PPARγ配體-吡格列酮在放射治療中對小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞的作用

潘 潔 畢 怡 任玉欣 曹峰林 張大昕

長期以來，惡性腫瘤居我國居民死亡原因之首。放射治療是治療惡性腫瘤的重要手段之一，但腹部和盆腔腫瘤的放療往往受腹腔正常組織和器官的耐受量限制而不能達(dá)到腫瘤的根治劑量，影響了腫瘤的局部控制率;既使控制局部放療劑量在正常組織放射耐受量范圍內(nèi)，也必然造成正常組織的放射損傷。因此，如何降低正常組織的損傷，提高腫瘤的局部控制率，成為腫瘤治療的難題。PPARγ具有抑制炎癥反應(yīng)，抗纖維化，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡，抑制腫瘤血管生成及侵襲轉(zhuǎn)移等作用，理論上為解決正常組織放射性損傷，提高局部腫瘤治愈率，抑制腫瘤發(fā)展進(jìn)程提供了可能，已成為抗腫瘤治療的新靶點(diǎn)，但是PPARγ活化后對腫瘤細(xì)胞在放射損傷中相關(guān)因子的變化的影響還鮮有報(bào)道。本研究中，我們通過觀察PPARγ配體對放療誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞相關(guān)因子COX-2和PAI-1的影響，探討PPARγ配體在腫瘤放射治療中對腫瘤細(xì)胞的作用，為開發(fā)新的可以聯(lián)合放療抗腫瘤的藥物提供臨床前資料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

吡格列酮購自江蘇豪森藥業(yè)，DMSO購自Sigma公司，10%滅活胎牛血清和1640培養(yǎng)液購自GIBCO/BRL公司，TRIZOL購自美國Invitrogen，MTT購自Amresco公司，兔抗鼠PAI-1多克隆抗體、山羊抗鼠COX-2多克隆抗體購于Santa Cruz公司，兔抗鼠β-actin單克隆抗體購于Cell Signaling公司，兔抗山羊、山羊抗兔二抗購于北京中山公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒及BeyoECL Plus購于碧云天公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞(CT-26 cell)、細(xì)胞系購于美國ATCC公司(American Type Culture Collection)，培養(yǎng)液成分為:10%胎牛血清(1640)、2‰雙抗、L-谷氨酰胺300 mg/L、丙酮酸鈉110 mg/L、碳酸氫鈉 30 mg/L、50%葡萄糖5 ml/L、HEPES Buffer 10 ml/L。細(xì)胞于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，每2～3天換液1次，細(xì)胞至70%～90%融合時(shí)按一定比例傳代，傳代時(shí)用胰酶消化適當(dāng)時(shí)間加入其培養(yǎng)液停止消化，放入離心機(jī)1 500 rpm，離心5 min，取出棄上清，加適量培養(yǎng)液輕輕吹打成細(xì)胞懸液，移至培養(yǎng)瓶，放入CO2孵箱中培養(yǎng)，使用對數(shù)生長期細(xì)胞完成實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞照射及藥物處理

細(xì)胞照射采用X線，室溫下照射。細(xì)胞生長到70%融合狀態(tài)時(shí)更換無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)22 h，給藥處理9 h后照射，如無藥物處理則無血清培養(yǎng)基孵育22 h后照射。Pioglatazone濃度為20 μmol/L，DMSO終濃度＜0.4‰。照射結(jié)束后不更換培養(yǎng)基，將細(xì)胞送回CO2孵箱，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)間分別于照射后2 h、7 h、24 h、48 h 收取樣品。

1.4 細(xì)胞總RNA提取

細(xì)胞處理后去除細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS洗2次，然后在T25培養(yǎng)瓶中加入1ml Trizol(美國Invitrogen)輕搖培養(yǎng)瓶，室溫5 min，將液體轉(zhuǎn)移至離心管中，加入200 μl氯仿，劇烈震動(dòng) 15 s，室溫放置 3 min，12 000 rpm，4℃。離心15 min，吸出上層水相移至離心管，再加入0.5 ml異丙醇，充分混勻后室溫放置10 min，12 000 rpm，4℃。離心10 min，棄上清，RNA沉于管底，用1 ml 75%乙醇輕輕沖洗，8 000 rpm，4℃。離心5 min，盡量棄上清，加入 DEPC水溶解 RNA，酶標(biāo)儀A260、A280檢測RNA純度和濃度，－80℃冰箱長期保存。

1.5 RT-PCR

逆轉(zhuǎn)錄:取500 μg的RNA樣品反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa:DRR037A)總反應(yīng)體積10 μl加入反轉(zhuǎn)錄酶和引物，37℃15 min，85℃5 s，得到cDNA。PCR擴(kuò)增:用擴(kuò)增試劑盒(TaKaRa:DRR003A)中 PremixTaq12.5 μl，得到的 cDNA2 μl，上下游引物(20 μM)各 0.5 μl，補(bǔ)足滅菌蒸餾水至 25 μl。引物序列分別為 PPARγ(Mouse):順式為 5＇-TTTTCAAGGGTGCCAGTTTC-3 ＇;反 式 為 5 ＇-AATCCTTGGCCCTCTGAGAT-3＇，擴(kuò)增片斷長 198 bp。GAPDH(Mouse)順式為 5＇-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3＇;反式為 5＇-GGACACATTGGGGGTAGGAACA-3＇，擴(kuò)增片斷長 225 bp。反應(yīng)條件為95℃、5 s 1個(gè)循環(huán)，95℃、5 s;58℃、30 s;72℃、30 s，30個(gè)循環(huán)。PCR完成后反應(yīng)產(chǎn)物用3%的瓊脂糖凝膠電泳顯示PCR產(chǎn)物。用凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)分析結(jié)果。

1.6 MTT 法

將CT-26細(xì)胞培養(yǎng)于1640完全培養(yǎng)基中，取對數(shù)生長期細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104/ml，按每孔200 μl接種于96孔板中，在含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中孵育24 h，然后換0.1%血清1640培養(yǎng)液繼續(xù)孵育24 h使細(xì)胞同步，按預(yù)先的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)向相應(yīng)孔內(nèi)加入不同濃度的吡格列酮(3，30，300，3000，30 000 μmol/L)，孵育 24 h 后每孔內(nèi)加入20 μl MTT溶液(5 g/L)，孵育4 h，吸盡各孔內(nèi)溶液，加入 DMSO150 μl，充分振蕩10 min，酶聯(lián)免疫儀上選用490 nm波長測定每孔的吸光度值(A)。每組設(shè)6個(gè)重復(fù)孔。

1.7 細(xì)胞總蛋白提取

傾去細(xì)胞培養(yǎng)基，用0.5%NaCl沖洗2次，吸去殘余液體，用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮至培養(yǎng)皿一側(cè)，然后加入200 μl細(xì)胞裂解液 (碧云天P0013)，吹打均勻，冰浴30 min，將液體轉(zhuǎn)移至Eeppendorff管中，放入離心機(jī)中12 000 rpm，4℃，離心5 min.，吸取上清分裝于 Eeppendorff管中，－80℃冰箱長期保存。

1.8 蛋白濃度的測定

使用BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天P0012)測蛋白濃度，按A∶B=50∶1配制BCA工作液，用PBS稀釋蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，使其終濃度為0.5 mg/ml，將標(biāo)準(zhǔn)品按 0、1、2、4、8、12、16、20 μl加入到 96 孔板中，用PBS 補(bǔ)足到20 μl，加2 μl樣品于96 孔板中，用PBS 補(bǔ)足到20 μl，每個(gè)孔重復(fù)2次，各孔加入200 μl BCA 工作液，室溫放置2 h，酶標(biāo)儀測定562 nm吸光值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品的濃度。

1.9 Western Blot檢測

各組取總蛋白30 μg經(jīng)SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)至NC膜。NC膜以5%脫脂奶封閉，而后加入特異性的一抗和二抗。以BeyoECL Plus發(fā)光檢測信號強(qiáng)度。以β-actin作為上樣量的參照。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以s表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞中PPARγmRNA的表達(dá)

PPARγ擴(kuò)增片斷長198bp，GAPDH擴(kuò)增片斷長225 bp，Marker:200 bp，見圖1。

圖1 小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞的PPARγmRNA表達(dá)

2.2 10 Gy照射與吡格列酮聯(lián)合對小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞生長的影響

10 Gy照射﹑吡格列酮可以降低CT-26細(xì)胞存活率，10 Gy照射+吡格列酮處理時(shí)CT-26細(xì)胞存活率降低更為明顯，見圖2。

2.3 PPARγ聯(lián)合放療對CT-26細(xì)胞中COX-2蛋白的影響

10 Gy X射線照射后COX-2蛋白表達(dá)水平升高，照射后24 h的COX-2蛋白表達(dá)水平最高(圖3)，吡格列酮對照射誘導(dǎo)的COX-2蛋白水平升高無明顯影響(圖4)。

2.4 PPARγ聯(lián)合放療對CT-26細(xì)胞中PAI-1蛋白表達(dá)的影響

照射后24 h PAI-1表達(dá)水平明顯增高，吡格列酮對照射誘導(dǎo)的PAI-1表達(dá)水平升高起抑制作用，見圖5。

圖2 10 Gy照射與吡格列酮聯(lián)合對小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞生長的影響

圖3 10 Gy照射后COX-2蛋白表達(dá)Western結(jié)果

圖4 10 Gy照射后24 h組COX-2蛋白表達(dá)Western結(jié)果

圖5 10 Gy照射后24 h組PAI-1蛋白表達(dá)Western結(jié)果

3 討論

在腫瘤放射治療時(shí)，如何使腫瘤細(xì)胞快速死亡，同時(shí)又不使正常組織細(xì)胞受到影響，或?qū)⒂绊憸p少到最低程度，一直是人們考慮的焦點(diǎn)問題。隨著對PPARγ的深入研究，其抑制炎癥因子生成及炎癥形成、抑制腫瘤生長、增殖與轉(zhuǎn)移，抑制腫瘤血管生長，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的分化和凋亡等多方面的作用，給人們一個(gè)新的研究視野。

COX-2作為花生四烯酸合成各種內(nèi)源性前列腺素過程中的限速酶，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制尚不清楚，但在腫瘤組織中高表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤組織類型和分化程度相關(guān)，且在細(xì)胞周期調(diào)控、免疫抑制、細(xì)胞凋亡前致癌物活化、促進(jìn)腫瘤新生血管生成以及促進(jìn)腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移等方面與腫瘤相關(guān)。在很多組織中，紫外線﹑放射線可引起COX-2的表達(dá)和前列腺素的增加。在離體實(shí)驗(yàn)中，Raju等［1］運(yùn)用SC-236(一種特異性COX-2抑制劑)處理小鼠肉瘤細(xì)胞3天，該細(xì)胞對射線的敏感性明顯升高。且許多研究表明COX-2抑制劑在提高腫瘤放射敏感性的同時(shí)不增加對正常組織的放射損傷，甚至對正常組織有放射保護(hù)作用［2］。PPARγ通過NF-KappaB和AP-1途徑對放療誘導(dǎo)的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞COX-2表達(dá)升高起抑制作用［3］。對人類及小鼠的模型研究顯示了COX-2和PPARγ途徑的相關(guān)性［4］，例如:活化的 PPARγ 可以抑制 COX-2［5］，而抑制COX-2可激活PPARγ［6］，COX-2抑制劑發(fā)揮類似PPARγ 激活劑的作用［7］，PPARγ 激動(dòng)劑部分抑制COX-2的表達(dá)和PGE2的合成［8］;但PPARγ配體是否直接抑制COX-2 mRNA及蛋白的表達(dá)還存在爭議。在本實(shí)驗(yàn)中，X射線照射可引起小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞COX-2蛋白表達(dá)水平升高，在24 h達(dá)到高峰后逐漸回落，這與有關(guān)實(shí)驗(yàn)的報(bào)道是一致的。但是在24 h組，吡格列酮處理后對放療引起的COX-2水平升高無明顯作用，考慮可能是由于腫瘤細(xì)胞的表達(dá)的特異性，及對藥物的敏感性不同所致，體外實(shí)驗(yàn)畢竟脫離生物體的內(nèi)環(huán)境調(diào)控，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果能否在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相吻合，也需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

放療后引起的氧化還原反應(yīng)加強(qiáng)PAI-1的轉(zhuǎn)錄。在小鼠放射性腸炎模型中，放療能夠誘導(dǎo)上皮細(xì)胞表達(dá) PAI-1［9］。有學(xué)者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PPARγ 配體(Pioglitazone 10mmol/L)不僅在mRNA水平，而且在蛋白水平降低137 Cs照射誘導(dǎo)的腎小球膜細(xì)胞纖溶酶原激活劑抑制因子1(PAI-1)基因的過度表達(dá)，也證實(shí)了照射可以誘導(dǎo)腎小球膜細(xì)胞PAI-1過度表達(dá)，并且呈劑量依賴性［9］。在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞BHY和FaD 中，給予0，2，5，10 Gy放療，放療后45 h 可以觀察到與0 Gy組相比，PAI-1的表達(dá)呈劑量依賴性增高，10 Gy組可高達(dá)6.5 倍［10］。uPA、uPAR、RA I-1 表達(dá)增強(qiáng)是惡性腫瘤的特征之一。研究表明，PAI-1在多種腫瘤組織中大量表達(dá)，且是預(yù)后差的指標(biāo)。Kohler等［11］報(bào)道，子宮內(nèi)膜癌中的PAI-1組織濃度較未受浸潤的內(nèi)膜明顯升高，且分化愈差，PAI-1濃度愈高。此后，Tecimer等［12］也發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌的PAI-1表達(dá)與腫瘤的分期、分級呈明顯正相關(guān)，分期越晚，分級越差的病例，PAI-1的組織濃度越高。有復(fù)發(fā)的患者其PAI-1顯著升高。在卵巢腫瘤的研究中，有報(bào)道認(rèn)為PAI-1可作為提示浸潤性卵巢癌不良預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)。目前的研究表明，PAI-1可能通過抑制腫瘤細(xì)胞凋亡而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長，因此是腫瘤發(fā)生時(shí)的一個(gè)不祥預(yù)兆因子。Kwaan等［13］發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)的人前列腺癌PC-3細(xì)胞株及人的白血病HL-6細(xì)胞株中增加一個(gè)穩(wěn)定劑量的PAI-1，就抑制了由喜樹堿等誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡，如果在培養(yǎng)液中加入PAI-1特異性單克隆抗體后，PAI-1就不能抑制腫胞細(xì)胞的凋亡。因此抑制體內(nèi)PAI-1的活性，以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡可能是治療腫瘤的一條新途徑。在成心肌細(xì)胞中，15-脫氧前列腺素J2和環(huán)格列酮能夠通過激活PPAR-γ受體，降低PAI-水平［14］，在胰腺癌細(xì)胞中，15-脫氧前列腺素J2和環(huán)格列酮能夠通過激活PPAR-γ受體，提高PAI-1表達(dá)水平，降低uPA表達(dá)水平，這種作用在PPAR-γ基因敲除小鼠或使用PPAR-γ藥理抑制劑時(shí)消失［15］。X射線放射治療后24h可引起小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞PAI-1蛋白表達(dá)水平顯著升高，吡格列酮可以明顯降低放療引起的PAI-1蛋白表達(dá)水平升高，說明吡格列酮在腫瘤放療中可能通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡改善腫瘤的預(yù)后而發(fā)揮潛在的協(xié)同作用。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)繼續(xù)研究PAI-1表達(dá)變化的機(jī)理及吡格列酮作用機(jī)制。

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