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    肺炎鏈球菌SPD1587蛋白的表達純化及晶體生長研究

    2015-10-27 07:18:05黃健黃美容駱詩露朱杰華閔迅
    生物技術通報 2015年7期
    關鍵詞:晶體生長毒力鏈球菌

    黃健黃美容駱詩露朱杰華閔迅

    (1.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院醫(yī)學檢驗科,遵義 563003;2.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院輸血科,遵義 563003)

    肺炎鏈球菌SPD1587蛋白的表達純化及晶體生長研究

    黃健1黃美容2駱詩露1朱杰華1閔迅1

    (1.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院醫(yī)學檢驗科,遵義 563003;2.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院輸血科,遵義 563003)

    SPD1587蛋白是肺炎鏈球菌D39菌株中的一種轉錄因子,其在鼻咽部定植和肺部感染過程中發(fā)揮著重要作用。生物信息學分析提示其具有與A群鏈球菌的轉錄因子Mga蛋白相似的結構,目前其三維結構尚未被解析。成功構建了SPD1587蛋白的全長表達載體PET28a-spd1587,利用大腸桿菌BL21(DE3)菌株進行原核表達,獲得了以可溶形式表達的目的蛋白。經(jīng)Ni-NTA柱親和層析及DEAE陰離子交換層析純化后,獲得了高純度的目的蛋白。采用懸滴氣相擴散法獲得了SPD1587蛋白晶體。

    肺炎鏈球菌;SPD1587蛋白;原核表達;晶體生長

    肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)是引起細菌性肺炎、中耳炎、腦膜炎等疾病的一種常見致病菌。其在嬰幼兒及老年人中具有較高的發(fā)病率與死亡率,全世界每年約有160萬人死于與S.pn感染相關的疾?。?]。毒力因子在肺炎鏈球菌致病過程中扮演著較為重要的角色,針對不同的感染局部微環(huán)境,其可通過自身轉錄因子調(diào)控莢膜多糖、磷壁酸等重要毒力因子的表達,以利于其建立感染及適應宿主局部微環(huán)境[2]。因此,研究肺炎鏈球菌毒力基因的轉錄調(diào)控機制,對于了解肺炎鏈球菌逃避宿主防御、建立感染的分子機制有重要意義。

    Mga蛋白是A群鏈球菌中一種重要的轉錄因子,可調(diào)節(jié)多種重要毒力基因的表達[3]。SPD1587蛋白是肺炎鏈球菌中的一種與Mga蛋白結構相似的轉錄因子。研究顯示,其在肺炎鏈球菌鼻咽部定植及肺部感染中發(fā)揮著重要作用[4]。但其調(diào)控毒力基因表達的具體分子機制目前還了解較少,為了能更深入研究SPD1587蛋白在肺炎鏈球菌轉錄調(diào)控過程中的生物學功能,本研究擬對SPD1587蛋白進行原核表達、純化及晶體生長,以期為下一步的蛋白晶體衍射、結構解析及功能研究奠定基礎。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株與質粒 肺炎鏈球菌D39菌株、大腸桿菌DH5α菌株、BL21(DE3)菌株、PET28a質粒均為本室保存。

    1.1.2 試劑 細菌基因組DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司;Primer star 高保真DNA聚合酶,限制性內(nèi)切酶BamH I、Xho I,T4DNA連接酶購自大連寶生物工程有限公司;His Bind Column(Ni-NTA)樹脂、DEAE陰離子交換柱購自美國GE公司;蛋白晶體篩選試劑盒Crystal Screen Kit I&II及PEG screen I&II購自美國Hampton Research公司。

    1.2 方法

    1.2.1 生物信息學分析 采用NCBI保守結構域在線分析軟件(Conserved Domain Search Service),分析SPD1587蛋白結構域以預測其可能的生物學功能。

    1.2.2 SPD1587蛋白原核表達載體構建 以肺炎鏈球菌D39菌株基因組DNA為模板,以上游引物:5'-CGCGGATCCATGAGAGATTTATTATCT -3'(下劃線為BamH I酶切位點),下游引物:5'-CCGCTCGAGTTACTCATCTAATCGAAT -3'(下劃線為Xho I酶切位點)擴增spd1587基因。擴增產(chǎn)物和PET28a質粒經(jīng)BamH I,Xho I雙酶切后進行連接構建PET28a-spd1587重組表達質粒,轉化入大腸桿菌DH5α菌株,在含50 mg/L卡那霉素的LB平板上篩選陽性克隆,提取質粒后行雙酶切鑒定后,送南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序鑒定。

    1.2.3 SPD1587蛋白表達及純化 將鑒定正確的PET28a-spd1587表達質粒轉入大腸桿菌BL21(DE3)表達菌中,接種于LB培養(yǎng)液(含50 mg/L卡那霉素)中,37℃培養(yǎng)至光密度A600=0.5-0.6時,加入0.2 mmol/L的IPTG,25℃誘導8 h,12 000×g離心10 min收集菌體,超聲破菌后SDS-PAGE鑒定蛋白表達形式。破菌液經(jīng)12 000×g離心10 min收集上清液,用His Bind Column(Ni-NTA)對蛋白進行親和層析純化,并進一步利用DEAE陰離子交換柱對蛋白進行純化,后行SDS-PAGE電泳鑒定蛋白純度,純化的蛋白經(jīng)脫鹽、超濾濃縮后分裝,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.4 SPD1587蛋白的晶體生長 以5 mmol/L Tris-HCl緩沖液(含50 mmol/L NaCl,pH8.0)稀釋蛋白濃度為20 mg/mL,用Crystal screen Ⅰ和Ⅱ、PEGⅠ和Ⅱ試劑盒以懸滴氣相擴散法行晶體初篩,池液200 μL,將1 μL母液與1 μL SPD1587蛋白混合后加樣于硅化處理的玻片上,用凡士林封板,在20℃恒溫條件下進行晶體生長。

    2 結果

    2.1 生物信息學分析

    保守結構域分析(圖1)顯示,該蛋白擁有與Mga蛋白結構相似的2個DNA結合的HTH結構域和1個具有轉錄調(diào)控功能的 PRD結構域。

    圖1 SPD1587蛋白保守結構域分析

    2.2 目的基因的擴增及表達載體構建

    挑選陽性克隆經(jīng)菌液PCR鑒定正確后,提取重組質粒經(jīng)雙酶切鑒定,能夠獲得1 483 bp大小的酶切產(chǎn)物(圖2),經(jīng)測序鑒定插入序列與GenBank中肺炎鏈球菌D39菌株的spd1587基因序列完全相同(圖3)。

    2.3 SPD1587蛋白的表達及Ni-NTA純化

    含PET28a-spd1587重組表達質粒的大腸桿菌BL21(DE3)表達菌,經(jīng)IPTG誘導后SPD1587重組蛋白主要以可溶形式表達,分子量約為59 kD,與預期結果相符,經(jīng)Ni-NTA親和純化后,獲得了純度較好的目的蛋白(圖4)。

    圖2 PET28a-spd1587重組表達質粒雙酶切鑒定

    圖3 PET28a-spd1587原核表達質粒測序圖

    圖4 重組蛋白SPD1587的SDS-PAGE電泳圖

    2.4 重組蛋白SPD1587的DEAE陰離子交換純化

    以DEAE陰離子交換層析進一步對SPD1587蛋白進行純化,從層析圖譜上可見一個較大的洗脫峰(圖5-A),收集該洗脫峰處的蛋白行SDS-PAGE分析,SPD1587蛋白純度達到了預期要求(圖5-B),可用于后續(xù)晶體生長。

    2.5 SPD1587蛋白晶體生長

    SPD1587蛋白在20℃條件下生長后,在多種條件下培養(yǎng)出了大小不一、呈長棒狀、欠規(guī)則的方形晶體(圖6-A),挑取晶體行SDS-PAGE電泳,結果(圖6-B)顯示其分子量大小與SPD1587蛋白相符,提示生長的晶體為SPD1587蛋白結晶而成。

    3 討論

    肺炎鏈球菌通常定植于健康人群的鼻咽部但并不致病,當宿主免疫力低下時,其會侵入肺、血液等部位,引起肺炎、敗血癥等嚴重疾?。?]。從鼻咽部遷移侵襲到肺的過程中,肺炎鏈球菌會調(diào)節(jié)相應毒力基因的表達,可呈現(xiàn)出透明型和不透明型細菌形態(tài)間的轉換[6]。不透明菌株較透明菌株在定植、生物被膜形成及上皮細胞粘附等能力上顯著減弱,但抗吞噬能力更強,可利于建立系統(tǒng)感染[7]。近年來肺炎鏈球菌的毒力基因調(diào)控網(wǎng)絡的研究成為其致病分子機制領域的一個熱點。鑒定出毒力基因相關的調(diào)控網(wǎng)絡將有助于設計新的抗菌藥物靶點從而抑制毒力基因的表達。目前,仍然有許多重要毒力基因的調(diào)控機制尚不清楚。

    Mga蛋白是A群鏈球菌中一種重要的轉錄因子,與細菌毒力基因的表達調(diào)控密切相關[8]。最近研究發(fā)現(xiàn),當Mga蛋白201位的組氨酸突變?yōu)榫彼岷?,會顯著增強細菌的毒力,這與此突變可顯著增加mga基因表達,從而上調(diào)其他54種毒力相關基因表達有關[9]。SPD1587蛋白具有與Mga蛋白相似的DNA結合HTH結構域和轉錄調(diào)控功能域,它在不同血清型肺炎鏈球菌間高度保守,提示其可能在調(diào)控毒力基因表達過程中發(fā)揮著重要作用。利用基因芯片篩選發(fā)現(xiàn)SPD1587蛋白可抑制肺炎鏈球菌rlrA致病島中多種毒力基因的表達[10],但目前rlrA致病島僅存在于較少血清型肺炎鏈球菌中[11],提示在不同血清型肺炎鏈球菌中或不同生長環(huán)境下,SPD1587基因的調(diào)控網(wǎng)絡可能存在差異。

    圖5 陰離子交換層析(A)及SPD1587蛋白SDS-PAGE電泳圖(B)

    圖6 SPD1587蛋白晶體(A)及SDS-PAGE(B)

    目前,SPD1587蛋白的三維結構尚未被解析,而蛋白結構解析對于弄清其轉錄調(diào)控過程中的DNA結合方式、調(diào)控功能具有重要意義。因此,為開展對SPD1587蛋白晶體結構解析的工作,本研究對其進行了原核表達、純化及晶體生長研究。采用大腸桿菌表達系統(tǒng),本研究獲得了以可溶形式表達的SPD1587蛋白。經(jīng)Ni柱親和純化以及DEAE純化后,得到了純度較高的目的蛋白用于晶體培養(yǎng),并成功培養(yǎng)出來質量較好的蛋白晶體,為下一步的蛋白晶體優(yōu)化、X射線衍射及結構解析奠定了很好的工作基礎。

    4 結論

    成功在大腸桿菌中表達出可溶形式的SPD1587蛋白,經(jīng)Ni柱親和純化以及DEAE純化后,得到了純度較高的目的蛋白用于晶體生長,最終獲得了質量較好的蛋白晶體。

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    (責任編輯 李楠)

    Expression,Purification,Crystallization of SPD1587 Protein from Streptococcus pneumoniae

    Huang Jian1Huang Meirong2Luo Shilu1Zhu Jiehua1Min Xun1
    (1. Department of Laboratory Medicine,Affiliated Hospital of Zunyi Medical College,Zunyi 563003;2. Department of Blood Transfusion,Affiliated Hospital of Zunyi Medical College,Zunyi 563003)

    SPD1587 protein is a transcription factor of streptococcus pneumoniae D39 strains, which plays an important role in nasopharyngeal colonization and lung infection. It has a conserved domain that was similar to transcription factors Mga of group A streptococcus,but the protein three-dimensional structure is unclear. In this study, the protein expression vector of PET28a-spd1587 was successfully constructed and a soluble form of SPD1587 protein was acquired in Escherichia coli BL21(DE3)strain. High purity SPD1587 protein was obtained by Ni-NTA affinity chromatography and DEAE negative ion exchange chromatography. The crystal of SPD1587 protein was obtained by the vapor diffusion method.

    Streptococcus pneumoniae;SPD1587 protein;prokaryotic expression;crystal grow

    10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.035

    2015-03-26

    國家自然科學基金項目(81460317),貴州省社會發(fā)展公關計劃(2012GZ83293)

    黃健,男,碩士,研究方向:細菌致病分子機制研究;E-mail:81537648@qq.com

    閔迅,男,博士,研究方向:細菌蛋白疫苗及結構研究;E-mail:zmchj2001@163.com

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