生防菌XM—10對黃瓜枯萎病菌的拮抗機理

張雪輝　唐蕊　孟春燕　馬錫

摘要：采用對峙培養(yǎng)法、菌落直徑法，測定了生防菌XM-10菌體及其發(fā)酵液各組分對黃瓜枯萎病菌的抑制作用。結(jié)果表明，生防菌XM-10對黃瓜枯萎病菌抑制作用較強，抑菌率為83.7%，抑菌帶達6.9mm；其主要的抑菌物質(zhì)存在于生防菌的胞內(nèi)，且抑菌活性與其菌體數(shù)量呈正相關；通過顯微觀察，發(fā)現(xiàn)其對黃瓜枯萎病菌的菌絲和孢子均有強烈的抑制作用。

關鍵詞：黃瓜枯萎病菌；抑菌機理；生防菌

中圖分類號：S436.421.1+3 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2015）05-0127-02

黃瓜枯萎病是由半知菌亞門的尖孢鐮刀菌黃瓜?；停‵usariumoxysporum f.sp.cucumberium）引起的，是影響黃瓜生長的主要病害之一，在我國普遍發(fā)生，危害很大。目前防治此類病害主要采用噴施化學農(nóng)藥的方法，但采用化學農(nóng)藥防治易造成環(huán)境污染、人畜中毒、農(nóng)藥殘留等問題。輪作、嫁接等方式也不能從根本上解決這一問題。隨著人們對蔬菜數(shù)量和質(zhì)量要求的不斷提高和對保護人類生存環(huán)境的日益重視，以及可持續(xù)農(nóng)業(yè)觀念的不斷深入，“以菌治菌”的方法以安全、無殘留、無污染等優(yōu)點，成為防治農(nóng)業(yè)病害的最佳選擇。本研究利用從土壤中篩選出的對黃瓜枯萎致病菌有較好拮抗作用的生防菌XM-10，進行了對黃瓜枯萎病菌生長的抑制活性及其抑菌機理的初步研究，為開發(fā)環(huán)境友好型微生物農(nóng)藥奠定基礎。

1.材料與方法

1.1材料

菌株：生防菌XM-lO、黃瓜枯萎病菌均由邢臺學院微生物實驗室提供。

培養(yǎng)基：高氏一號培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基和高氏一號液體培養(yǎng)基。

1.2方法

1.2.1生防菌XM-10對黃瓜枯萎病菌抑菌活性測試采用對峙培養(yǎng)法，將生防菌XM-10與黃瓜枯萎病菌同步活化，以黃瓜枯萎病菌為靶標菌，用打孔器取直徑為1.0cm的菌盤，置于PDA平皿的中央，取平皿靠近邊緣一側(cè)某點用接種針接人生防菌XM-10菌株，3次重復，在25qC培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4d后，用“十”字交叉法測量記錄菌落直徑，測量抑菌帶.

1.2.2生防菌XM-10抑菌機理探究

1.2.21菌體培養(yǎng)時間的確定

用接種針挑取活化好的XM-10菌體，接于高氏一號液體培養(yǎng)基中，在其他條件均適宜的情況下培養(yǎng)，每隔12h取3瓶，觀察菌體生長情況，過濾得到菌體，測得菌體干質(zhì)量，用于質(zhì)量法測定菌體生長量，取平均值。以時間為橫坐標、菌體生長量為縱坐標，繪制生防菌XM-10的生長曲線，確定最佳培養(yǎng)時間。

1.2.2.2抑菌機理探究取生防菌XM-10的培養(yǎng)液，利用細菌過濾器和定性濾紙分別過濾得無菌濾液和粗濾液（含少量放線菌）。將無菌濾液和粗濾液加入融化好的PDA培養(yǎng)基中，每20mLPDA加入1mL菌液，混勻后倒平板。在平板中央接入直徑為1.0cm的黃瓜枯萎菌盤，利用無菌水為對照組，3個重復，25℃條件下培養(yǎng)96h，觀察、測定菌落直徑，計算抑菌率。

抑菌率=[1-（處理生長直徑-菌餅直徑）/（對照生長直徑一菌餅直徑）]×100%。

胞內(nèi)產(chǎn)物抑菌活性測定：取XM-lO的培養(yǎng)液，在3500r/min條件下離心5min，去上清，保留菌體。分別取0.10、0.20、O.30、0.40、O.50、0.60g菌體，用研缽研磨5～10min，加入10mL無菌水稀釋，再加10m∥mL的溶菌酶溶液10μ，37℃水浴1h，過濾得濾液。在融化好的PDA培養(yǎng)基中加入各濃度的濾液，20mLPDA加入1mL濾液，混勻后倒平板。方法同上，測定抑菌活性。

1.2.2.3黃瓜枯萎病菌菌體形態(tài)變化觀察

取PDA平板，在平板的兩側(cè)分別接入黃瓜枯萎病菌菌盤及少量XM-10菌體。在其連線上插入滅好菌的蓋玻片，并在黃瓜枯萎病菌菌盤一側(cè)插入另一滅菌的蓋玻片為對照組。在25qC條件下培養(yǎng)。一段時間后，取出蓋玻片，顯微觀察，比較正常生長的黃瓜枯萎病菌菌體與受抑制后的黃瓜枯萎病菌菌體形態(tài)特征上的變化。2結(jié)果與分析

2.1生防菌XM-10對黃瓜枯萎病菌的抑菌活性測試

抑菌活性結(jié)果顯示，菌株XM-10對黃瓜枯萎病菌有很好的拮抗作用?？拷谰粋?cè)的黃瓜枯萎病菌菌絲生長受到抑制，形成明顯的抑菌帶，抑菌帶為6.9mm。經(jīng)計算，生防菌XM-10對黃瓜枯萎病菌的抑菌率達83.7%。

2.2抑菌機理探究

2.2.1最適培養(yǎng)時間的確定生防菌XM一10的生長曲線如圖1所示。結(jié)果表明，0～36h期間菌體處于生長的遲緩期，在36～96h時間段內(nèi)菌體快速生長，處于對數(shù)生長期；96～144h逐漸處于穩(wěn)定期并保持穩(wěn)定；144h之后菌體干質(zhì)量略有下降，開始進入衰亡期?？紤]到菌體生長量剛剛達到最大時，抑菌物質(zhì)積累不一定最大，因此選取不同培養(yǎng)時間的生防菌分別進行抑菌活性測試，測量其與黃瓜枯萎病菌間產(chǎn)生的抑菌帶的大小。由表1可見，不同培養(yǎng)時間間抑菌活性差別不大，故培養(yǎng)時間確定為96h。

2.2.2抑菌機理探究通過添加無菌水、無菌濾液和粗濾液（含少量放線菌）的抑菌活性測試對比試驗（圖2），得知無菌濾液對黃瓜枯萎病菌抑制作用不明顯，而添加粗濾液的平板中長出生防菌XM-10菌體，其抑制率高達80.2%，故可得知在菌體存在的情況下抑制效果更好，即抑菌活性物質(zhì)源于胞內(nèi)而非胞外。胞內(nèi)物質(zhì)抑菌效果測定結(jié)果（圖3）表明，該生防菌的抑菌活性與菌體數(shù)量呈正相關，即胞內(nèi)抑菌物質(zhì)的量與其菌體牛長量是同步增加的.

2.2.3處理前后黃瓜枯萎病菌菌體形態(tài)變化觀察待菌絲生長到蓋玻片后，取出蓋玻片，將抑菌帶周圍的黃瓜枯萎病菌菌絲體與正常部位的菌絲體在顯微鏡下進行對比觀察。結(jié)果（圖4）顯示，正常部位菌絲生長茂盛，菌絲粗壯，細胞壁較厚（圖4-A），孢子數(shù)量多（圖4-C）；受抑制部位的菌絲生長稀疏，菌絲纖細、畸形扭曲，菌絲體分枝減少，細胞破損甚至死亡（圖4-B），產(chǎn)孢量明顯減少（圖4-D）。表明生防菌XM-10對黃瓜枯萎病菌的菌絲和孢子均有強烈的抑制作用，尤其是對孢子的抑制作用很明顯。

3.結(jié)論與討論

本試驗以黃瓜枯萎病菌為靶標菌，測定生防菌XM-10對其抑菌活性，并對生防菌XM一10的抑菌機理進行了初步研究。結(jié)果表明，XM一10菌株對黃瓜枯萎病菌有很好的拮抗抗作用，抑菌率達到83.7%，抑菌帶為6.9mm。在抑菌機理探究的試驗過程中利用黃瓜枯萎致病菌與高氏一號液體培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的生防菌XM-10的無菌濾液和粗濾液分別對峙培養(yǎng)，顯示粗濾液對黃瓜枯萎病菌的拮抗作用更加明顯，而不含XM一10菌體的濾液對黃瓜枯萎病菌表現(xiàn)很弱的拮抗作用。這種差異的產(chǎn)生在于其主要的抑菌物質(zhì)存在于生防菌的胞內(nèi)而非胞外。通過胞內(nèi)物質(zhì)抑菌效果測定可以得出，該生防菌的抑菌活性與菌體數(shù)量呈正相關，即胞內(nèi)抑菌物質(zhì)的量與其菌體生長量是同步增加的。通過生防菌xM-10作用黃瓜枯萎病菌菌體后的形態(tài)變化觀察，結(jié)果顯示其對黃瓜枯萎病菌的菌絲和孢子均有較強的抑制作用。

放線菌作為天然抗生素等生物活性物質(zhì)的主要生產(chǎn)者，是生防菌的重要來源，是廣泛實用的生物資源。黃瓜枯萎病是生產(chǎn)中危害較嚴重的土傳性病害，防治困難。生防菌作為一種資源豐富的微生物類群，大力開展對黃瓜枯萎病的生物防治，合理利用其產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)控制病害的發(fā)生，是我國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的需要。目前，我國在生物防治方面雖然取得了一定的成績，但仍面臨著許多的技術(shù)難題，如何保持生防菌防治效果，將其大范圍地應用到生產(chǎn)實踐，使其與周圍環(huán)境相適應，是目前及未來一段時間內(nèi)需要解決的問題。