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    酸性α-淀粉酶菌株的篩選及其發(fā)酵條件研究

    2015-10-27 07:17:58屈建航尹伊焦國寶丁長河張倩屈凌波劉仲敏
    生物技術通報 2015年7期
    關鍵詞:產酶氮源淀粉酶

    屈建航尹伊焦國寶丁長河張倩屈凌波劉仲敏

    (1. 河南工業(yè)大學生物工程學院,鄭州 450000;2. 河南仰韶生化工程有限公司,澠池 472400)

    酸性α-淀粉酶菌株的篩選及其發(fā)酵條件研究

    屈建航1尹伊1焦國寶2丁長河1張倩1屈凌波1劉仲敏2

    (1. 河南工業(yè)大學生物工程學院,鄭州 450000;2. 河南仰韶生化工程有限公司,澠池 472400)

    自淀粉廠周邊土壤分離篩選到一株高效耐酸α-淀粉酶菌株SH3,初步鑒定為酵母菌,發(fā)酵粗酶pH范圍3.8-8.0,最適作用pH5.0,該酶在80℃下仍有酶活,最適作用溫度50℃。經單因素發(fā)酵條件的研究與優(yōu)化,最適溫度37℃,培養(yǎng)基初始pH5.0,可溶性淀粉作碳源,蛋白胨為氮源,200 mL裝液量。正交試驗確定最佳產酶條件為可溶性淀粉15 g/L、蛋白胨30 g/L、37℃、pH4.5,該條件下酶活力為96.8 U/mg。

    耐酸α-淀粉酶;菌株篩選;發(fā)酵條件;工藝優(yōu)化;酵母菌

    α-淀粉酶可從淀粉分子內部切開α-1,4 糖苷鍵,生成糊精和還原糖,廣泛應用于食品、釀造、制藥、紡織及石油開采等諸多領域,在工業(yè)生產中有極其重要的地位,是目前用途較廣泛的一種酶制劑[1,2]。目前工業(yè)應用的α-淀粉酶主要來源于細菌和絲狀真菌[3,4],在原始菌株中,真菌來源的α-淀粉酶被發(fā)現(xiàn)比細菌更穩(wěn)定[5]。國外對酸性α-淀粉酶的研究起步較早,1963年日本Yasuji等[6]發(fā)現(xiàn)可用真菌生產酸性α-淀粉酶。在酵母菌中也發(fā)現(xiàn)了部分能產生高酶活α-淀粉酶的菌株[7]。我國對產α-淀粉酶菌株的研究起步較晚,尤其是耐酸性α-淀粉酶。目前,國際上一些大的酶制劑公司生產耐酸α-淀粉酶的菌種50%是基因工程菌[8]。近年來,已發(fā)現(xiàn)數(shù)十株優(yōu)良產α-淀粉酶菌,包括耶魯維亞酵母(Yarrowia)、類酵母(Aureobasidium)、畢赤氏酵母(Pichia)、假絲酵母(Candida)、紅酵母(Rhotolorula)等[9],對酵母菌應用于工業(yè)生產α-淀粉酶有了進一步推動[10]。本研究篩選出一株耐酸性α-淀粉酶酵母菌株,研究且優(yōu)化其發(fā)酵條件,旨在為工業(yè)利用提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 土壤樣品 河南省偃師某面粉廠污水排出口處采集土壤樣品。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.1.2 培養(yǎng)基 篩選培養(yǎng)基(g/L)[1]:牛肉膏 3,蛋白胨 10,NaCl 5,可溶性淀粉 10,瓊脂粉 15,pH 5.0。種子及發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)[11]:胰蛋白胨5,可溶性淀粉10,(NH4)2SO42.5,KH2PO43,CaCl20.2,pH調至5.0。

    1.2 方法

    1.2.1 酸性α-淀粉酶產生菌的分離篩選 初篩:土壤樣品,10倍梯度稀釋法涂布于篩選培養(yǎng)基,28℃恒溫培養(yǎng)。滴加碘液,記錄有透明圈的菌株。復篩:將初篩有透明圈的菌株,接種種子培養(yǎng)基,37℃、200 r/min培養(yǎng)12 h,以10%的接種量轉至發(fā)酵培養(yǎng)基,相同條件培養(yǎng)24 h。發(fā)酵液5 000 r/min離心15 min,上清為粗酶液,測定酶活[1]。

    1.2.2 淀粉酶活力測定方法 Yoo酶活測定法[12,13]稍加改進:2.5 mL 0.5%可溶性淀粉溶液與2.5 mL檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(pH5.0)50℃恒溫水浴鍋預熱10 min,加入酶液0.5 mL,50℃下準確反應10 min,加入5 mL 0.1 mol/L的鹽酸終止反應,取上述混合液0.5 mL與5 mL碘液混勻,660 nm測定吸光度值R(以2.5 mL蒸餾水代替可溶性淀粉溶液,其余條件相同作為空白)。在上述反應條件下,以0.5 mL的緩沖液代替0.5 mL酶液,測定吸光度值R0[11]。

    酶活定義:50℃、pH5.0條件下,10 min水解1 mg淀粉所需的酶量為一個酶活力單位。

    酶活公式:待測酶活(U/mg)=100*D*(R0-R)/R

    其中,D:稀釋倍數(shù),R0:對照吸光值,R:酶液的吸光值,100:轉換系數(shù)。

    1.2.3 菌種ITS序列鑒定

    1.2.3.1 分子試劑及引物 Taq mix(TaKaRa)、ITS4引物5'-3':ggAAgTAAAAgTCgTAACAAgg、ITS5引物5'-3':TCCTCCgCTTATTgATATgC。

    1.2.3.2 基因系統(tǒng)發(fā)育鑒定 基因組總DNA的提取參考文獻[14]進行。ITS序列PCR擴增反應體系:Taq mix 12.5 μL,ITS4 0.5 μL,ITS5 0.5 μL,ddH2O 9 μL,基因組DNA模板2.5 μL,總體積25 μL。反應過程:95℃ 5 min,30次循環(huán)(94℃ 30 s,55℃ 1 min,72℃ 1 min),72℃ 10 min。PCR產物測定核苷酸序列,GenBank數(shù)據(jù)庫完成BLAST比對。

    1.2.4 酶學性質研究 37℃、200 r/min培養(yǎng)48 h的發(fā)酵液上清作為粗酶,pH3.8、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0的緩沖條件,分別測定酶活以確定pH范圍。設置30、37、45、50、55、60、70和80℃溫度條件測定酶活以確定溫度耐受性。

    1.2.5 產酶發(fā)酵條件研究

    1.2.5.1 菌株產酶曲線 種子液10 mL接種到100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基,從3 h開始每小時測定酶活,以培養(yǎng)時間為橫坐標,酶活力為縱坐標繪制產酶曲線。

    1.2.5.2 溫度對菌株產酶的影響 以5%的接種量將種子液接至100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基,分別28、37、40℃振蕩培養(yǎng),從產酶高峰期開始每小時測定酶活。

    1.2.5.3 初始pH對菌株產酶的影響 調節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值為4.5、5.0、5.5、6.0,接入5%種子液,37℃、200 r/min培養(yǎng),在產酶高峰期取樣,測定酶活。

    1.2.5.4 碳源對菌株產酶的影響 分別以0.5%葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉作為碳源,5%的接種量至100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中,37℃、200 r/min培養(yǎng),在產酶高峰期測定酶活[15]。

    1.2.5.5 氮源對菌株產酶的影響 分別以0.5%蛋白胨、棉籽餅、黃豆餅、牛肉膏作為氮源,5%的接種量至100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中,37℃、200 r/min培養(yǎng),在產酶高峰期測定酶活。

    1.2.5.6 裝液量對菌株產酶的影響 在500 mL三角瓶中分別裝入50、100、150、200 mL發(fā)酵培養(yǎng)基,接入5%的種子液,37℃、200 r/min培養(yǎng),在產酶高峰期測定酶活。

    1.2.6 正交試驗 根據(jù)單因素優(yōu)化實驗結果,針對碳源、氮源、溫度和pH,經SPSS軟件設計四因素三水平正交實驗[16]。

    2 結果

    2.1 菌株篩選

    共篩選出產酸性α-淀粉酶的菌株24株,部分篩選結果見表1,其中初篩SH3菌株,透明圈/菌落直徑比最大,D/d為5,選其作為實驗菌株。

    表1 菌種初篩結果

    2.2 菌種鑒定

    PCR擴增菌株18S ITS基因片段,測序后GenBank序列比對,結果與紅酵母屬(Rhodotorula sp.)的序列同源性最高,為97%(AM901697)-98%(NR073315),基本確定為酵母菌。

    2.3 產酶曲線

    產酶曲線見圖1,由圖1可見酶活先上升后下降,在14 h酶活達到91.4 U/mg,此后酶活迅速下降,12-15 h是高酶活時期。

    圖1 SH3菌株產酶曲線圖

    2.4 酶的pH和溫度范圍

    50℃、不同pH下測定菌株SH3的α-淀粉酶活力,結果如表2所示。SH3所產淀粉酶活力受酸堿度影響較大,該酶在pH3.8-8.0之間均有酶活,在偏酸性條件下酶活力較高,pH5.0為酶反應最適pH,酶活為79.8 U/mg。

    表2 酶的pH耐受范圍

    pH5.0、不同溫度下測定SH3酶活力,結果由表3可知,該酶在30℃-80℃均有酶活,30℃-50℃酶活力隨溫度升高而升高,最適作用溫度為50℃,酶活力為74.2 U/mg。

    表3 酶的溫度作用范圍

    2.5 產酶發(fā)酵條件優(yōu)化結果

    2.5.1 溫度對菌株產酶的影響 28℃、37℃、40℃發(fā)酵條件下研究溫度對菌株SH3產酶的影響,結果(圖2)表明,37℃和40℃酶活均是先上升后下降,37℃酶活14 h達到最高91.6 U/mg,40℃酶活與37℃相比上升較快,13 h達到最高91.3 U/mg,但下降也較快。28℃菌體生長緩慢,高活性酶活出現(xiàn)較晚??赡茈S溫度升高生長代謝加快,產酶高峰期提前。選取37℃作為最佳發(fā)酵溫度。

    圖2 溫度對產酶的影響

    2.5.2 裝液量對菌株產酶的影響 由圖3可知,在發(fā)酵高峰期,相同時間內200 mL裝液量的發(fā)酵酶活最高,14 h時達到最高88.2 U/mg。

    2.5.3 初始pH對菌株產酶的影響 選取pH4.5、5.0、5.5、6.0的初始培養(yǎng)條件,分別測定SH3酶活力,結果(圖4)表明,pH4.5-6.0條件下菌體均能生長,發(fā)酵14 h時測定酶活,pH5.0發(fā)酵條件下酶活最高,為89.7 U/mg,依次高于pH5.5、6.0和4.5,其中pH4.5發(fā)酵條件下酶活相對最低,為33.4 U/mg。

    圖3 裝液量對菌株產酶影響

    圖4 初始培養(yǎng)基pH條件對產酶的影響

    2.5.4 碳源和氮源對菌株產酶的影響 由表4可知,可溶性淀粉作為培養(yǎng)基碳源時酶活最高,為87.95 U/mg,葡萄糖作碳源時酶活最低。而氮源中蛋白胨為最佳氮源,酶活最高達到93.39 U/mg,棉籽餅作氮源時酶活最低,為53.82 U/mg。

    表4 碳源和氮源對菌株產酶的影響

    2.6 正交實驗及結果

    在單因素的基礎上,對可溶性淀粉、蛋白胨、初始溫度與pH四因素作三水平正交試驗(表5)。由表6可知,最佳發(fā)酵條件為可溶性淀粉15 g/L、蛋白胨30 g/L、37℃、pH4.5,對應酶活最高為96.8 U/mg。極差分析結果可看出,碳源對菌株產酶的影響最大,影響程度依次為:可溶性淀粉>蛋白胨>pH>溫度。

    表5 四因素三水平表

    表6 正交實驗結果及極差分析結果

    3 討論

    酶α-淀粉酶是基于淀粉糖原料生產產品過程中使用的主要糖酶,在全球酶制劑產業(yè)中占30%左右[17,18]。傳統(tǒng)α-淀粉酶最適作用pH值為5.8-6.2,而淀粉乳偏酸性(pH3.2-4.5),進一步糖化也是在酸性條件(pH4.2-4.5)下進行,即液化前后需兩次調pH,影響產品提取,不利于節(jié)能減排。耐酸耐高溫α-淀粉酶可有效解決這一問題,需求量越來越大,已在歐美等發(fā)達國家得到廣泛應用,但菌種選育等核心技術也被國外跨國公司所壟斷。我國缺乏高產菌株,尚不能自主生產。

    現(xiàn)階段篩選得到的產酸性α-淀粉酶菌株主要是芽孢桿菌和曲霉[20,21,22],普遍存在產酶水平較低的問題,仍需在自然界篩選高酶活菌株,并進一步優(yōu)化耐酸、耐高溫性能。采用基因工程技術對功能基因進行定向改造,構建工程菌,是選育高產、高性能菌株的重要途徑[19]。

    4 結論

    從土壤樣品中分離到一株產酸性α-淀粉酶菌株SH3,該菌18S ITS序列與紅酵母菌相似性97%。其酶活性最適作用pH5.0,最適作用溫度50℃。最佳發(fā)酵條件為可溶性淀粉15 g/L、蛋白胨30 g/L、37℃、pH4.5,對應酶活力96.8 U/mg。

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    (責任編輯 李楠)

    Screening of a Strain Producing Acid-stable α-Amylase and Optimization of Its Fermentation Condition

    Qu Jianhang1Yin Yi1Jiao Guobao2Ding Changhe1Zhang Qian1Qu Lingbo1Liu Zhongmin2
    (1. College of Biological Engineering,Henan University of Technology,Zhengzhou 450000;2. Henan Yangshao Biochemical Engineering Company,Mianchi 472400)

    A strain SH3 producing acid-stable α-amylase was isolated from the soil nearing a starch factory. It was preliminarily identified as yeast. The pH range of crude enzyme reaction was 3. 8-8. 0 with the optimum of 5. 0, and the activity of the enzyme was still available in the temperature of 80℃ with the optimum of 50℃. The optimization of single-factor fermentation revealed that the optimal condition for the enzyme production was 37℃, pH 5. 0, soluble starch as carbon source, peptone as nitrogen source and 200 mL liquid volume. Orthogonal test showed that the optimal fermentation condition was as soluble starch of 15 g/L, peptone of 30 g/L, 37℃ and pH4. 5, under which the enzyme activity was 96.8 U/mg.

    acid-stable α-amylase;strain screening;fermentation condition;process optimization;yeast

    10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.028

    2014-11-25

    國家科技支撐計劃項目(2013AA102101),國家自然科學面上基金項目(31370147),河南省高校青年骨干教師資助計劃(2013GGJS-077),河南省高??萍紕?chuàng)新團隊(15IRTSTHN019)

    屈建航,女,博士,研究方向:微生物學;E-mail:qjh_bata@163.com

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