銅綠假單胞菌外膜蛋白I的原核表達、純化及免疫保護作用研究

陳春琳劉祥王成祥張曉娟俱雄張濤吳三橋

（1.陜西理工學院生物科學與工程學院，漢中 723001；2. 安徽省肥西縣特殊教育學校，合肥 231200）

銅綠假單胞菌外膜蛋白I的原核表達、純化及免疫保護作用研究

陳春琳1劉祥1王成祥2張曉娟1俱雄1張濤1吳三橋1

（1.陜西理工學院生物科學與工程學院，漢中 723001；2. 安徽省肥西縣特殊教育學校，合肥 231200）

銅綠假單胞菌外膜蛋白OprI具有較強的免疫原性，在疫苗上具有開發(fā)前景。利用分子方法獲得OprI蛋白的表達菌株。Western blotting 驗證表明抗體能與OprI蛋白特異性結合。SDS-PAGE電泳切膠純化獲得OprI蛋白。將OprI蛋白免疫小鼠并攻毒銅綠假單胞菌，發(fā)現(xiàn)OprI蛋白激活的特異性免疫對小鼠銅綠假單胞菌感染的保護率達到57.14%，與對照組相比較達到顯著性。采用正交試驗設計，獲得OprI菌株最佳誘導表達條件為：加IPTG菌夜OD600值0.8，加IPTG終濃度 0.3 mmol/L，誘導時間 8 h，誘導溫度 28℃；菌株最佳培養(yǎng)條件為轉速230 r/min，葡萄糖濃度0%，裝液量50 mL。

銅綠假單胞菌；OprI蛋白；免疫保護；正交試驗；誘導條件

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），又名綠膿桿菌，是醫(yī)院感染最常見的條件致病菌之一，常分布于人與動物皮膚和腸道上；在機體燒傷、免疫力下降、重大疾病創(chuàng)傷后，容易誘發(fā)感染，甚至導致感染性休克［1，2］。由于抗生素的大量使用，銅綠假單胞菌出現(xiàn)不同程度的耐藥性，增加了治療的難度，人們一直在尋找一種不產生耐藥性的防治藥物［3，4］。

銅綠假單胞菌主要的免疫保護抗原有OprI，OprF和OprH。OprI為銅綠假單胞菌主要的外膜蛋白之一，可激活機體非特異性免疫，并與抗原遞呈細胞（Antigen-presenting cells，APC）相互作用，提高與其融合的蛋白的保護率［5，6］。研究發(fā)現(xiàn)OprI免疫小鼠產生的抗體可有效抵抗銅綠假單胞菌的感染［7］，其激發(fā)的非特異性免疫對豬瘟（Classical swine fever，CSF）也有免疫保護作用［8］；人體免疫試驗證實OprI可顯著增強機體的特異性抗體水平［9］。可見OprI在疫苗上具有很好的應用前景［5，10］。

本實驗利用分子克隆方法獲得銅綠假單胞菌OprI表達菌株；純化OprI蛋白，免疫小鼠，攻毒銅綠假單胞菌研究其免疫保護作用；通過正交試驗確定OprI最佳的表達條件與培養(yǎng)條件，旨為OprI工業(yè)發(fā)酵、蛋白功能與疫苗開發(fā)研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

P. aeruginosa PAO1，E. coli DH5α，E. coli BL21，pET-32a質粒由實驗室保存。昆明鼠購于西安交通大學動物中心。引物合成、基因序列測定均由西安沃爾森生物技術有限公司完成。Protein Marker，NDA Marker，Taq酶，限制性內切酶，T4-DNA 連接酶，均為TaKaRa 公司產品；IPTG，蛋白胨，酵母提取物均購于美國MP公司；質粒提取試劑盒、基因組提取試劑盒與膠回收試劑盒為上海生物工程公司；小鼠抗OprI血清本實驗室制備；山羊抗小鼠IgG二抗購于Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質粒的構建 根據NCBI公布的P. aeruginosa PAO1基因序列，設計oprI基因引物：Sense Primer：5'- ACAGGATCCATGAACAACGTTCTGAAA -3'；Anti-sense Primer：5'- ACTCTCGAGTTACTTGCGGCTGGCTTT -3'，下劃線分別為限制性內切酶位點BamH I和Xho I。PCR反應體系（50 mL）：PCR反應緩沖液5 mL，模板DNA 3 mL，10 mmol/L dNTP 2 mL，25 mmol/L引 物 各1 mL，Taq 酶0.5 mL，補水至50 mL。PCR反應條件為：94℃預變性3 min，30個PCR循環(huán)（94℃變性1 min，55℃退火45 s，72℃延伸90 s），72℃充分延伸10 min，最后4℃保溫。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片段的大小，膠回收試劑盒回收DNA片段。pET-23a質粒載體與PCR產物均采用BamH I和Xho I雙酶切后，T4-連接酶16℃連接過夜，轉化E. coli DH5α，提取重組質粒進行酶切鑒定及測序鑒定，檢驗正確后轉化E. coli BL21表達菌株，進行OprI蛋白表達測定。

1.2.2 重組蛋白的表達檢測與蛋白純化 取經鑒定的重組菌過夜培養(yǎng)，以1∶100倍轉接入新鮮的LB培養(yǎng)基中，待OD600約0.6時，加入終濃度0.5 mmol/L IPTG誘導培養(yǎng)6 h，離心收集菌體，加入上樣緩沖液，用SDS-PAGE蛋白電泳檢測OprI蛋白表達情況；并利用SDS-PAGE電泳切膠的方法對OprI進行蛋白純化。

1.2.3 重組蛋白的Western blotting檢測 采用Western blotting方法檢測蛋白表達情況［11］，簡要步驟為：將OprI表達菌株進行IPTG誘導（對照為未誘導），SDS-PAGE蛋白電泳，轉NC膜，5%牛奶封閉后，加入小鼠OprI多克隆抗血清，洗滌后，二抗孵育，最后DAB顯色，確認OprI的表達。

1.2.4 重組蛋白的小鼠免疫 選用4-5周齡的昆明鼠，實驗組和對照組各15只。實驗組免疫純化的OprI蛋白，對照組免疫從pET32質粒菌株中誘導、表達與純化的免疫標簽蛋白。小鼠采用腹腔免疫的方式，實驗組每只免疫OprI蛋白50 μg/每次，對照組免疫PBS；第1次采用弗氏完全佐劑，免疫10 d后進行第2次免疫；第2次免疫7 d后進行銅綠假單胞菌攻毒實驗。

1.2.5 免疫小鼠的攻毒保護實驗 在預實驗基礎上，進行免疫動物的攻毒實驗。末次免疫7 d 后，以107CFU單位銅綠假單胞菌注入小鼠腹腔進行攻毒試驗，攻毒后密切觀察實驗小鼠的活動、攝食及精神狀態(tài)15 d。依據公式：保護率（%）=（1-實驗組死亡率/對照組死亡率）×100%，計算OprI的免疫保護作用；利用SPSS軟件計算顯著性。

1.2.6 重組蛋白表達條件的優(yōu)化 為確定OprI蛋白最佳表達條件，進行L9（34）正交試驗，分為菌最適培養(yǎng)條件與蛋白最適誘導表達條件2部分，因子與水平分別見表1和表2［12］。

菌株培養(yǎng)條件正交試驗主要步驟為：取單菌落入LB 培養(yǎng)液中，37℃，培養(yǎng)16 h，以1∶100轉接菌體入正交試驗模型要求250 mL錐形瓶中，按表1的條件培養(yǎng)，記錄所得菌液的OD600值。依據OD值進行數(shù)據的極差分析，使用SPSS軟件進行數(shù)據的方差分析。

表1 OprI表達菌株培養(yǎng)條件的正交試驗因子與水平

表2 OprI蛋白誘導條件正交試驗的因子與水平

菌株誘導表達條件正交實驗主要步驟為：根據菌最適培養(yǎng)條件獲得的結果，快速培養(yǎng)菌體至表2要求的不同OD600值，再按照正交試驗模型的條件加入不同濃度的IPTG，誘導相應的時間，吸取1 mL菌液離心，沉淀加入300 mL的2×SDS 上樣緩沖液，沸水中煮樣5 min，上樣10 μL進行SDS-PAGE電泳。使用軟件Phoretix 1D對電泳得到的OprI蛋白表達圖譜進行光密度分析；使用SPSS軟件進行數(shù)據的方差分析。

2 結果

2.1 重組質粒的構建

以銅綠假單胞菌基因組為模板，PCR擴增oprI基因，獲得252 bp左右的基因片段，與預期大小一致（圖1-A）。將PCR產物與pET-32a質粒載體進行雙酶切，T4-DNA連接酶作用后，轉化E. coli DH5α菌株，提取質粒，用BamH I和Xho I雙酶切獲得252 bp片段，與目的基因大小一致（圖1-B）；序列測序顯示與NCBI公布的基因序列相同，證明成功構建重組質粒。

圖1 銅綠假單胞菌oprI基因重組質粒構建

2.2 重組蛋白的表達檢測與蛋白純化

為驗證重組蛋白表達情況，將構建的重組質粒菌株經IPTG誘導，SDS-PAGE電泳獲得30 kD的蛋白條帶，包含OprI蛋白9.24 kD大小，以及pET-32a質粒自帶的20.4 kD 融合蛋白標簽，重組蛋白表達情況與預期大小一致；并利用SDS-PAGE電泳切膠的方法獲得純化的OprI蛋白，如圖2所示。

圖2 OprI蛋白表達與純化

2.3 重組蛋白的Western blotting檢測

利用蛋白Western blotting顯色技術，發(fā)現(xiàn)誘導表達重組菌株獲得的蛋白有條帶顯示，而對照組未出現(xiàn)，如圖3所示。證明重組的OprI蛋白可與抗體結合，OprI表達正確。

2.4 重組蛋白的免疫保護作用

小鼠通過免疫OprI蛋白，攻毒銅綠假單胞菌發(fā)現(xiàn)24 h內均出現(xiàn)較重的中毒癥狀，毛蓬松皺褶、攝食減少、精神萎靡嗜睡，并出現(xiàn)大量死亡，在4 d后死亡得到控制，小鼠能夠逐漸恢復，一旦恢復可長期存活。實驗與對照組小鼠具體的存活與死亡情況及時間，如表3 所示。

2.5 OprI菌株誘導表達條件的確定

2.5.1 OprI菌株最適培養(yǎng)條件的正交試驗 根據表1 設計的因素、水平，按照正交試驗 L9（34）模式設計各個試驗組合，進行3次重復，獲得OprI表達菌株菌液濃度的OD600數(shù)值（表4）。將數(shù)據進行極差分析（表5）顯示，組合A1B3C1為菌株最適培養(yǎng)條件，即培養(yǎng)基中不需要加入葡萄糖，轉速230 r/min，裝液量50 mL；方差分析結果（表6）顯示葡萄糖濃度、轉速及裝液量均達到顯著性。因而，實際發(fā)酵工程菌時，不需要額外補充葡萄糖，可適當提高轉速，進行IPTG誘導前菌體的快速培養(yǎng)。

圖3 OprI表達菌株Western blotting驗證

表3 昆明鼠主動免疫OprI及攻毒銅綠假單胞菌

表4 OprI表達菌株培養(yǎng)條件試驗的菌液濃度

表5 OprI表達菌株培養(yǎng)條件的極差分析

表6 OprI表達菌株培養(yǎng)條件的方差分析

2.5.2 OprI菌株誘導表達條件的正交實驗 為檢測OprI的最佳表達情況，進行3次重復，通過SDSPAGE電泳，獲得OprI蛋白表達圖譜（圖4）；然后通過軟件Phoretix 1D分析圖譜中的蛋白條帶，獲得蛋白的光密度值（表7）。對數(shù)據進行極差分析獲得最佳OprI蛋白表達組合為E2F2G2H1（加IPTG菌液OD600值：0.8；IPTG終濃度：0.3 mmol/L；誘導時間：8 h；誘導溫度：28℃）（表8）。方差分析結果顯示，加IPTG時菌液濃度、加IPTG終濃度、誘導時間及誘導溫度，這4個因素對于蛋白表達的影響均達到顯著性（表9）?？梢奜prI工程菌誘導時應采用：加入低濃度IPTG、對數(shù)生長中期誘導、低溫誘導，且誘導時間不易過長。

2.5.3 最優(yōu)化條件OprI表達檢測 根據最優(yōu)化的OprI表達條件（培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基中不加入葡萄糖，轉速230 r/min，裝液量50 mL；誘導條件：加IPTG菌液OD600值 0.8，IPTG終濃度 0.3 mmol/L，誘導時間 8 h，誘導溫度 28℃），進行OprI表達菌株的蛋白誘導，獲得的蛋白條帶如圖5所示。將最優(yōu)化誘導條件結果使用軟件Phoretix 1D分析光密度，并與之前實驗（圖4）獲得的光密度相比較，發(fā)現(xiàn)最優(yōu)化條件獲得的光密度高于其它的試驗條件（表10）。證明最優(yōu)化條件下OprI蛋白得到很好的表達。

圖4 OprI表達菌株IPTG誘導的正交試驗

表7 Phoretix 1D軟件分析OprI表達圖譜

表8 OprI蛋白表達圖數(shù)據的極差分析

表9 OprI蛋白表達圖數(shù)據的方差分析

圖5 最優(yōu)化條件下OprI蛋白的誘導表達

表10 OprI最優(yōu)化條件與其它誘導條件比較

3 討論

由于抗生素廣泛應用，銅綠假單胞菌快速產生耐藥性，增加致病菌的治療難度。基因工程疫苗以其無耐藥性特點，受到人們高度重視［13，14］。因而，利用基因工程獲得多肽類物質，用于后續(xù)的疫苗開發(fā)與科學研究尤為重要［15］。

OprI是銅綠假單胞菌主要外膜蛋白，具有很強的免疫原性［5］，本實驗利用分子克隆獲得OprI表達菌株，研究發(fā)現(xiàn)其對小鼠的免疫保護率達到顯著性的57.14%，為開發(fā)OprI蛋白免疫制劑奠定理論基礎。

外源基因表達的影響因素很多，但誘導條件的最佳組合往往是唯一的［12］。本實驗利用正交實驗模型進行銅綠假單胞菌OprI蛋白的表達研究，結果表明，在未誘導時，OprI表達菌株最適培養(yǎng)條件為：葡萄糖濃度0%，轉速230 r/min，裝液量50 mL；菌體加入IPTG誘導后，最佳蛋白表達條件為：加IPTG時菌液OD600值：0.8；IPTG終濃度：0.3 mmol/L；誘導時間：8 h；誘導溫度：28℃。實驗證實提高培養(yǎng)基轉速增加營養(yǎng)與氧氣的供給，利于菌體的生長［16］，這與本研究發(fā)現(xiàn)的提高轉速結果一致。低溫誘導利于蛋白表達［12］，與本研究結果一致，生產中應采用低溫誘導。IPTG具有毒性，不利于菌體蛋白表達［17］，結合實際生產中經濟角度考慮，可采用低濃度IPTG誘導。合適的誘導時間利于蛋白的表達［18］，在工程菌發(fā)酵上應采用合適的誘導時間。此外，實驗發(fā)現(xiàn)最優(yōu)化條件下OprI的表達量高于其它的實驗組合，進一步證實驗設計的合理性，為實際生產提供依據。

因而，OprI工程菌蛋白發(fā)酵可按兩步進行：（1）IPTG誘導前，提高培養(yǎng)基轉速加快菌體生長到合適的誘導濃度；（2）IPTG誘導后，選擇菌體對數(shù)生長中期誘導、低溫、低濃度IPTG，以及誘導時間不易過長。

4 結論

本實驗獲得OprI蛋白的表達菌株；Westernblotting 證實表達的OprI蛋白能與抗體特異性結合；將純化的OprI蛋白免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)其激活的特異性免疫對小鼠銅綠假單胞菌感染的保護率達到顯著性的57.14%。正交試驗獲得OprI菌株最佳誘導表達條件為：加IPTG菌夜OD600值0.8，加IPTG終濃度 0.3 mmol/L，誘導時間 8 h，誘導溫度 28℃；菌株最佳培養(yǎng)條件為：轉速230 r/min，葡萄糖濃度0%，裝液量50 mL。

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（責任編輯 李楠）

Expression， Purification and Immunoprotection Potential of Pseudomonas aeruginosa Outer Membrane Lipoprotein I

Chen Chunlin1Liu Xiang1Wang Chengxiang2Zhang Xiaojuan1Ju Xiong1Zhang Tao1Wu Sanqiao1
（1. College of Biological Sciences and Engineering，Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723001；2. Special Education School in Feixi County of Anhui Province，Hefei 231200）

Outer membrane lipoprotein I（OprI）in Pseudomonas aeruginosa has solid immunogenicity and holds prospects in the development of vaccine. The OprI-expressing strain was obtained by molecular cloning. Western blotting verified that antibody specifically combined with OprI. The purified OprI was gained by the SDS-PAGE gel slices. Immunizing mice with OprI， specific immunity activated by OprI protected 57. 14% mice from P. aeruginosa infection， which reached significant protection compared with the control group. The orthogonal experiment was employed to obtain the optimal inducing expressing condition of OprI strain：strain OD600value，IPTG final concentration，inducing time and temperature，were 0. 8，0. 3 mmol/L，8 h，and 28℃，respectively；the optimal culture condition was that the rotation rate，glucose concentration，and medium volume were 230 r/min，0% and 50 mL，respectively. This work laid the groundwork for the researches on industrial fermentation，protein function and vaccine development of OprI.

Pseudomonas aeruginosa；OprI protein；immunoprotection；orthogonal experiment；induction conditions

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.032

2014-11-18

陜西省教育廳科學研究計劃（14JK1152），陜西理工學院人才啟動項目（SLGQD13-15）

陳春琳，女，碩士研究生，研究方向：分子生物學；E-mail：chen2362505579@163.com

劉祥，男，博士，碩士生導師，研究方向：蛋白質組學與免疫學；E-mail：liuxiang888525@163.com