(fā)和應(yīng)用都被少數(shù)幾家歐美公司所壟斷，國(guó)內(nèi)涉足此行業(yè)的機(jī)構(gòu)多為購(gòu)買國(guó)外大公司的儀器設(shè)備進(jìn)行測(cè)序，具有中國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新一代高通量低成本測(cè)序技術(shù)系統(tǒng)的研發(fā)較為薄弱（以下專利申請(qǐng)的檢索均在 Sipoabs 數(shù)據(jù)庫(kù)中完成，以申請(qǐng)人為檢索入口）。

4.1.1 華大基因 做為國(guó)內(nèi)測(cè)序企業(yè)的龍頭老大，華大基因擁有 137 臺(tái) Illumina HiSeq 2000 測(cè)序儀、27 臺(tái) ABI SOLiDTM4.0 System、羅氏 454 測(cè)序平臺(tái)和最新的 Ion Torrent 測(cè)序平臺(tái)，與美國(guó) Broad 研究所、英國(guó) Sanger 中心一起成為公認(rèn)的世界最強(qiáng)的三大基因組研究機(jī)構(gòu)［4］。雖然華大基因的主要測(cè)序平臺(tái)都購(gòu)自國(guó)外公司，但其技術(shù)優(yōu)勢(shì)在于擁有自主開發(fā)的數(shù)據(jù)分析軟件。截至 2014 年 8 月，華大基因擁有測(cè)序拼接、注釋、糾錯(cuò)相關(guān)的核心技術(shù)專利12 件，涉及文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序方法、數(shù)據(jù)分析的專利更是多達(dá)上百件，其中 PCT 申請(qǐng) 32件，使其在序列分析領(lǐng)域的力量不容小覷。與此同時(shí)，華大基因并沒有放棄測(cè)序儀領(lǐng)域的知識(shí)產(chǎn)權(quán)占有和開發(fā)，2013 年華大基因斥資收購(gòu)美國(guó)Complete Genomics 公司的全部知識(shí)產(chǎn)權(quán)，以及 Life Tech公司的 Ion Proton 系統(tǒng)，進(jìn)而推出了 BGISEQ-1000 和BGISEQ-100 兩款儀器，這兩款儀器均已通過 CFDA 批準(zhǔn)用于臨床診斷。

4.1.2 華因康基因科技技術(shù)有限公司 同樣創(chuàng)立于深圳的華因康基因科技技術(shù)有限公司也積極投入新一代高通量基因測(cè)序系統(tǒng)研發(fā)。該公司研發(fā)的高通量測(cè)序技術(shù)平臺(tái)SeqExpert-IIIA 測(cè)序儀及 PSTAR-II 系列高通量基因測(cè)序系統(tǒng)，擁有 7 項(xiàng)美國(guó)專利，3 項(xiàng) PCT 國(guó)際專利，16 項(xiàng)中國(guó)專利以及 22 項(xiàng)計(jì)算機(jī)軟件著作權(quán)［9］。上述專利申請(qǐng)涵蓋了測(cè)序儀、測(cè)序控制系統(tǒng)、測(cè)序方法及應(yīng)用、生物樣品制備、生化試劑等多個(gè)技術(shù)項(xiàng)目，代表了目前國(guó)內(nèi)最先進(jìn)的測(cè)序技術(shù)，得以在新一輪的技術(shù)及市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)中與國(guó)際知名的基因產(chǎn)業(yè)大鱷相抗衡。

4.1.3 中國(guó)科學(xué)院基因組所 2013 年中國(guó)科學(xué)院基因組所和紫鑫藥業(yè)合作開發(fā)的第二代高通量測(cè)序系統(tǒng)項(xiàng)目正式簽訂了投資意向協(xié)議，意欲打造“中國(guó)芯”的測(cè)序系統(tǒng)，雖然該系統(tǒng)尚未面世，但其已經(jīng)開始專利的布局。2012 - 2014年，共申請(qǐng)測(cè)序儀及其相關(guān)系統(tǒng)的核心專利 10 件，其中9 件都已經(jīng)獲得中國(guó)國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專利局的授權(quán)。

4.2 測(cè)序技術(shù)應(yīng)用企業(yè)現(xiàn)狀

盡管我國(guó)擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的基因測(cè)序公司較少，但是利用測(cè)序技術(shù)，尋求下游應(yīng)用技術(shù)市場(chǎng)的企業(yè)比較多。我國(guó)作為全球人口最多的國(guó)家，在這一領(lǐng)域也表現(xiàn)出了巨大的市場(chǎng)潛力。單就產(chǎn)前診斷這一應(yīng)用領(lǐng)域的市場(chǎng)，據(jù)估算就在150 億元左右。2013 年華大基因、貝瑞合康在無創(chuàng)產(chǎn)前篩查領(lǐng)域分別測(cè)序 10 萬(wàn)人次和 5 萬(wàn)人次，占據(jù)了大部分市場(chǎng)份額。除此之外，安諾優(yōu)達(dá)、銳博生物、達(dá)安基因等依托測(cè)序技術(shù)的企業(yè)，共同分享著中國(guó)巨大的基因診斷市場(chǎng)。另外，美吉生物、諾禾致源則利用國(guó)外的測(cè)序系統(tǒng)，依托各自的生物信息分析能力，為更大范圍的科研、臨床醫(yī)學(xué)［10］、衛(wèi)生檢疫、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域提供測(cè)序、生物信息分析等服務(wù)［4］。

4.3 挑戰(zhàn)和機(jī)遇

盡管就現(xiàn)有的測(cè)序技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀來看，我國(guó)的測(cè)序技術(shù)研發(fā)相對(duì)落后、行業(yè)規(guī)模較小、技術(shù)力量薄弱，關(guān)鍵技術(shù)均被國(guó)外申請(qǐng)人牢牢把握、占領(lǐng)，但是，這并不意味著我國(guó)的測(cè)序技術(shù)沒有發(fā)展空間。高通量測(cè)序技術(shù)不僅涉及生物學(xué)一個(gè)科學(xué)領(lǐng)域，還涉及納米加工技術(shù)、微體積溶液控制、高速分子化學(xué)反應(yīng)、高通量成像、計(jì)算軟件、數(shù)據(jù)壓縮、數(shù)據(jù)處理等多個(gè)領(lǐng)域的最新技術(shù)［11-12］。因此，在更快、更準(zhǔn)、更廉價(jià)的技術(shù)發(fā)展要求下，我國(guó)的科研機(jī)構(gòu)和企業(yè)大可以放開手腳、另辟蹊徑，從以上多領(lǐng)域入手，多維度改進(jìn)現(xiàn)有基因測(cè)序技術(shù)和基因測(cè)序平臺(tái)，并積極申請(qǐng)專利，掌握自主的核心知識(shí)產(chǎn)權(quán)。在下游應(yīng)用方面，提高數(shù)據(jù)處理能力、積極開發(fā)數(shù)據(jù)處理軟件及基因診斷產(chǎn)品將成為科研機(jī)構(gòu)和企業(yè)的主攻方向，對(duì)測(cè)序結(jié)果的精確解讀將會(huì)帶來更多更廣的收益。因此，在測(cè)序技術(shù)下游，如科研服務(wù)、臨床診斷、衛(wèi)生防疫、健康保險(xiǎn)、司法鑒定、食品安全、生物能源等多個(gè)領(lǐng)域占領(lǐng)市場(chǎng)也不失為一個(gè)明智的選擇。

［1］Cai XJ， Zhu H， Kong FQ， et al. The developments and challenges of DNA sequencing technologies. Prog Mod Biomedicine， 2013， 13（20）：3981-3984. （in Chinese）

蔡曉靜， 朱煌， 孔繁琪， 等. DNA測(cè)序技術(shù)的進(jìn)展和挑戰(zhàn). 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展， 2013， 13（20）：3981-3984.

［2］Yang TJ. Patent analysis practice manual. Beijing： Intellectual Property Publishing House， 2012. （in Chinese）

楊鐵軍. 專利分析實(shí)務(wù)手冊(cè). 北京： 知識(shí)產(chǎn)權(quán)出版社， 2012.

［3］Sun HX， Wang XJ. The development and future perspectives of DNA sequencing technology. e-Sci Technol Application， 2009（3）：19-29. （in Chinese）

孫海汐， 王秀杰. DNA測(cè)序技術(shù)發(fā)展及其展望. 科研信息化技術(shù)與應(yīng)用， 2009（3）：19-29.

［4］Chen XL. The developments and challenges of DNA sequencing technologies. Technol Rev， 2011（7）：106-111. （in Chinese）陳曉蕾. DNA測(cè)序風(fēng)云錄. 科技創(chuàng)業(yè)， 2011（7）：106-111.

［5］Zhang DF， Ma QY， Yin TM， et al. The third generation sequencing technology and its applicatian. China Biotechnol， 2013， 33（5）：125-131. （in Chinese）

張得芳， 馬秋月， 尹佟明， 等. 第三代測(cè)序技術(shù)及其應(yīng)用. 中國(guó)生物工程雜志， 2013， 33（5）：125-131.

［6］Zhu YH， He SX， Wang XC， et al. New generation sequencing technology to personalized medicine： Ion Torrent. Lett Biotechnol，2013， 24（4）：587-591. （in Chinese）

朱艷慧， 賀樹香， 王曉春， 等. 通往個(gè)性化醫(yī)療的新一代測(cè)序技術(shù)：Ion Torrent. 生物技術(shù)通訊， 2013， 24（4）：587-591.

［7］Zheng MQ， Xie HX. The patents analysis and revelation of Illumina.

China Invention Patent， 2014（7）：36-39. （in Chinese）

鄭木青， 謝虹霞. 基因巨頭Illumina公司專利分析及啟示. 中國(guó)發(fā)明與專利，2014（7）：36-39.

［8］Tan H. Exceptionally lively of sequencing technologies. Founder，2012（12）：100-101. （in Chinese）

譚洪. 基因測(cè)序分外熱鬧. 創(chuàng)業(yè)家， 2012（12）：100-101.

［9］Sheng J. Bioengineering： the development of domestic highthroughput gene sequencing instrument. China Venture Capital，2011（6）：42-45. （in Chinese）

盛江. 生物工程： 國(guó)產(chǎn)高通量基因測(cè)序儀的產(chǎn)業(yè)發(fā)展. 中國(guó)科技投資， 2011（6）：42-45.［10］Zheng L， Xiong T， Wang Q. High throughput-next generation sequencing technology—the challenges and opportunities for laboratory medicine. J Mol Diagn Ther， 2011， 3（6）：361-367. （in Chinese）

鄭磊， 熊鐵， 王前. 新一代高通量測(cè)序技術(shù)——檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)發(fā)展的挑戰(zhàn)與機(jī)遇. 分子診斷與治療雜志， 2011， 3（6）：361-367.

［11］Zhang WL. Status and challenges on data analysis of high throughput sequencing. J Integration Technol， 2012， 1（3）：20-24. （in Chinese）

張文力. 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析現(xiàn)狀與挑戰(zhàn). 集成技術(shù)， 2012， 1（3）：20-24.

［12］Zhu ZX， Zhang YP， You ZH， et al. Advances in the compression of high-throughput DNA sequencing data. J ShenZhen Univ Sci Eng，2013， 30（4）：409-415. （in Chinese）

朱澤軒， 張永朋， 尤著宏， 等. 高通量 DNA測(cè)序數(shù)據(jù)壓縮研究進(jìn)展. 深圳大學(xué)學(xué)報(bào)理工版， 2013， 30（4）：409-415.

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.03.015

100190 北京，國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作北京中心醫(yī)藥生物部生物工程一室

毛舒燕，Email：maoshuyan@sipo.gov.cn

2015-02-03

*同為第一作者