肌紅蛋白在非小細胞肺癌組織中的表達及臨床價值

蘇麗麗　潘欽石★　王瑜敏　黃卡特　丁鴻燕　張文輝

肌紅蛋白在非小細胞肺癌組織中的表達及臨床價值

蘇麗麗潘欽石★王瑜敏黃卡特丁鴻燕張文輝

目的 探討肌紅蛋白（Mb）mRNA在非小細胞肺癌（NSCLC）組織中的表達情況及臨床價值。方法 NSCLC患者癌組織標本57例，同時收集其對應的癌旁組織。采用實時熒光定量PCR檢測Mb mRNA的方法，以GAPDH為內(nèi)參基因，通過計算2-△△CT，判斷NSCLC癌組織與癌旁組織的mRNA表達差異。同時分析Mb mRNA表達水平與NSCLC病理類型、組織分化、臨床分期、淋巴結轉(zhuǎn)移等的相關性。結果 成功建立實時熒光定量PCR檢測Mb mRNA的方法；NSCLC癌組織Mb mRNA表達水平明顯高于其癌旁組織（P＜0.05）。Mb mRNA表達水平與病理類型、腫瘤臨床分期、淋巴結轉(zhuǎn)移、組織分化程度、是否吸煙等差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；而在不同性別中差異有統(tǒng)計學意義，女性Mb mRNA表達水平高于男性（P＜0.05）。腫瘤體積越大，Mb mRNA表達水平越高。結論 Mb mRNA在NSCLC中出現(xiàn)明顯上調(diào)，可能在NSCLC的發(fā)病機制起重要作用。

非小細胞肺癌 缺氧 肌紅蛋白 mRNA

近年來，肺癌已取代肝癌成為我國首位惡性腫瘤死亡原因，占全部惡性腫瘤死亡的22.7%，且發(fā)病率和病死率仍在迅速上升［1］。非小細胞肺癌（NSCLC）是肺癌的最常見類型，占所有肺癌的80%，臨床以腺癌和鱗癌多見。目前對于NSCLC治療效果仍不理想，5年生存率僅10%～15%［2，3］。本文探討肌紅蛋白（Mb）mRNA在非小細胞肺癌（NSCLC）組織中的表達情況及臨床價值。

1　臨床資料

1.1一般資料 收集2013年7月至 2014年2月本院NSCLC患者的癌組織及癌旁組織標本57例，其中男28例，女29例；年齡40～79歲，平均年齡（62.5±9.3）歲。腺癌 41例、鱗癌11例、腺鱗癌5例。Ia期12例、Ib期28例、IIa 7例、IIb 2例、IIIa 8例。低分化11例、中低分化7例、中分化17例、高中分化9例、高分化13例。淋巴結轉(zhuǎn)移14例、無淋巴結轉(zhuǎn)移43例。臨床分期按照2002年國際抗癌聯(lián)盟公布的修訂后的肺癌國際分期標準。經(jīng)病理學或影像學檢查證實是否有淋巴結轉(zhuǎn)移或遠處轉(zhuǎn)移。以上病例均經(jīng)X線胸片、胸部CT、痰脫落細胞學、纖維支氣管鏡活組織檢查或胸腔積液脫落細胞學檢查確診。

1.2方法 選擇本院心胸外科手術切除并經(jīng)病理確診且臨床資料完整的肺癌組織標本，同時取癌旁組織（距病變組織＞5cm取材，均經(jīng)病理證實為正常肺組織）；置-196℃液氮中保存。并收集患者的臨床資料包括性別、年齡、病理類型、臨床分期、分化程度、淋巴結轉(zhuǎn)移、吸煙、腫瘤大小等。（1）肺癌組織RNA的提取 Trizol 試劑盒一步法分離提取總RNA按照Invitrogen公司提供的Trizol試劑盒說明書步驟進行，所用EP管、tip頭、去離子水均經(jīng)無RNase化處理。具體步驟：①肺癌組織（肺癌組織標本和癌旁組織標本，分別機械剪碎并碾磨）：PBS洗滌2遍，加抽提液Trizol 1ml（用槍吸混勻），轉(zhuǎn)移至無RNase的Eppendorf管中，室溫放置5min。②RNA分離：加0.2ml氯仿，劇烈振蕩15s，室溫下靜置5min，然后4℃、10000r/min，離心15min。③RNA沉淀：將上層水相轉(zhuǎn)移至經(jīng)DEPC水處理過的聚丙烯管中，按等體積加入異丙醇，混勻后室溫下靜置10min，然后4℃、10000 r/min，離心10min。④RNA漂洗：棄上清液，加75%乙醇（用DEPC水溶解）1ml，充分振蕩混勻，然后4℃、6500 r/min，離心5min。⑤RNA再溶：室溫下干燥RNA沉淀物5min，加20μl DEPC水吹打溶解。⑥總RNA 濃度分析和純度鑒定：將2μl RNA 溶解于98μl DEPC 水中，用紫外分光光度計測定其在波長260 nm 和280 nm 處吸光度值（OD260 和OD280），OD260/OD280 比值在1.6～2.0，表示RNA 樣品純凈。計算樣品中的RNA 濃度：RNA（μg/ml） =OD260 值×40 μg/ml×稀釋倍數(shù)。以1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA 的完整性，剩余RNA 置于-70℃冰箱內(nèi)保存。（2）逆轉(zhuǎn)錄：將提取的總RNA取一部分立即進行逆轉(zhuǎn)錄。操作參考Takara公司提供的說明書。同時對cDNA的鑒定，合成的cDNA 經(jīng)GAPDH 引物PCR 擴增，1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行觀察。（3） 實時熒光定量PCR反應 設計Mb mRNA、GAPDH基因引物。最佳PCR條件的優(yōu)化：分別對引物，模板，SYBGREEN I PCRmix液進行優(yōu)化。根據(jù)3.2的PCR反應條件，將上述體系各試劑加樣離心混勻后置于ABI7000全自動熒光PCR儀。④根據(jù)2-△△Ct方法計算結果。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。Shapiro-Wilk test評估數(shù)據(jù)是否呈正態(tài)分布；計量資料呈非正態(tài)分布，以M（Q1，Q3）表示。多組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗，兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗，相關性分析采用Pearson關系分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1Mb mRNA熔解曲線 Mb mRNA的引物特異性較好。見圖1。

圖1　Mb mRNA熔解曲線

2.2NSCLC患者Mb mRNA相對表達量比較 見表1。

表1　NSCLC患者Mb mRNA的相對表達量的比較

2.3NSCLC癌組織及癌旁組織Mb mRNA的表達情況 NSCLC癌組織Mb mRNA相對表達水平為3.355（1.28，12.181），明顯高于其癌旁組織（P=0.000）。見圖2。

2.4不同病理類型Mb mRNA的表達情況 不同病理類型癌組織的Mb mRNA的表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P=0.145）。

2.5Mb mRNA的 表 達情況與淋巴結轉(zhuǎn)移、臨床分期的相關分析 發(fā)生淋巴結轉(zhuǎn)移NSCLC癌組織Mb mRNA表達水平與未發(fā)生淋巴結轉(zhuǎn)移組的差異無統(tǒng)計學意義（P=0.150）。不同臨床分期的Mb mRNA表達水平差異亦無統(tǒng)計學意義（P=0.940）。

2.6Mb mRNA表達情況與組織分化程度、吸煙、性別的關系分析 不同的組織分化程度（P=0.273）、有無吸煙（P=0.194），Mb mRNA的表達差異無統(tǒng)計學意義；但不同性別Mb mRNA的表達差異有統(tǒng)計學意義（P=0.024）。

2.7Mb mRNA表達情況與腫瘤組織體積大小的Pearson關系分析 腫瘤組織體積越大，Mb mRNA表達水平越高，兩者具有明顯正相關性（P=0.002）。

圖2　NSCLC癌組織及癌旁組織Mb mRNA的相對表達量比較

3　討論

肌紅蛋白（Mb）是一種廣泛存在于人及哺乳動物心肌和骨骼肌細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，具有儲存和運輸氧的功能［4］。Mb參與細胞氧代謝，作為氧短期和長期貯存方式，便于氧從細胞膜擴散到線粒體［5］。

缺氧是實體腫瘤的共同特征。一方面，無規(guī)律生長超過血管所有需氧的量［6］。另一方面，較正常組織而言，腫瘤血管功能常受損，因為其結構和生物具有異常，包括彎曲，泄漏，缺乏周細胞，分布不均勻和任意互連等［7］。因此，腫瘤病灶也包括局部區(qū)域，無論附近有無血管存在，通常會出現(xiàn)急性或慢性缺氧情況［8］。作者推測如果癌細胞表達類似異常功能氧轉(zhuǎn)運酶，那么對整個腫瘤而言，血管就會捕獲更多氧氣，受益于更均化氧化，以及在缺氧周期少受損傷。有關Mb mRNA在腫瘤中的作用有文獻報道，Mb免疫反應常被用作肉瘤和橫紋肌肉瘤要確認表型的標記［9～11］，已被證實在上皮癌中Mb mRNA表達上調(diào)［12］。

本資料結果顯示NSCLC癌組織Mb mRNA的表達量明顯高于正常癌旁組織，表明其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著一定的作用，可能參與腫瘤的缺氧過程，這與國外學者Oleksiewicz U等［13］報道基本一致。進一步分析表明其表達量與病理類型、臨床分期、淋巴結轉(zhuǎn)移及是否吸煙等無關；但男女患者的表達量卻有差異，女性高于男性，這可能與特定性別患者體內(nèi)存在的基礎值不同或與其基礎疾病有關。另外，Mb mRNA表達水平與腫瘤體積大小密切關聯(lián)，腫瘤體積越大，Mb mRNA表達水平越高，表明腫瘤體積越大，生長比較迅速，更容易出現(xiàn)缺氧，這時Mb mRNA水平升高，運輸更多的氧來緩解。

綜上所述，Mb mRNA在NSCLC中出現(xiàn)明顯上調(diào)，可能在NSCLC的發(fā)病機制乃至預后起重要作用。

1支修益. 我國肺癌流行病學現(xiàn)狀分析. 中國處方藥， 2009，2（83）：56～57.

2Martinet Y，HirschFR，Martinet N， et al. Clinical and biological basis of lung cancer prevention. Birka user，Basel，1998.297～304.

3Custodio A， Méndez M， Provencio M. Targeted therapies for advanced non-small-cell lung cancer： current status and future implications. Cancer Treat Rev，2012，38（1）：36～53.

4Brunori M， Bourgeois D， Vallone B， et al. The structural dynamics of myoglobin. J Struct Biol， 2004，147（3）：223～234.

5Wittenberg JB， Wittenberg BA. Myoglobin function reassessed. J Exp Biol，2003，206：2011～2020.

6Brahimi-Horn， M.C， Chiche， J， Pouysségur， J.Hypoxia and cancer. J. Mol. Med，2007，85（12）：1301～1307.

7Jain， R.K.Normalization of tumor vasculature： an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science，2005，307（5706）：58～62.

8Harris， A.L. Hypoxia-a key regulatory factor in tumour growth. Nat. Rev. Cancer，2002，2（1）：38～47.

9Brooks JJ. Immunohistochemistry of soft tissue tumors. Myoglobin as a tumor marker for rhabdomyosarcoma. Cancer， 1982，50（9）：1757～1763.

10Carda C， Ferrer J，Vilanova M， et al. Anaplastic carcinoma of the thyroid with rhabdomyosarcomatous differentiation： a report of two cases. Virchows Arch，2005，446（1）：46～51.

11Meyer WH， Spunt SL. Soft tissue sarcomas of childhood. Cancer Treat Rev，2004，30（3）：269～280.

12Flonta S， Arena S， Pisacane A， et al. Expression and functional regulation of myoglobin in epithelial cancers. Am J Pathol，2009，175（1）： 201～206.

13Oleksiewicz U， Daskoulidou N， Liloglou T，et al.Neuroglobin and myoglobin in non-small cell lung cancer： Expression， regulation and prognosis.Lung Cancer， 2011，74（3）：411～418.

Objective To analyze the expression and clinical value of Myoglobin（Mb） mRNA in non-small cell lung cancer （NSCLC）tissue. Methods We collected 57 cases of NSCLC tissue specimens and corresponding adjacent tissues in the First Affi liated Hospital of Wenzhou Medical University from July 2013 to February 2014. We established the real-time quantitative PCR method to detect Mb mRNA，GAPDH as reference gene，with calculating the 2-△△CT，to determine different expression of adjacent Mb NSCLC and cancer tissue. Otherwise，we analyzed the correlation of tissue Mb mRNA with NSCLC to histological type，histological grade，clinical stage，lymph node metastasis and other clinical data. Results We successfully established real-time PCR method for detecting Mb mRNA；Mb mRNA expression levels of NSCLC tissues were signifi cantly higher than its adjacent tissues （P＜0.05）. The expression of Mb mRNA was no relative to clinical stage，lymph node metastasis， histological type，histological grade，and smoking（P＞0.05）. The expression levels of Mb mRNA was signifi cant in different gender，the expression levels of women higher than men（P＜0.05）. Tumor volume was higher，Mb mRNA expressed higher. Conclusion The expression of Mb signifi cantly increases in NSCLC and it may play an important role in the pathogenesis of NSCLC.

Non-small cell lung cancer （NSCLC） Hypoxia Myoglobin （Mb） mRNA

浙江省溫州市科技局項目資助（Y20110041）

325000浙江省溫州市中心血站（蘇麗麗）325000 溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院（潘欽石 王瑜敏黃卡特 丁鴻燕 張文輝）