木瓜蛋白酶提取蜚蠊多糖最佳工藝研究

李曉慶 富堯 陳光道 韓曉玥 常江春 羅志文 許龍

摘要[目的] 優(yōu)化木瓜蛋白酶提取美洲大蠊多糖的工藝參數(shù)。 [方法]利用不同梯度木瓜蛋白酶對美洲大蠊進行蜚蠊多糖提取試驗，采用單因素和正交試驗的方法，考察最佳酶用量、提取時間、溫度等相關參數(shù)對提取液中多糖的含量的影響，確定蜚蠊多糖提取的工藝。[結果]試驗表明，蜚蠊多糖提取的最佳條件為：酶用量為300 μg/g，提取溫度60 ℃，提取時間1.0 h。[結論] 研究可為建立高效、實用的蜚蠊多糖提取途徑提供技術參考，同時也為美洲大蠊的保健藥品及功能性食品開發(fā)提供可靠的科學依據(jù)。

關鍵詞蜚蠊多糖；酶解法；提取工藝；條件優(yōu)化

中圖分類號TS218文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2015）34-081-03

美洲大蠊（Periplaneta americana L.），為昆蟲有翅亞綱蜚蠊目大蠊屬昆蟲，俗稱“蟑螂”，也稱其為石姜、滑蟲，各地方都有其不同的俗名，如偷油婆、茶婆子、灶螞子等[1]。在《本草綱目拾遺》中，蟑螂作為俗名首次出現(xiàn)。蟑螂作為藥用昆蟲最早記載于《神農本草經(jīng)》中列為中品，味咸、寒，可治療寒熱癥、破積聚、喉咽閉、體寒無子等病癥。在歷代重要本草典籍如《新修本草》、《本草綱目》中都有記載，近代許多藥學專著中也有記述[2]。從美洲大蠊的研究文獻來看，目前國內的研究主要集中在美洲大蠊的種群調查、分布、發(fā)生規(guī)律及防治技術，包括不同種類殺蟲劑對美洲大蠊殺滅效率的比較與殺滅機理的研究；基因表達和致敏作用方面的研究；藥用價值開發(fā)的研究[3-5]等。

筆者采用木瓜蛋白酶水解法對美洲大蠊中的蜚蠊進行多糖提取試驗，優(yōu)化其多糖的提取工藝，為建立高效、實用的蜚蠊多糖提取途徑提供技術參考。研究采用了苯酚-硫酸法測定蜚蠊多糖的含量，對比不同提取條件多糖的提取率，為后續(xù)美洲大蠊的保健藥品及功能性食品開發(fā)提供可靠的科學依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料美洲大蠊藥材郵購自河北省安國中藥材大市場，經(jīng)佳木斯大學生命科學學院羅志文副教授鑒定為蜚蠊目鱉蠊科美洲大蠊，原藥材及樣品現(xiàn)保存于佳木斯大學應用昆蟲研究所。

1.2樣品預處理

采用精細中藥粉碎機對干燥后的美洲大蠊原藥材進行粉碎，粉碎后過40目篩，放于55 ℃恒溫箱內干燥后保存?zhèn)溆谩?/p>

預處理是采用石油醚除去脂溶性雜質，按照原料∶石油醚=1∶3（W/V）的量加入石油醚，室溫下浸泡10 h后，抽濾，采用旋轉蒸發(fā)儀濃縮回收石油醚，重復2次，于50 ℃干燥后保存?zhèn)溆肹6]。

1.3試驗方案

稱取處理過的美洲大蠊粉末各5 g，按試驗設定的木瓜蛋白酶用量、提取溫度、提取時間在恒溫水浴鍋內進行美洲大蠊的多糖提取，試驗完成后，迅速將提取液升溫至100 ℃對酶滅活5 min，抽濾，并用50 ℃真空旋轉蒸發(fā)器濃縮，濃縮液加入3倍量的95 %乙醇在4 ℃冰箱內醇沉24 h，采用大容量低速離心機離心10 min，沉淀物用無水乙醇洗滌脫水2次，低溫干燥得到蜚蠊多糖[7]。

1.3.1蜚蠊多糖提取工藝的單因素試驗。

對美洲大蠊提取多糖進行單因素試驗，包括木瓜蛋白酶用量、提取時間、提取溫度，試驗因素水平范圍分別為：木瓜蛋白酶用量（A）為100～600 μg/g；提取溫度（B）為40～65 ℃；提取時間（C）為0.5～3.0 h。每個影響因子設計3個重復性試驗，選用平均值作為試驗參數(shù)，確定各因素對試驗的影響[8]。

1.3.2蜚蠊多糖提取工藝的正交試驗。為了進一步優(yōu)化提取條件，根據(jù)單因素試驗結果，選擇了木瓜蛋白酶用量（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）這3個因素進行正交優(yōu)化試驗，采用L9（33）正交表安排試驗[9]，各因素水平見表 1。

2結果與分析

2.1單因素試驗

2.1.1蛋白酶用量對蜚蠊多糖提取的影響。

由圖1可見，隨著木瓜蛋白酶用量的逐漸增加，提取得到的蜚蠊多糖含量也隨之增大，用量在200～300 μg/g時多糖含量增加的幅度較大，可能是由于隨著濃度梯度的幅度增大，細胞內容物的擴散動力就越大，多糖溶出物就越多。而當酶用量為300 μg/g時，多糖的含量最大，達18.101%。

2.1.2提取時間對蜚蠊多糖提取的影響。由圖2可見，隨著提取時間的逐漸延長，蜚蠊多糖含量也逐漸增加，1.0～2.0 h間蜚蠊多糖含量增加的幅度不明顯，而1.5～2.0 h間多糖含量增加的幅度不明顯，在酶作用下，多糖隨著提取時間延長，所得多糖含量也增加，時間過長，酶活動減弱。在提取時間3.0 h時，多糖含量17.532%。

2.1.3溫度對蜚蠊多糖提取的影響。

溫度對多糖的提取具有顯著影響。由圖3可見，隨著提取溫度的升高，蜚蠊多糖含量也隨之增加，從45 ℃到50 ℃增加的幅度較明顯，可能由于隨著溫度的升高而酶活力逐漸加強。溫度顯著降低時，多糖含量變化不顯著，而當溫度升高到一定程度，可能會影響到木瓜蛋白酶的活性，多糖提取率呈逐漸下降趨勢。提取溫度為50 ℃時，多糖含量最高，為20.135%。

2.2正交試驗

由表 2試驗結果可知，不同因素對蜚蠊多糖含量影響的順序為：A>B>C，即酶用量對蜚蠊多糖含量影響最大，其次為提取溫度也影響著蜚蠊多糖的提取含量，提取時間影響較小。通過試驗，我們最后確定了蜚蠊多糖含量最佳的提取工藝條件為A3B3C1，即酶用量為300 μg/g，提取溫度60 ℃，提取時間1.0 h時提取的蜚蠊多糖含量最多。

3結論與討論

酶解法是近幾年來提取動物多糖的先進技術，這種方法的優(yōu)點是不會造成多糖的損失，可減少原材料的浪費。而試驗表明，不同材料提取次數(shù)過多，不僅浪費提取液和時間，還會產(chǎn)生大量濾液，濃縮較為困難。因此，選擇合理的提取次數(shù)不僅節(jié)省原藥材，降低成本投入，也不會明顯影響多糖的提取量。

影響蜚蠊多糖提取率的因素主要有：木瓜蛋白酶用量、提取溫度、提取時間等因素。通過正交試驗得出，提取溫度對蜚蠊多糖含量影響最大，其次為木瓜蛋白酶用量，提取時間和提取次數(shù)對多糖提取影響較小，蜚蠊多糖最佳提取工藝條件A3B3C1，即酶用量為300 μg/g，提取溫度60 ℃，提取時間1.0 h時提取的蜚蠊多糖含量最多。

通過酶解法來提取蜚蠊多糖工藝的優(yōu)化研究，可以獲得非常理想的優(yōu)質蜚蠊多糖，為后期開展蜚蠊多糖的分離純化、多糖成分分析及對荷瘤小鼠抗腫瘤活性等試驗積累試驗數(shù)據(jù)，也為將來開發(fā)優(yōu)良的昆蟲多糖藥物及功能性食品服務。

參考文獻

[1]

肖小芹.美洲大蠊生物學特性及藥用價值研究[D].長沙：中南大學，2007.

[2] 蕭慶慈，肖泓，劉昆平.蜚蠊的古今應用[J].云南中醫(yī)學院學報， 2012， 35（1）： 55-59.

[3] 高永翔，扈曉宇，鐘森.蟑螂提取物對急性肝損傷動物模型的干預[J].藥物研究，2006，15（10）：3-4.

[4] 張丹.美洲大蠊抗腫瘤活性成分及其結腸定位片的研究[D].成都：成都中醫(yī)藥大學，2014：1-106.