抗丙型肝炎藥物研究進展
——藥物、靶點和耐藥性

石星，葛慶華，岑山

綜述

抗丙型肝炎藥物研究進展
——藥物、靶點和耐藥性

石星，葛慶華，岑山

丙型肝炎為丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）引起的全球性傳染病。目前全球感染率約為 3%，感染者約2 億人［1］。我國在 2010 年公布了一般人群的血清抗 HCV陽性率為 0.43%。丙型肝炎以輸血為主要傳播途徑。15% ～40% 的感染者 6 個月內(nèi)感染癥狀可自行消失［2-3］，剩余60% ～ 85% 發(fā)展為慢性丙型肝炎［4］，其中約 20% 的慢性丙型肝炎患者在慢性感染 HCV 后 20 年左右的時間內(nèi)發(fā)展為肝硬化甚至肝臟衰竭或 HCV 相關(guān)的肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）［5］。目前丙型肝炎的預防尚無疫苗可用。早期最有效的丙型肝炎標準治療方案是聚乙二醇（PEG）化干擾素 α（PEG-IFN-α）與利巴韋林（ribavirin，RBV）聯(lián)合應用 24 ～ 48 周，但只有 40% ～ 50% 的基因型為 1 型患者和約 80% 的基因型為 2 或 3 型患者得到有效治愈［6-8］。2011 年，新的標準三聯(lián)療法獲美國 FDA 認證，該療法在傳統(tǒng)抗丙型肝炎標準方案（PEG-IFN-α 和利巴韋林聯(lián)合用藥）基礎上加入了兩種新批準的蛋白酶抑制劑中的一種，使得對 HCV 基因 1 型感染治愈率提高到約70%［9-10］，但是其副反應、抗藥性以及藥物間相互作用等問題依然嚴重［11］。

1 抗丙型肝炎病毒藥物和靶點

丙型肝炎病毒為有包膜單股正鏈 RNA 病毒，屬黃病毒科丙型肝炎病毒屬（Flaviviridae hepacivirus）。根據(jù)其基因序列的差異程度分為 7 個基因型以及多個亞型。HCV 基因組全長約為 9.6 kb，僅含有一個大的開放讀碼框，編碼大約 3000 個氨基酸殘基的多蛋白前體。該蛋白前體由宿主或病毒的水解酶加工成 10 個成熟的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白，從N 端到 C 端依次為 Core、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和 NS5B。HCV 生活周期大致包括病毒吸附、進入細胞、脫衣殼、病毒多蛋白翻譯、剪切、復制復合物組裝、病毒基因組復制、病毒顆粒組裝、成熟和釋放等幾個環(huán)節(jié)。理論上，HCV 生活周期的每一步都可以成為藥物靶點［12］。目前，抗 HCV 藥物的靶點多選擇病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白，如 NS2、NS3、NS4A、NS5A 和 NS5B。NS2/3 蛋白水解酶負責 NS2 和 NS3 的分子內(nèi)切割。切割釋放后的NS2 以反式作用的方式與 NS5A 系統(tǒng)作用參與感染性病毒顆粒的形成。NS3 則在切割后其 N-端具有絲氨酸蛋白酶活性得以釋放，可切開 NS3/4A、NS4A/4B、NS4B/5A、NS5A/5B 的連接部位，使得非結(jié)構(gòu)蛋白成熟。NS3 C 端結(jié)構(gòu)域具有的 NTP 酶（NTPase）和 RNA 解旋酶活性為HCV 復制所必需。NS4A 為疏水性蛋白，由 54 個氨基酸組成，可與 NS3 的 N 端絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合，穩(wěn)定NS3 的蛋白酶構(gòu)型，NS3/4A 可切割宿主抗病毒天然免疫中關(guān)鍵蛋白。NS5A 為多功能高度磷酸化蛋白，其參與了病毒復制復合物的形成、病毒的產(chǎn)生及釋放和干擾細胞內(nèi)重要信號通路等。NS5B 分子量為 68 kD，為 RNA 依賴的 RNA聚合酶（RdRp），主要生物學功能為合成 HCV 基因組或與之互補的負鏈 RNA。

目前已有多種直接作用病毒和以宿主為靶點的藥物進入臨床前階段或正在進行臨床試驗。直接作用抗病毒藥物（direct-acting agent，DAA）主要通過抑制 HCV 編碼的酶或蛋白的功能來發(fā)揮抗病毒作用。宿主靶向藥物（host-targeting agents，HTAs）是通過增強宿主天然免疫或干預發(fā)病機制所需的宿主因素，間接影響 HCV 復制的一類藥物。

抗丙肝病毒藥物療效的評價指標主要包括快速病毒學應答（rapid virological response，RVR）、早期病毒學應答（early virological response，EVR）和持續(xù)病毒應答（sustained virological response，SVR）［13-14］。RVR、EVR 和 SVR 一般分別代表抗病毒治療第 4 周、12 周、治療結(jié)束及隨訪期間的病毒學應答。RVR 指治療 4 周時血清 HCV RNA 的PCR 結(jié)果陰性，SVR 指血清 HCV RNA 在治療結(jié)束及隨訪期間 PCR 檢查均陰性。SVR12 指治療終點后 12 周隨訪時 HCV RNA 陰性（一般應用于 FDA 接受的臨床試驗終點）。本文主要對已經(jīng)進入臨床階段的藥物進行總結(jié)。

2 直接作用抗病毒藥物

2.1 NS3/4A 蛋白酶抑制劑

此類藥物主要為多肽模擬物，作用靶點為 HCV NS3/4A蛋白酶活性位點，目前已研發(fā)到第二代。藥物通過與NS3/4A 的結(jié)合阻斷其剪切病毒多蛋白，影響病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的成熟。該類抑制劑在服用數(shù)天后可使 HCV RNA 下降3.5 ～ 4.5 log10IU/ml。特拉瑞韋（telaprevir）、波普瑞韋（boceprevir）、司美匹韋（simeprevir，TMC435）和 faldaprevir（圖 1）為第一代 NS3/4A 蛋白酶抑制劑，前三種藥物已經(jīng)獲得美國 FDA 認證，faldaprevir 的研究也已進入臨床III 期階段。

特拉瑞韋和波普瑞韋對基因 1 型 HCV 產(chǎn)生 SVR 比率分別提高到 75% 和 67%。司美匹韋單獨給藥 150 mg/d或與 IFN/RBV 聯(lián)合應用，SVR24（治療后 24 周持續(xù)病毒應答）分別為 67% ～ 80% 和 81% ～ 86%，而 IFN/RBV 組只有 23%［15］。雖然 NS3/4A 蛋白酶抑制劑的加入大幅度提高了 IFN/RBV 的 SVR 比率，但由于 HCV 復制過程中可產(chǎn)生大量突變，第一代藥物在服用后極短時間（幾天到數(shù)周）內(nèi)，單一藥物治療便會產(chǎn)生抗藥性［16-17］，常見的 NS3 突變位點有 Q80K、R155K、V36M/R155K、A156T 和 D168A。目前第二代藥物的研發(fā)正朝著減少藥物間相互作用、劑量減少、療程縮短和減弱副作用的方向進行。MK-5172 是其中比較有潛力的藥物，該藥物已進入臨床 II 期試驗階段。相較于第一代蛋白酶抑制劑，MK-5172 副反應相對較弱，對于 HCV 基因 1 型和 3 型有效，400 mg/d 連續(xù)服用 7 d，HCV RNA 分別下降了 5.4 和 3.98 log10IU/ml，患者的IL28B 基因型對其 SVR24 無影響，且對于臨床常見 NS3 R155 突變有較強抗性［18］。

2.2 NS5A 抑制劑

鑒于 HCV NS5A 在病毒復制和組裝過程中有重要作用［19-20］，該類抑制劑在與 IFN/RBV 聯(lián)合用藥時可以顯著減少 HCV RNA 并增強 SVR［21］。目前該類藥物極有潛力成為對 HCV 所有基因型有效的藥物。本文以達卡他韋（daclatasvir，BMS-790052）和雷迪帕韋（ledipasvir，GS-5885）為例介紹該類化合物（圖 2）。

圖1 第一代 NS3/4A 蛋白酶抑制劑

圖2 NS5A 抑制劑

達卡他韋是第一個進入臨床試驗階段的 NS5A 抑制劑。體外試驗表明，該藥物對 HCV 所有基因型均表現(xiàn)出較高抗病毒活性。達卡他韋作用于 NS5A 蛋白 N 端結(jié)構(gòu)域 I，該結(jié)構(gòu)域?qū)?NS5A 寡聚化至關(guān)重要。達卡他韋獨特的回文結(jié)構(gòu)正好與 NS5A 二聚體互補，其結(jié)合于兩個NS5A 分子 N 端結(jié)構(gòu)域 I 固相片段（36-198 和 33-191氨基酸殘基）形成二聚體的界面，處于推定的 RNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域反向［22-24］。達卡他韋有可能通過干擾 NS5A 二聚體的精確結(jié)合，使得空間結(jié)構(gòu)發(fā)生輕微扭曲，從而影響 NS5A 功能［21］。目前認為，達卡他韋影響了 HCV 生活周期的兩個階段——病毒 RNA 合成和病毒顆粒組裝/分泌過程［25］。I 期臨床試驗表明，服用達卡他韋 100 mg 6 h 后病毒載量就有平均 1.95 log10IU/ml 的下降，這比目前任何抗病毒藥物都要快。臨床 II 期試驗結(jié)果顯示，HCV 基因 1 型患者在接受達卡他韋 3、10 和 60 mg 與 IFN/RBV 連用治療后，RVR 分別為 42%、83% 和 75%［26］。雖然達卡他韋對所有 HCV 基因型有效，但耐藥性依然存在，早期實驗中已發(fā)現(xiàn)達卡他韋單一療法很快會有抗藥病毒株出現(xiàn)，常見突變位點為 M28T、Q30H/R、L31M/V、Y93H/C 等［21］。由于目前尚未發(fā)現(xiàn)抗達卡他韋和其他 DAA 的交叉耐藥株，因此達卡他韋在無 IFN 的治療方案中有較好前景［27］。

雷迪帕韋目前處于 III 期臨床試驗階段，是泛基因型抗HCV 藥物。體外試驗表明，雷迪帕韋可有效抑制 HCV 基因型 1a、1b、2、3、4a 和 6a，細胞毒性低且其抗 HCV 有特異性［28］。I 期臨床試驗表明，HCV 基因 1 型患者日服30 mg，共服用 3 d，HCV RNA 下降 3.3 log10IU/ml。未見有嚴重不良反應報道［29］。但體外復制子實驗發(fā)現(xiàn)雷迪帕韋的抗藥株，例如基因 1a 型的 NS5A Q30H 和 Y93H 突變株［28］。

除了上述兩個藥物，ACH-3102 是另外一個極有潛力的第二代泛基因型 HCV NS5A 抑制劑，已進入 II 期臨床試驗。臨床前和 I 期臨床試驗表明，ACH-3102 對 HCV 基因 1 型的主要耐藥株及 HCV 基因 2 ～ 6 型，以及攜有L31M 突變的基因 2 型抗性株均有顯著療效。同時，ACH-3102 半衰期長達 250 h，遠優(yōu)于達卡他韋（13 ～ 15 h）、雷迪帕韋（22 ～ 50 h）和 ABT-267（25 ～ 32 h）［30］。

2.3 RNA 依賴的 RNA 聚合酶抑制劑（NS5B 抑制劑）

NS5B 是 RNA 依賴的 RNA 聚合酶（RdRp），是 HCV復制的關(guān)鍵酶。NS5B 抑制劑分為兩類：一類為核苷/核苷酸類抑制劑（NPIs），另一類為非核苷類抑制劑（NNPIs）。

2.3.1 核苷/核苷酸類 NS5B 抑制劑 該類抑制劑競爭性結(jié)合到 NS5B 聚合酶活性位點，導致新生病毒基因組合成的終止，從而抑制 HCV 的復制［31］。NS5B 活性位點在所有 HCV 基因型高度保守，因此 NPIs 具有泛基因型的特點，且不易產(chǎn)生耐藥性，但是該類藥物往往有較大毒性（圖 3）。

索非布韋（sofosbuvir，GS-7977）于 2013 年獲美國FDA 批準［32］。索非布韋是一種藥物前體，在肝內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化為活性抗病毒劑 2'-脫氧-2'-α-氟-β-C-甲基尿苷-5'-三磷酸酯，然后與核苷酸競爭 HCV NS5B 活性位點，最終導致HCV 早期 RNA 鏈合成的終止［33-34］。I 期臨床試驗結(jié)果表明，單獨服用索非布韋 400 mg/d 連續(xù) 3 d可使 HCV RNA下降 3.9 log10IU/ml，且對 HCV 所有基因型有效。II 期臨床試驗也表明，索非布韋（400 mg/d）與 IFN/RBV 聯(lián)合用藥治療 12 周對 HCV 基因 1、2、3、4 和 6 型 SVR 比率大于 87%。對于初治無肝硬化的基因 1 型患者，索非布韋（400 mg/d）與 IFN/RBV 聯(lián)合用藥治療 12 周，SVR 比率為 91%，此外 IL28B 基因多態(tài)性對治療效果無影響［35-36］。索非布韋的抗病毒作用不受患者感染 HCV 基因型、種族、IL28B 基因型及有無肝硬化等因素的影響。患者對索非布韋副反應有較好耐受性。

Mericitabine（RG7128）為一胞嘧啶核苷酸類似物的前藥，因其耐受性和安全性好，是極具潛力的抗丙型肝炎藥物。臨床試驗表明，mericitabine 對基因 1、2、3 和 4 型有效且不易產(chǎn)生耐藥性［18］。當治療周期延長至 24 周時，SVR 率上升到 56.8%，且患者有較好耐受性［37］。

2.3.2 非核苷類 NS5B 抑制劑 NNPIs 作為單一療法的抑制劑抗病毒能力低于 NS3 蛋白酶抑制劑。NS5B 上有4 個該類化合物的結(jié)合結(jié)構(gòu)域——拇指結(jié)構(gòu)域 1 和 2 以及手掌結(jié)構(gòu)域 1 和 2。該類化合物只對 HCV 基因 1 型有效，病毒較易對此類藥物產(chǎn)生抗性（圖 4）。

Deleobuvir（BI-207127）是口服類 NNPI，靶點為 NS5B拇指結(jié)構(gòu)域 1，目前已進入臨床 III 期試驗。在基因型 1b HCV 感染者中，應用 deleobuvir 的 SVR12 達到了 56% ～85%，比 1a 基因型要高，后者為 11% ～ 47%［38］。該藥物與IFN/RBV 聯(lián)合治療耐受性較好，不良反應多為輕度皮疹、惡心和腹瀉等［39-40］。

VX-222 也是口服類 NNPI，靶點為 NS5B 拇指結(jié)構(gòu)域 2。I 期臨床表明，HCV 基因 1 型患者接受每天 2 次，750 mg/次給藥，治療 3 d后，HCV RNA 水平平均下降3.7 log10IU/ml，且藥物耐受性好，無嚴重不良反應，一般為疲勞和腸胃不適。當 VX-222 以高劑量與 RBV 和特拉瑞韋三聯(lián)治療或加入 PEG-IFN 四聯(lián)治療 HCV 基因 1 型患者時，三聯(lián)療法在治療第二周 HCV 檢測即為陰性，四聯(lián)療法 SVR12 率達到 90%［41］。

圖3 核苷/核苷酸類 NS5B 抑制劑

圖4 非核苷類 NS5B 抑制劑

Tegobuvir（GS-9190）靶點為 NS5B 手掌結(jié)構(gòu)域 2，可使 HCV RNA 下降 1.7 log10IU/ml。臨床 II 期試驗將tegobuvir 與 IFN/RBV 聯(lián)合用于基因型 1 患者治療，SVR率可達 100%［42］。

Setrosbuvir 的靶點為 NS5B 的手掌結(jié)構(gòu) 1，HCV 基因 1 型患者接受每天 2 次，800 mg/次給藥，治療 3 d 后，HCV RNA 水平平均下降 2.9 log10IU/ml，但體外研究顯示，HCV 基因 2 型和 3 型對其具有一定抗性。

3 以宿主為靶點的藥物

研發(fā)增強宿主天然免疫或干預發(fā)病機制所需的宿主因素的藥物（host-targeting agents，HTAs）是 HCV 感染防治的重要手段之一。該類藥物大致分為兩類：一類為多靶點HTAs，通過觸發(fā)固有免疫反應促使宿主處于抗病毒狀態(tài)，包括 IFNα、IFNλ 以及 Toll 樣受體（toll like receptor，TLR）抑制劑等；另一類為單靶點 HTAs，主要針對 HCV 生活周期中必需的關(guān)鍵宿主酶和因子，例如親環(huán)素A（CypA）、脂肪酸合酶（FASN）、HMGCoA 脫氫酶和 miRNA-122 等［43］。

ITX-5061 在體外抑制 HCV 侵入細胞過程的關(guān)鍵受體SR-B1，從而阻止 HCV 的復制。該藥早先作為治療炎癥疾病藥物—— p38 MAPK 抑制劑研發(fā)的，但是其抗病毒作用并不依賴于其 p38 MAPK 抑制活性，目前已進入 II 期臨床試驗。HCV E2 蛋白 N415D 和 G451R 突變株對ITX-5061 產(chǎn)生顯著耐藥性，但是卻對于中和抗體更為敏感［44］。

Alisporivir（DEBIO-025）和 SCY-635 靶點為 HCV 復制過程中必需的肽酰脯氨酰順反異構(gòu)酶——親環(huán)素A，阻止親環(huán)素 A 與 NS5A 結(jié)構(gòu)域 II 上的脯氨酸結(jié)合，影響CypA 與 NS5A 之間相互作用，從而抑制 HCV 在宿主細胞內(nèi)的復制。Alisporivir 還可以通過與親環(huán)素 D 結(jié)合，抑制線粒體通透性變換，從而拯救由 HCV 引起的線粒體功能紊亂［45］。此外，SCY-635 還可以通過誘導 I 型和 III 型干擾素及 ISGs 增強天然抗病毒免疫［46］。臨床試驗中，由于受試者有幾例急性胰腺炎患者出現(xiàn)，因此 alisporivir 的臨床試驗目前已經(jīng)暫停。

Miravirsen 是鎖核酸修飾的硫代反義寡核苷酸，靶標是肝臟內(nèi)特異表達并對 HCV 基因組的穩(wěn)定性和復制所必需的 miR-122［47-49］。它可與 miR-122 形成高度穩(wěn)定的雜交雙鏈，從而抑制其功能［50-51］。臨床 II 期研究表明，miravirsen用于慢性 HCV 1 型感染患者表現(xiàn)出長期劑量依賴性地減少 HCV-RNA 水平的效應。皮下注射劑量為 3、5 或7 mg/kg的 miravirsen 治療組患者的平均 HCV-RNA 最大值（log10IU/ml）自基線水平的減少量分別為 1.2、2.9 和 3.0。同時未觀察到劑量限制性的不良反應事件及病毒抵抗性。

4 結(jié)語

二十多年來，隨著對丙型肝炎病毒研究的日益深入，新藥物新療法不斷出現(xiàn)。特別是近幾年，抗 HCV 藥物和新策略發(fā)展十分迅速［52-55］。盡管新的 DAA 藥物已成為臨床治療的一線藥物，慢性丙型肝炎的治療依然面臨諸多挑戰(zhàn)，例如疾病預防、病毒耐藥性、藥物交叉反應、新藥安全性和有效性等。新的抗 HCV 藥物、多個靶點藥物混合制劑以及泛基因型抗病毒藥物將會是未來治療慢性丙型肝炎及藥物研發(fā)的趨勢。

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10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.03.011

十二五“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項（2012ZX09301002-001-015、2012ZX09301002-005-002）

100050 北京，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所免疫生物學室

岑山，Email：shancen@imb.pumc.edu.cn

2015-03-05