哺乳動(dòng)物細(xì)胞灌流培養(yǎng)技術(shù)的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用

李尤，周航，李錦才，張玉彬

哺乳動(dòng)物細(xì)胞灌流培養(yǎng)技術(shù)的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用

李尤，周航，李錦才，張玉彬

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)始于 20世紀(jì)初，發(fā)展至今已成為生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域廣泛采用的技術(shù)方法。同微生物細(xì)胞相比，動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)蛋白質(zhì)因具有蛋白空間折疊和糖基化修飾等功能而備受青睞［1-2］。近年來(lái)，蛋白藥物的上市和帶來(lái)的巨大經(jīng)濟(jì)效益，掀起了哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的熱潮。對(duì)于倍增時(shí)間長(zhǎng)、對(duì)外界環(huán)境敏感、培養(yǎng)難度大的動(dòng)物細(xì)胞，如何完善其培養(yǎng)工藝，提高細(xì)胞蛋白表達(dá)量，并有效投入大規(guī)模生產(chǎn)，成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

1 灌流培養(yǎng)的特點(diǎn)與應(yīng)用

常用的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法有批次培養(yǎng)、補(bǔ)料批次培養(yǎng)、灌流培養(yǎng)等。其中，灌流培養(yǎng)能使體系中的培養(yǎng)基不斷被更新，及時(shí)滿足細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求，同時(shí)移除乳酸、銨等有害代謝產(chǎn)物，給與細(xì)胞較優(yōu)良和穩(wěn)定的生長(zhǎng)環(huán)境。這種方法有效地提高了動(dòng)物細(xì)胞密度和活率，延長(zhǎng)了細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間，并使得蛋白產(chǎn)量大幅上升。對(duì)該法的早期研究主要集中于貼壁細(xì)胞的床層培養(yǎng)，對(duì)于懸浮細(xì)胞，需要結(jié)合細(xì)胞截留設(shè)備完成灌流操作［3-5］。

相比于補(bǔ)料批次培養(yǎng)，灌流培養(yǎng)的高細(xì)胞密度、高細(xì)胞活率、高產(chǎn)量的特點(diǎn)使其能夠憑借小型生物反應(yīng)器規(guī)模達(dá)到補(bǔ)料批次培養(yǎng)大規(guī)模生產(chǎn)所得的蛋白量，實(shí)現(xiàn)了培養(yǎng)規(guī)模小型化，增加了操作的靈活度。但灌流操作培養(yǎng)基消耗量大，對(duì)設(shè)備要求高，長(zhǎng)期培養(yǎng)染菌風(fēng)險(xiǎn)增大。

目前，對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法選取，主要決定于細(xì)胞生長(zhǎng)的特性和目的蛋白的性質(zhì)。灌流培養(yǎng)的顯著優(yōu)勢(shì)在于蛋白可以隨著培養(yǎng)基及時(shí)地被分離出，蛋白在反應(yīng)器內(nèi)停留時(shí)間短，較少受到培養(yǎng)體系內(nèi)各種水解酶的降解作用，有利于蛋白質(zhì)量的提高。這一特點(diǎn)，對(duì)于化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白，例如酶、凝血因子等生產(chǎn)極為有利。而當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)量不受培養(yǎng)方式限制時(shí)，例如對(duì)于化學(xué)性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定的抗體等藥物生產(chǎn)而言，是選擇細(xì)胞灌流培養(yǎng)還是補(bǔ)料批次培養(yǎng)，需綜合衡量成本、效益、規(guī)模、風(fēng)險(xiǎn)、操作靈活性等因素［6］。表 1 列舉了運(yùn)用灌流技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)的部分生物藥物。

2 細(xì)胞截留設(shè)備

隨著懸浮細(xì)胞的大規(guī)模應(yīng)用，懸浮細(xì)胞灌流培養(yǎng)技術(shù)也日益發(fā)展。細(xì)胞截留是懸浮細(xì)胞灌注培養(yǎng)的工藝要素之一，如何有效地截留細(xì)胞而不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損害成為工藝的重點(diǎn)和挑戰(zhàn)。目前的細(xì)胞截留設(shè)備主要基于過(guò)濾、沉降、離心原理設(shè)計(jì)，包括旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器、渦流過(guò)濾器、傾斜沉降器、旋液分離器等?；谶^(guò)濾原理設(shè)計(jì)的細(xì)胞截留設(shè)備，可以100% 分離細(xì)胞，但濾膜容易被細(xì)胞碎片、消泡劑等堵塞，最終導(dǎo)致灌流培養(yǎng)終止。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行離心分離，可能引起細(xì)胞損傷。沉降和離心均不能完全截留細(xì)胞，細(xì)胞分離效果還會(huì)受到灌流速率的影響。除此之外，能否簡(jiǎn)單而有效地進(jìn)行放大也成為大部分細(xì)胞截留設(shè)備應(yīng)用的限制條件［7］。

表1 利用灌流技術(shù)生產(chǎn)的生物藥物［6］

基于中空纖維柱截留原理而設(shè)計(jì)的交替式切向流（alternating tangential flow，ATF）系統(tǒng)具有有效緩解濾膜堵塞，剪切力低等優(yōu)點(diǎn)，是目前較優(yōu)良的細(xì)胞截留設(shè)備［8-10］。如圖 1 所示，中空纖維柱通過(guò)一根管道與反應(yīng)器相連，另一側(cè)由高壓空氣泵入與真空泵抽負(fù)壓的反復(fù)交替切換帶動(dòng)硅膠隔膜泵運(yùn)動(dòng)，使得動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液通過(guò)中空纖維柱進(jìn)出反應(yīng)器。這一過(guò)程同時(shí)實(shí)現(xiàn)了低剪切力情況下充分地沖洗中空纖維柱，有效地降低了中空纖維柱濾餅堆積效應(yīng)產(chǎn)生的堵塞影響。利用 ATF 系統(tǒng)，可以在較高的灌流速率下達(dá)到較高的細(xì)胞密度和較高的蛋白產(chǎn)量，還可以通過(guò)培養(yǎng)體積與中空纖維柱膜面積比有效放大到大規(guī)模生產(chǎn)中。

圖1 ATF 運(yùn)行示意圖［10］

3 灌流工藝開(kāi)發(fā)

哺乳動(dòng)物細(xì)胞灌流培養(yǎng)工藝開(kāi)發(fā)的要點(diǎn)在于以較低的灌流速率，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞高密度、高活率、高產(chǎn)量，同時(shí)維持培養(yǎng)體系穩(wěn)態(tài)，蛋白質(zhì)量均一。其開(kāi)發(fā)方法涉及培養(yǎng)基篩選、培養(yǎng)溫度優(yōu)化和灌流速率調(diào)節(jié)等。

3.1 培養(yǎng)基篩選

培養(yǎng)基篩選是細(xì)胞灌流培養(yǎng)工藝開(kāi)發(fā)過(guò)程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，培養(yǎng)基的成本和用量與灌流培養(yǎng)上游工藝開(kāi)發(fā)費(fèi)用密切相關(guān)。在灌流培養(yǎng)中，可以使用營(yíng)養(yǎng)豐富或濃縮的培養(yǎng)基，提供細(xì)胞足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，一方面可以獲得更高的細(xì)胞密度，更多的蛋白產(chǎn)量；另一方面，可以降低灌流速率，減少培養(yǎng)基消耗［3， 11］。這種適用于灌流的培養(yǎng)基，旨在能夠以1 ～ 2 vvd（容器體積/天）的灌流速率支持高于 50 × 106個(gè)/ml的細(xì)胞密度，此外還要求該培養(yǎng)基能維持細(xì)胞高活率，保證蛋白質(zhì)量不受影響［12］。

灌流培養(yǎng)基的開(kāi)發(fā)方法類似于補(bǔ)料批次培養(yǎng)培養(yǎng)基的開(kāi)發(fā)，主要基于人們對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)代謝以及營(yíng)養(yǎng)需求的了解，在培養(yǎng)基中添加必要的營(yíng)養(yǎng)成分。目前商業(yè)培養(yǎng)基主要針對(duì)補(bǔ)料批次培養(yǎng)，在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，也可用于細(xì)胞灌流培養(yǎng)。對(duì)于灌流培養(yǎng)基的優(yōu)化與營(yíng)養(yǎng)富集，也可通過(guò)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加補(bǔ)料批次培養(yǎng)使用的補(bǔ)料。

3.2 培養(yǎng)溫度優(yōu)化

哺乳動(dòng)物細(xì)胞適宜的生長(zhǎng)溫度一般為 37 ℃，大量研究表明，降低培養(yǎng)溫度，細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝減慢，細(xì)胞活率能夠得到更好的維持［13］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，細(xì)胞在低溫下（一般為30 ～ 35 ℃）表達(dá)量會(huì)提高，可能是由于 G0/G1 期的細(xì)胞比率增加［14］；也有文獻(xiàn)報(bào)道，降溫后，mRNA 的穩(wěn)定性增加［15］。

降溫策略常見(jiàn)于細(xì)胞密度較低的補(bǔ)料批次培養(yǎng)，同樣也可應(yīng)用于細(xì)胞密度較高的灌流培養(yǎng)。常用的方法是在細(xì)胞生長(zhǎng)的不同階段采用不同的溫度培養(yǎng)。前期在常規(guī)溫度下培養(yǎng)，細(xì)胞能快速生長(zhǎng)并達(dá)到較高的密度，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期降低溫度，可以減緩細(xì)胞代謝，維持細(xì)胞活率，提高細(xì)胞表達(dá)量。Ahn 等［16］灌流培養(yǎng) CHO 細(xì)胞生產(chǎn) EPO，當(dāng)培養(yǎng)溫度降至 32 ℃ 時(shí)，與 37 ℃ 相比，活率提高了 10% 以上，單細(xì)胞產(chǎn)量提高了 4 倍左右。Rodriguez 等［17］從 37 ℃ 降溫至 32 ℃ 灌流培養(yǎng) CHO-K1 細(xì)胞生產(chǎn) β-IFN，單細(xì)胞產(chǎn)量提高了 3 ～ 5 倍，此外降溫與灌流操作大大降低了 β-IFN的聚合度，提高了蛋白質(zhì)量。

但降溫對(duì)細(xì)胞活率和產(chǎn)量的影響因克隆而異，此外還與降溫時(shí)間，降低的溫度以及培養(yǎng)方式等有關(guān)［18］。Chen 等［19］在降溫實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞培養(yǎng)降溫至 31 ℃ 一段時(shí)間后，流式細(xì)胞儀下凋亡的細(xì)胞比例反而增加。在對(duì)細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)態(tài)灌流培養(yǎng)時(shí)還需注意，細(xì)胞維持以一定速率生長(zhǎng)和蛋白生產(chǎn)速率，溫度過(guò)低引起細(xì)胞生長(zhǎng)減緩，容易導(dǎo)致生長(zhǎng)速度低于凋亡速度，出現(xiàn)細(xì)胞活率下降的現(xiàn)象。

3.3 灌流速率的控制和優(yōu)化

灌流速率是灌流工藝開(kāi)發(fā)的又一要素。較高的灌流速率，培養(yǎng)基消耗量大，成本增加，細(xì)胞截留設(shè)備壓力加大，產(chǎn)品大量稀釋，純化負(fù)擔(dān)加重，不利于工業(yè)應(yīng)用。一般在前期物料生產(chǎn)時(shí)，可以采用相對(duì)保守的灌流速率培養(yǎng)細(xì)胞，簡(jiǎn)單而快速地提供研究所需的材料，同時(shí)不用考慮蛋白降解的問(wèn)題。在研發(fā)以及大生產(chǎn)過(guò)程中，應(yīng)在不影響細(xì)胞生長(zhǎng)和蛋白產(chǎn)量、質(zhì)量的前提下，盡量降低灌流速率［3， 12， 20］，實(shí)現(xiàn)低灌流速率下的穩(wěn)態(tài)操作。

通常，在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，應(yīng)逐漸提高灌流速率，滿足細(xì)胞的生長(zhǎng)需要，盡快達(dá)到較高的細(xì)胞密度。進(jìn)入平臺(tái)期后，可結(jié)合調(diào)節(jié)溫度、pH 等策略減緩細(xì)胞生長(zhǎng)，降低灌流速率。灌流速率還可與在線糖耗、氧耗等參數(shù)偶聯(lián)，進(jìn)行動(dòng)態(tài)控制，從而更加科學(xué)地進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。但是這種做法需要嚴(yán)格控制細(xì)胞密度，防止細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)。

降低灌流速率后，收獲液中的蛋白得以濃縮，但也容易出現(xiàn)單位體積的蛋白產(chǎn)量隨著降低。這可能是由于提供細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足或者細(xì)胞代謝副產(chǎn)物增加，對(duì)生長(zhǎng)表達(dá)造成影響。此外，不同的灌流速率，還可能引起細(xì)胞截留設(shè)備的性能改變（如濾膜通透性改變等），而對(duì)產(chǎn)量造成影響。因此，在選取灌流速率時(shí)，還需考慮細(xì)胞截留設(shè)備的運(yùn)行能力。Meuwly 等［20］以 2.6 vvd 速率灌流培養(yǎng) CHO 細(xì)胞，當(dāng)灌流速率下降 25% 后，單位體積蛋白產(chǎn)量并未下降，蛋白質(zhì)量也未受影響。但當(dāng)灌流速率下降 50% 后，蛋白產(chǎn)率下降了 30%。Kamthan 等［21］利用旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器灌流培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)抗體，當(dāng)灌流速率為 1.125 ml/min 時(shí)，抗體產(chǎn)量達(dá)到 （793 ± 22.2）mg/L，而灌流速率分別為 0.625 和1.5 ml/min 時(shí)，抗體產(chǎn)量?jī)H達(dá)到（454 ± 25.5）和（432 ± 22.2）mg/L。

4 反應(yīng)器灌流培養(yǎng)與下游純化結(jié)合

動(dòng)物細(xì)胞灌流培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展已有幾十年，在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，通常將生物反應(yīng)器與細(xì)胞截留設(shè)備連接，經(jīng)細(xì)胞截留設(shè)備分離出的培養(yǎng)液經(jīng)收集后，通過(guò)傳統(tǒng)的批次培養(yǎng)采用的下游純化工藝處理［12］。近年來(lái)，將下游純化系統(tǒng)與反應(yīng)器灌流培養(yǎng)相結(jié)合的連續(xù)操作逐漸興起［12， 22-23］。這種做法的優(yōu)勢(shì)在于可以利用細(xì)胞截留設(shè)備的細(xì)胞分離作用，及時(shí)純化灌流產(chǎn)生的大量細(xì)胞培養(yǎng)液，移除了中間裝液容器和澄清裝置，更重要的是能夠減小層析柱的體積，減少緩沖液的用量。

現(xiàn)已存在將反應(yīng)器灌流與初步蛋白吸附偶聯(lián)的半連續(xù)操作［22］。另外在純化方面，也存在對(duì)批次培養(yǎng)下游進(jìn)行部分連續(xù)純化的操作。但連續(xù)生產(chǎn)技術(shù)仍處于初級(jí)發(fā)展階段，特別是完全的上下游一體化連續(xù)操作在生產(chǎn)中還未實(shí)現(xiàn)。由于各部分技術(shù)發(fā)展程度不同，尤其在純化方面，人們對(duì)生產(chǎn)規(guī)模的蛋白純化連續(xù)操作經(jīng)驗(yàn)較少。雖然已經(jīng)有一些廠商提供中小規(guī)模的連續(xù)層析系統(tǒng)，但這些設(shè)備還需要花費(fèi)大量時(shí)間進(jìn)行評(píng)估與驗(yàn)證［24］。除此之外，人們對(duì)這種細(xì)胞灌流培養(yǎng)與蛋白純化一體化結(jié)合方式的放大也缺乏經(jīng)驗(yàn)。

5 展望

近年來(lái)，動(dòng)物細(xì)胞灌流培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)逐漸引起工業(yè)界和學(xué)術(shù)界的關(guān)注，與此同時(shí)，美國(guó) FDA 也對(duì)其發(fā)展作出了鼓舞性的引導(dǎo)［12， 25］。雖然目前細(xì)胞補(bǔ)料批次培養(yǎng)仍是工業(yè)界的主流做法，在面對(duì)生物藥物日益增加的市場(chǎng)需求量，各大生物制藥公司依靠建立 1 ～ 2 萬(wàn)升規(guī)模的生物反應(yīng)器予以應(yīng)對(duì)，但大型生物反應(yīng)器同樣耗資巨大，且利用率較低。同時(shí)，隨著生物藥物的種類逐漸增多，生物制藥公司需要同時(shí)對(duì)需求量大（如抗體）與需求量?。ㄈ绻聝核帲┑乃幬镞M(jìn)行生產(chǎn)，這要求生物反應(yīng)器在使用上更加靈活。相比之下，能夠比擬大規(guī)模補(bǔ)料批次培養(yǎng)的中、小規(guī)模灌流培養(yǎng)，占地面積小，設(shè)備的利用率也較高，應(yīng)用范圍更廣，還可實(shí)現(xiàn)高度自動(dòng)化操作，節(jié)約人力。加之一次性反應(yīng)器的投入使用，為灌流技術(shù)的發(fā)展開(kāi)辟了更為廣闊的天地。隨著灌流培養(yǎng)工藝的平臺(tái)化以及更加優(yōu)良的灌流培養(yǎng)基問(wèn)世，細(xì)胞灌流培養(yǎng)的投入資金將大大減少，必將賦予其更強(qiáng)的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。

在細(xì)胞灌流培養(yǎng)技術(shù)極具發(fā)展?jié)摿Φ耐瑫r(shí)，市場(chǎng)對(duì)于灌流操作、設(shè)備等諸多方面也提出了更高的要求。特別是一體化連續(xù)生產(chǎn)概念的提出，需要整合上下游細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)儀器設(shè)備等有效銜接，在此基礎(chǔ)上建立適用于所有蛋白藥物（包括穩(wěn)定或不穩(wěn)定的蛋白）的同一生產(chǎn)線。完全一體化連續(xù)生產(chǎn)已成為灌流技術(shù)發(fā)展的目標(biāo)和方向。

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10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.03.014

210009 南京，中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院（李尤、張玉彬）；200131 上海藥明康德新藥開(kāi)發(fā)有限公司生物制藥與生物工藝部（周航、李錦才）

張玉彬，Email：yubinzhang66@yahoo.com

2015-02-15