谷氨酰胺對(duì)饑餓小鼠小腸乳脂肪球上皮生長(zhǎng)因子E8表達(dá)的影響

張利娟　王穎　夏立亮　吳標(biāo)　朱莎莎　杜雋銘★

谷氨酰胺對(duì)饑餓小鼠小腸乳脂肪球上皮生長(zhǎng)因子E8表達(dá)的影響

張利娟王穎夏立亮吳標(biāo)朱莎莎杜雋銘★

目的 觀察谷氨酰胺對(duì)饑餓小鼠小腸乳脂肪球上皮生長(zhǎng)因子E8（MFG-E8）表達(dá)的影響。方法 將25只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（NC組，n=5），全饑餓組（S組，n=5）和谷氨酰胺灌胃組（G組，n=15）。其中谷氨酰胺灌胃組根據(jù)不同的灌胃量［1g/（kg·d）、3g/（kg·d）、5g/（kg·d）］分為3個(gè)亞組G1組（n=5）、G3組（n=5）、G5組（n=5）。NC組正常飲食，飲水。S組和G組僅正常飲水。G組給予不同劑量谷氨酰胺水溶液灌胃，1次/d，0.5ml/次，共3次。NC組和S組給予生理鹽水灌胃0.5ml/d。72h后脫頸法處死小鼠，取小腸組織。HE染色觀察小腸絨毛發(fā)育；TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡；實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)小腸組織MFG-E8mRNA及MFG-E8蛋白表達(dá)。結(jié)果 饑餓72h后小腸絨毛呈現(xiàn)萎縮狀態(tài)，絨毛高度、隱窩深度及絨毛面積均明顯降低；黏膜上皮細(xì)胞凋亡增加；MFG-E8在基因水平和蛋白水平表達(dá)均增加。谷氨酰胺灌胃后小腸絨毛萎縮狀態(tài)改善，黏膜上皮細(xì)胞凋亡減少，MFG-E8mRNA和蛋白均較單純饑餓組降低，且mRNA降低與谷氨酰胺灌胃量呈劑量依賴(lài)。結(jié)論 MFG-E8可作為饑餓后反映小腸代償功能的標(biāo)志，MFG-E8升高可能是小腸饑餓損傷后的一種自我保護(hù)性反應(yīng)。

谷氨酰胺 饑餓 小腸絨毛發(fā)育 凋亡 乳脂肪球上皮生長(zhǎng)因子E8

臨床上食管狹窄、腸瘺或上消化道根治性手術(shù)等術(shù)后的患者不能進(jìn)食、不宜進(jìn)食或不能經(jīng)消化道直接進(jìn)食，將導(dǎo)致腸黏膜的廢用狀態(tài)，出現(xiàn)腸黏膜饑餓。MFG-E8在維持腸道穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。一方面可促進(jìn)凋亡細(xì)胞的清除［1，2］，另一方面也可以促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的再生與修復(fù)［3］。本文分析小鼠在饑餓狀態(tài)及谷氨酰胺灌胃后小腸的病理改變和MFG-E8的表達(dá)變化，探討MFG-E8在小腸黏膜饑餓損傷中的作用。

1　材料與方法

1.1主要試劑 L-谷氨酰胺（北京普博欣生物科技有限責(zé)任公司）；MFG-E8多克隆抗體（美國(guó)R&D公司）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的猴抗山羊IgG（美國(guó)Jackson公司）；actin抗體（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（美國(guó)Jackson公司）；化學(xué)發(fā)光檢測(cè)（ECL）試劑盒（美國(guó)Milipore公司）；細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒，POD（德國(guó)羅氏公司）。

1.2動(dòng)物模型制備與分組 雄性C57BL/6小鼠25只（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院動(dòng)物房代購(gòu)），8～10周齡，體重（21±2）g。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為對(duì)照組（NC組，n=5），饑餓組（S組，n=5），谷氨酰胺組（G組，n=15）。其中谷氨酰胺灌胃組根據(jù)不同的灌胃量［1g/（kg·d）、3g/（kg·d）、5g/（kg·d）］分為3個(gè)亞組G1組（n=5）、G3組（n=5）、G5組（n=5）。NC組給予正常飲食、飲水。S和G組僅正常飲水。G組分別予以不同劑量谷氨酰胺水溶液灌胃，0.5ml/次，共3次。NC組和S組給予生理鹽水0.5ml/d灌胃。72h后脫頸法處死小鼠，取小腸組織，一部分多聚甲醛固定，其他標(biāo)本置液氮中速凍后-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3光鏡測(cè)小腸絨毛發(fā)育 在距回盲部約1cm遠(yuǎn)處取約0.5cm長(zhǎng)小腸組織，4%多聚甲醛固定24h，后梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，切片。HE染色切片后應(yīng)用奧林巴斯（中國(guó)）有限公司Cell Sens顯微圖象軟件測(cè)定小腸絨毛高度、隱窩深度及絨毛面積，并觀察小腸黏膜形態(tài)在發(fā)育中的變化。

1.4TUNEL法測(cè)凋亡 操作步驟按羅氏試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。取組織切片常規(guī)脫蠟水合，3%H2O2甲醇室溫下封閉10min，3%BSA室溫封閉20min，20μg/ml蛋白酶K作液，室溫反應(yīng)10min，滴加50μl TUNEL反應(yīng)混合液（酶反應(yīng)液與標(biāo)記液的比例為1：9），濕盒中37℃避光反應(yīng)1h。再滴加50μl POD轉(zhuǎn)換液，濕盒中37℃避光濕潤(rùn)反應(yīng)30min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片。結(jié)果判斷：胞核呈現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞。

1.5Real-Time PCR 總RNA提取采用TRIzol法，按照Invitrogen公司的TRIzol說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA。提取后的總RNA 的濃度及純度用ND-1000（美國(guó)NanoDrop Technologies公司）核酸蛋白定量?jī)x測(cè)定。提取的RNA（2μg）采用Oligo（dT）引物（上海捷瑞生物工程有限公司）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（反應(yīng)體系：25μl）。Real-Time PCR反應(yīng)采用TaKaRa公司的SYBR? Premix Ex taqTMReal-time PCR的操作步驟，在ABI Prism 7300熒光定量PCR儀上檢測(cè)。反應(yīng)體系20μl，擴(kuò)增條件： 95℃預(yù)變性30s，40個(gè)循環(huán)（95℃5s，60℃31s）， 溶 解 曲 線（95℃15s，60℃1min，95℃15s，60℃15s）。目的基因及內(nèi)參照引物序列如下：MFG-E8 forward：5'-CCTTCACCCTTTCCCTCAC-3'，reverse：5'-CACATACCCCAACTTCACTCTT-3'；β-actin：forward：5'-TGTTACCAACTGGGACGACA-3'，reverse：5'-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3'。

1.6MFG-E8蛋白含量測(cè)定 采用蛋白質(zhì)免疫印跡法。用Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate蛋白定量，取蛋白樣本100μg經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，將蛋白電轉(zhuǎn)移至用甲醇活化后的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用5%的脫脂牛奶室溫封閉1h，用封閉液稀釋MFG-E8多抗（0.1μg/ml）或actin（1：1000）抗體，4℃孵育過(guò)夜，含0.05%吐溫（Tween）20的0.05mol/L Tris-NaCl溶液（TBST）洗脫3次，室溫下用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗溶液（1：2500）孵育2h，TBST洗脫3次，ECL顯色。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，行t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1一般情況 NC組小鼠一般情況良好，S組小鼠體重下降明顯，饑餓24h體重下降最快。饑餓24h后出現(xiàn)明顯覓食行為，多動(dòng)；48h毛色失去光澤，掉毛明顯；72h活動(dòng)明顯減少，但無(wú)小鼠死亡。谷氨酰胺灌胃后體重下降較單純饑餓組略減輕，其中3g/（kg·d）組改善最明顯。

2.2光鏡測(cè)小腸絨毛發(fā)育 對(duì)照組小腸黏膜形態(tài)未見(jiàn)異常，絨毛濃密，上皮細(xì)胞排列整齊（見(jiàn)圖1a）。饑餓組黏膜層厚度變薄，絨毛數(shù)量減少、短粗，隱窩上皮細(xì)胞缺失，隱窩結(jié)構(gòu)破壞，深度降低、呈萎縮樣改變（見(jiàn)圖1b）。谷氨酰胺灌胃后絨毛生長(zhǎng)發(fā)育明顯改善，絨毛高度、隱窩深度及絨毛面積均明顯升高，尤其以灌胃3g/（kg·d）組絨毛發(fā)育為佳（見(jiàn)圖1c、1d、1e）。S組小腸絨毛高度、隱窩深度及絨毛面積均明顯低于NC組；G3組小腸絨毛高度、隱窩深度及絨毛面積均明顯高于S組；G1和G5僅隱窩深度較S組明顯升高（P＜0.01）見(jiàn)圖2。

圖1　光鏡測(cè)小腸絨毛

2.3TUNEL法測(cè)凋亡 NC組可見(jiàn)一定程度凋亡，但不明顯；S組較NC組凋亡明顯增加，以絨毛頂端為甚，主要為絨毛上皮細(xì)胞。G組各亞組凋亡情況相較于S組均減少，G3組為甚，見(jiàn)圖3。

圖2　各組絨毛形態(tài)比較

圖3　鏡下凋亡情況

2.4real-time PCR S組 MFGE8mRNA表達(dá)高于NC組（P＜0.05）。G組MFG-E8mRNA水平較S組下降，且隨著谷氨酰胺灌胃劑量的增加MFG-E8mRNA降低越明顯，其中G3和G5組與S組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

2.5Western Blot 對(duì)照組、饑餓組和谷氨酰胺組小腸組織均有MFG-E8蛋白表達(dá)。S組MFG-E8表達(dá)高于NC組，G組表達(dá)減少。見(jiàn)圖5。

圖4　各組MFG-E8表達(dá)比較

圖5　各組Western Blot檢測(cè)MFG-E8比較

3　討論

MFG-E8（又名乳凝集素，BA46等）是一種具有EGF1-EGF2-C1-C2樣結(jié)構(gòu)域的分泌型糖蛋白［4］。MFG-E8最初以乳汁脂肪球膜表面的鑲嵌型外周蛋白的形式被發(fā)現(xiàn)，近來(lái)發(fā)現(xiàn)其在幾乎所有組織器官中均有表達(dá)，尤其在脾臟和淋巴結(jié)表達(dá)較多，腸道的表達(dá)量相對(duì)較少［5］。2002年，MFG-E8促進(jìn)凋亡細(xì)胞被吞噬細(xì)胞清除的功能被發(fā)現(xiàn)［6］，表明對(duì)其的認(rèn)識(shí)到了一個(gè)新的臺(tái)階，后來(lái)一系列研究均證實(shí)其在凋亡細(xì)胞的清除過(guò)程中發(fā)揮重要作用。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)MFG-E8在維持腸道穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)腸黏膜的修復(fù)中發(fā)揮重要作用［5，7］，意味著其作為一種新型的潛在的腸道炎癥的治療措施進(jìn)入人們的視野。Chogle等報(bào)道指出在DSS誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠結(jié)腸炎的急性期MFG-E8的表達(dá)升高，炎癥恢復(fù)階段MFG-E8表達(dá)下降，在恢復(fù)時(shí)期給予重組MFG-E8蛋白治療后炎癥減輕并且上皮修復(fù)加強(qiáng)［8］。

本資料顯示小鼠饑餓72h后小腸黏膜萎縮，絨毛高度、隱窩深度及絨毛面積較對(duì)照組均有不同程度的下降，這與饑餓后腸道缺少刺激，黏膜細(xì)胞更新減少有關(guān)。作為血液循環(huán)和體內(nèi)游離氨基酸池中含量最豐富的氨基酸，谷氨酰胺是小腸黏膜細(xì)胞的主要能源物質(zhì)，也是所有快速增殖細(xì)胞特別是免疫細(xì)胞的能源物質(zhì)［9］。在饑餓、創(chuàng)傷、感染等病理狀態(tài)下，補(bǔ)充外源性谷氨酰胺能夠促進(jìn)腸黏膜的生長(zhǎng)，防止腸黏膜萎縮，維持腸黏膜的完整性［10，11］。本資料顯示谷氨酰胺灌胃后腸黏膜的萎縮狀態(tài)得以一定程度改善，小腸絨毛高度、隱窩深度及絨毛面積較單純饑餓組均增加。饑餓后黏膜萎縮的同時(shí)，作者還發(fā)現(xiàn)小腸上皮細(xì)胞凋亡的增加。谷氨酰胺灌胃后上皮細(xì)胞凋亡的改善進(jìn)一步驗(yàn)證谷氨酰胺在腸黏膜應(yīng)激狀態(tài)下可發(fā)揮積極作用。同時(shí)，作者發(fā)現(xiàn)饑餓72h后小鼠小腸MFG-E8蛋白和mRNA均升高，谷氨酰胺灌胃后下降。據(jù)此，推測(cè)饑餓72h后小腸MFG-E8表達(dá)的增高，可能是機(jī)體自身的一種代償保護(hù)機(jī)制：一方面，MFG-E8可促進(jìn)腸上皮細(xì)胞沿隱窩-絨毛軸遷移［3］，使上皮細(xì)胞更新率增加以維持黏膜的完整性和上皮的穩(wěn)態(tài)。MFG-E8升高促進(jìn)小腸黏膜上皮細(xì)胞的增生和遷移，修復(fù)饑餓后損傷的黏膜屏障，另一方面清除凋亡細(xì)胞，避免凋亡細(xì)胞累積后發(fā)生繼發(fā)性壞死，損害機(jī)體。谷氨酰胺灌胃后一定程度上改善了小腸的應(yīng)激狀態(tài)，因此MFG-E8表達(dá)隨之下降。

本實(shí)驗(yàn)首次揭示饑餓72h后小鼠小腸MFG-E8在基因及蛋白水平的表達(dá)均升高，谷氨酰胺灌胃后MFG-E8表達(dá)較饑餓組減少。提示MFG-E8可作為小腸饑餓性損傷后自身保護(hù)作用的一種代償分子，為今后采取干預(yù)措施，防治長(zhǎng)期禁食患者的腸道黏膜損傷提供新的思路。

1Aziz M， Jacob A， Matsuda A， et al. Review： milk fat globule-EGF factor 8 expression， function and plausible signal transduction in resolving inflammation. Apoptosis， 2011， 16（11）： 1077～1086.

2Fricker M， Neher J J， Zhao J W， et al. MFG-E8 mediates primary phagocytosis of viable neurons during neuroinflammation. The Journal of Neuroscience， 2012， 32（8）： 2657～2666.

3Bu HF， Zuo XL，Wang X，et al.Milk fat globule-EGF factor 8/ lactadherin plays a crucial role in maintenance and repair of murine intestinal epithelium. J Clin Invest，2007，117（12）：3673～3683.

4Shi J， Gilbert G E. Lactadherin inhibits enzyme complexes of blood coagulation by competing for phospholipid-binding sites. Blood， 2003，101（7）： 2628～2636.

5Aziz MM， Ishihara S， Mishima Y，et al.MFG-E8 Attenuates Intestinal Inflammation in Murine Experimental Colitis by Modulating Osteopontin-Dependentvβ3 Integrin Signaling.J Immunol，2009，182（11）： 7222～7232.

6Hanayama R， Tanaka M， Miwa K， et al.Identification of a factor that links apoptotic cells to phagocytes.Nature，2002，417（6885）：182～187.

7Wu R， Dong W， Wang Z， et al. Enhancing apoptotic cell clearance mitigates bacterial translocation and promotes tissue repair after gut ischemia-reperfusion injury. Int J Mol Med. 2012，Sep，30（3）：593～598.

8Chogle A， Bu HF， Wang X， et al. Milk Fat Globule-EGF Factor 8 Is a Critical Protein for Healing of Dextran Sodium Sulfate-Induced Acute Colitis in Mice. Molecular Medicine， 2011， 17（5～6）： 502.

9Reeds PJ， Burrin DG. The gut and amino acid homeostasis. Nutrition，2000，16：666～668.

10Neu J， DeMarco V， Li N. Glutamine： clinical app lications and mechanisms of action. CurrOp in Clin NutrMetab Care， 2002， 5：69275.

11Reeds PJ， Burrin DG. Glutamine and the bowel. J nutr， 2001， 131（9 Suppl）：2505s～2508s.

ObjectiveTo observe the effect of glutamine on intestinal milk fat globule-EGF factor 8 expression on thehungry mice. Methods Twenty-fi ve C57BL/6 male mice were randomly divided into fi ve groups： normal control group （NC，n=5），starvation group （S，n=5）and glutamine group（G，n=15）. G group received Glu 1.0 or 3.0 or 5.0 g/kg by gastric feeding once a day from the day of starvation and named G1 or G3 or G5 group respectively. NC group ate food and drank water freely.S and G group drank water only and were of no food supply.The mice were sacrifi ced in 72 hours after starvation.The intestine specimens were sampled for histological examination by HE staining and cell apoptosis detection by TUNEL assay.The expression of MFG-E8mRNA and protein was measured by Real-Time PCR and Western Blot. Results Starvation resulted in damage to the intestinal mucosa. Villus heights，crypt depths and villus areas were signifi cantly reduced and the intestine epithelial apoptosis was increased.The expression of MFG-E8 protein and mRNA were increased.Glutamine ameliorated villous atrophy and epithelial apoptosis.At the same time，glutamine decreased the MFG-E8 expression compared to S group. ConclusionAs a kind of protective protein which is closely related to intestinal mucosa damage repair，mice intestinal MFG-E8 protein and mRNA expressions increase after starvation and decrease after Glutamine gastric feeding.This suggests MFG-E8 may be a type of protective response to intestinal damages.

Glutamine Starvation Intestinal villus development Apoptosis MFG-E8

200092上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院（張利娟朱莎莎 杜雋銘）201203上海人類(lèi)基因組研究中心（王穎 夏立亮 吳標(biāo)）