潘曉曦+關(guān)一鳴+吳連舉

摘要：菌株B-09是1株從人參根際土壤中篩選出的生防菌。為明確B-09菌株在人參灰霉病生防應(yīng)用中的潛力，進(jìn)行了B-09室內(nèi)抑菌效果和溫室防治效果試驗(yàn)。結(jié)果表明，室內(nèi)抑菌試驗(yàn)B-09活體菌株對(duì)人參灰霉病病原菌的抑菌圈直徑達(dá)32 mm；B-09無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)人參灰霉病病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率達(dá)90%以上，對(duì)人參灰霉病病原菌孢子萌發(fā)的抑制率達(dá)87%以上。在溫室控病試驗(yàn)中，B-09無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)人參灰霉病的防治效果達(dá)78.6%左右，與化學(xué)藥劑處理組效果相當(dāng)，表明供試生防菌可開發(fā)為生物農(nóng)藥的潛力。

關(guān)鍵詞：生防菌；人參灰霉?。灰志饔?；生物防治

中圖分類號(hào)： S435.675 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）03-0074-02

人參為五加科多年生草本植物，以根莖、葉、花、果實(shí)入藥，具有大補(bǔ)元?dú)?、?fù)脈固脫、補(bǔ)氣益血、生津、安神等功效[1]。人參灰霉病是20世紀(jì)80年代國(guó)內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的病害，該病以危害人參的葉片、葉柄、花、果實(shí)為主，嚴(yán)重時(shí)危害根部，1981—1988年吉林省栽培人參該病的發(fā)病率達(dá)20%～30%。自2002年以來(lái)，吉林省人參灰霉病發(fā)生頻繁，已成為影響人參產(chǎn)量的主要病害之一[2]。目前，該病的防治主要以化學(xué)防治為主，由于長(zhǎng)期大量使用化學(xué)農(nóng)藥，給生態(tài)環(huán)境、藥材品質(zhì)帶來(lái)了不可忽視的危害；另外因植物病原菌對(duì)常用化學(xué)藥劑抗藥性的逐漸增強(qiáng)，使其防效不斷下降。因此，有針對(duì)性地使用生物農(nóng)藥，開發(fā)微生物殺菌劑是植物病害防治的必然趨勢(shì)。試驗(yàn)以抗菌譜較廣的生防菌B-09為材料，對(duì)菌株的抑菌活性和控病作用開展了研究，明確了生防菌B-09對(duì)人參灰霉病的抑制效果，為進(jìn)一步開發(fā)生物農(nóng)藥奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試生防菌枯草芽孢桿菌B-09，分離自吉林省撫松縣人參根際土壤。供試病原菌人參灰霉病病原菌，分離自吉林省吉安市人參種植基地人參灰霉病病株?；瘜W(xué)藥劑。80%多菌靈可濕性粉劑，北京綠怡園科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)。培養(yǎng)基。PDA培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生防菌B-09無(wú)菌發(fā)酵液的制備 將菌株B-09接種于NA培養(yǎng)基活化24 h后，取直徑3mm的菌餅轉(zhuǎn)接于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，離心后取上清液，再用0.22 μm微孔濾膜濾去上清液中殘留菌體，制得B-09無(wú)菌發(fā)酵液。

1.2.2 B-09菌株平板內(nèi)拮抗作用 利用平板對(duì)峙法[3]，在PDA平板中央接種直徑為6 mm的病原菌菌餅，距菌餅 25 mm 處用接種針點(diǎn)接生防菌，以不接生防菌的PDA平板作為空白對(duì)照，于25 ℃溫箱培養(yǎng)，6 d后檢測(cè)生防菌株對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用，并測(cè)定抑菌圈直徑大小。每處理3次重復(fù)（下同）。

1.2.3 B-09無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用 將B-09無(wú)菌發(fā)酵液與冷卻至50 ℃左右的PDA培養(yǎng)基分別以1 ∶ 4、1 ∶ 6、1 ∶ 10、1 ∶ 18的體積比混勻（發(fā)酵液終濃度為20%、14%、9%、5%）倒平板，冷卻后于平板中央接種直徑 6 mm 病原菌菌餅，以裝有營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基與PDA培養(yǎng)基混合物的平板為對(duì)照，比例同上，于“1.2.2”節(jié)的條件下培養(yǎng) 6 d 后測(cè)量各處理病原菌菌絲直徑，并計(jì)算抑制率。

1.2.4 B-09無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)病原菌孢子萌發(fā)的抑制作用 用無(wú)菌水配制灰霉病病原菌孢子懸浮液，濃度為1×106 CFU/mL。將B-09無(wú)菌發(fā)酵液100%、50%、25%的稀釋液與等體積的灰霉病病原菌孢子懸浮液混合（發(fā)酵液終濃度為50%、25%、125%），用載玻片懸滴法[4]于25 ℃培養(yǎng)，以加入營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的孢子懸浮液為對(duì)照，24 h后鏡檢孢子萌發(fā)情況。

1.2.5 B-09無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)人參灰霉病防治試驗(yàn) 取3年生人參盆栽苗，每株人參苗針刺8個(gè)傷口，用人參灰霉病病原菌孢子懸浮液（濃度約為2×105 CFU/mL）噴灑接種，接種后保濕，36 h 后噴灑B-09無(wú)菌發(fā)酵液，6株為1處理，每處理設(shè)3次重復(fù)。10 d后觀察發(fā)病情況，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和病情指數(shù)，并計(jì)算防治效果[5-6]。對(duì)照組和化學(xué)藥劑組分別噴灑無(wú)菌水與多菌靈1 000倍液。病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下[7]：0級(jí)，無(wú)病斑；1級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉面積5%以下；3級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉面積6%～10%；5級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉面積11%～20%；7級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉面積21%～50%；9級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉面積50%以上。

2 結(jié)果與分析

2.1 B-09菌株平板內(nèi)抑菌效果

從圖1可見，生防菌與灰霉病病原菌對(duì)峙培養(yǎng)6 d后，在生防菌周圍形成直徑為32 mm的透明抑菌圈，且直徑大小不隨時(shí)間的推移而改變。顯微鏡下觀察可見，抑菌圈周圍的病原菌菌絲生長(zhǎng)緩慢，部分菌絲頂端膨大，并且細(xì)胞壁被破壞，原生質(zhì)體外泄，表現(xiàn)出溶菌現(xiàn)象（圖2）。

2.2 B-09菌株無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

從表1可見，B-09無(wú)菌發(fā)酵液在5.0%的濃度下對(duì)菌絲生長(zhǎng)有抑制作用，但效果不明顯；在14%、20%濃度下的抑菌效果較好，且二者沒有顯著差異。表明分無(wú)菌發(fā)酵液在14%的濃度下已能有效抑制病原菌菌絲的生長(zhǎng)。

3 討論與結(jié)論

近年來(lái)，某些國(guó)家正在逐漸淘汰化學(xué)農(nóng)藥，越來(lái)越多采用生物農(nóng)藥和生物肥料等生物防治措施控制和消滅植物病蟲害，并取得了顯著進(jìn)展[8-9]。生物農(nóng)藥包括細(xì)菌農(nóng)藥、真菌農(nóng)藥、病毒農(nóng)藥和抗生素農(nóng)藥四大類。由于生物農(nóng)藥具有選擇性強(qiáng)、效率高、成本低、不污染環(huán)境、對(duì)人畜無(wú)害等特點(diǎn)，某些國(guó)家正越來(lái)越多地將其應(yīng)用于農(nóng)作物防病、治蟲、防草等方面，推廣應(yīng)用前景廣泛。

生防菌B-09是從200余個(gè)人參土壤根際菌中經(jīng)過(guò)反復(fù)篩選后獲得的抗菌活性很強(qiáng)的菌株。試驗(yàn)結(jié)果表明，供試菌株的活菌體能夠良好地抑制人參灰霉病病原菌菌絲的生長(zhǎng)能力；菌株的無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)人參灰霉病病原菌菌絲生長(zhǎng)與孢子萌發(fā)均表現(xiàn)出顯著的抑制作用。在溫室盆栽試驗(yàn)中，B-09無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)人參灰霉病的防治效果達(dá)到78.6%，與常用化學(xué)農(nóng)藥效果相當(dāng)，但溫室是一個(gè)相對(duì)可控的系統(tǒng)，影響因素相對(duì)于田間要少，菌株B-09雖然具有一定開發(fā)為生物農(nóng)藥的潛力，但防控效果還需要進(jìn)一步進(jìn)行田間試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)：

[1]楊春澍.藥用植物學(xué)[M]. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1998：251-252.

[2]徐懷友，馬友德，張 輝，等. 人參灰霉病安全高效防治藥劑組合篩選研究[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，30（專輯）：44-47.

3]李小俊，成麗霞，吳彥彬，等. 拮抗菌抗菌譜及發(fā)酵液拮抗能力測(cè)定的新方法[J]. 生物技術(shù)，2007，17（1）：55-58.

[4]方中達(dá). 植病研究方法[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1998：152.

[5]Brunner K，Zeilinger S，Ciliento R，et al. Improvement of the Fungal Biocontrol Agent Trichoderma atroviride to Enhance both Antagonism and Induction of Plant Systemic Disease Resistance[J]. Applied and Environmental Microbiology，2005，71（7）：3959-3962.

[6]農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所. 農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則（一）[M]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社. 1998：45-51.

[7]王存興，李光武. 植物病理學(xué)[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社. 2012：92-94.

[8]陳志誼，張榮勝. 植物病害生防芽孢桿菌研究進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，28（5）：999-1006.

[9]楊敬輝，吉沐祥，文平蘭，等. 黃麻鏈霉菌NF0919菌株對(duì)水稻紋枯病的生防活性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，28（6）：1288-1293.

摘要：菌株B-09是1株從人參根際土壤中篩選出的生防菌。為明確B-09菌株在人參灰霉病生防應(yīng)用中的潛力，進(jìn)行了B-09室內(nèi)抑菌效果和溫室防治效果試驗(yàn)。結(jié)果表明，室內(nèi)抑菌試驗(yàn)B-09活體菌株對(duì)人參灰霉病病原菌的抑菌圈直徑達(dá)32 mm；B-09無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)人參灰霉病病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率達(dá)90%以上，對(duì)人參灰霉病病原菌孢子萌發(fā)的抑制率達(dá)87%以上。在溫室控病試驗(yàn)中，B-09無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)人參灰霉病的防治效果達(dá)78.6%左右，與化學(xué)藥劑處理組效果相當(dāng)，表明供試生防菌可開發(fā)為生物農(nóng)藥的潛力。

關(guān)鍵詞：生防菌；人參灰霉?。灰志饔?；生物防治

中圖分類號(hào)： S435.675 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）03-0074-02

人參為五加科多年生草本植物，以根莖、葉、花、果實(shí)入藥，具有大補(bǔ)元?dú)?、?fù)脈固脫、補(bǔ)氣益血、生津、安神等功效[1]。人參灰霉病是20世紀(jì)80年代國(guó)內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的病害，該病以危害人參的葉片、葉柄、花、果實(shí)為主，嚴(yán)重時(shí)危害根部，1981—1988年吉林省栽培人參該病的發(fā)病率達(dá)20%～30%。自2002年以來(lái)，吉林省人參灰霉病發(fā)生頻繁，已成為影響人參產(chǎn)量的主要病害之一[2]。目前，該病的防治主要以化學(xué)防治為主，由于長(zhǎng)期大量使用化學(xué)農(nóng)藥，給生態(tài)環(huán)境、藥材品質(zhì)帶來(lái)了不可忽視的危害；另外因植物病原菌對(duì)常用化學(xué)藥劑抗藥性的逐漸增強(qiáng)，使其防效不斷下降。因此，有針對(duì)性地使用生物農(nóng)藥，開發(fā)微生物殺菌劑是植物病害防治的必然趨勢(shì)。試驗(yàn)以抗菌譜較廣的生防菌B-09為材料，對(duì)菌株的抑菌活性和控病作用開展了研究，明確了生防菌B-09對(duì)人參灰霉病的抑制效果，為進(jìn)一步開發(fā)生物農(nóng)藥奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試生防菌枯草芽孢桿菌B-09，分離自吉林省撫松縣人參根際土壤。供試病原菌人參灰霉病病原菌，分離自吉林省吉安市人參種植基地人參灰霉病病株。化學(xué)藥劑。80%多菌靈可濕性粉劑，北京綠怡園科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)。培養(yǎng)基。PDA培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生防菌B-09無(wú)菌發(fā)酵液的制備 將菌株B-09接種于NA培養(yǎng)基活化24 h后，取直徑3mm的菌餅轉(zhuǎn)接于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，離心后取上清液，再用0.22 μm微孔濾膜濾去上清液中殘留菌體，制得B-09無(wú)菌發(fā)酵液。

1.2.2 B-09菌株平板內(nèi)拮抗作用 利用平板對(duì)峙法[3]，在PDA平板中央接種直徑為6 mm的病原菌菌餅，距菌餅 25 mm 處用接種針點(diǎn)接生防菌，以不接生防菌的PDA平板作為空白對(duì)照，于25 ℃溫箱培養(yǎng)，6 d后檢測(cè)生防菌株對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用，并測(cè)定抑菌圈直徑大小。每處理3次重復(fù)（下同）。

1.2.3 B-09無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用 將B-09無(wú)菌發(fā)酵液與冷卻至50 ℃左右的PDA培養(yǎng)基分別以1 ∶ 4、1 ∶ 6、1 ∶ 10、1 ∶ 18的體積比混勻（發(fā)酵液終濃度為20%、14%、9%、5%）倒平板，冷卻后于平板中央接種直徑 6 mm 病原菌菌餅，以裝有營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基與PDA培養(yǎng)基混合物的平板為對(duì)照，比例同上，于“1.2.2”節(jié)的條件下培養(yǎng) 6 d 后測(cè)量各處理病原菌菌絲直徑，并計(jì)算抑制率。

1.2.4 B-09無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)病原菌孢子萌發(fā)的抑制作用 用無(wú)菌水配制灰霉病病原菌孢子懸浮液，濃度為1×106 CFU/mL。將B-09無(wú)菌發(fā)酵液100%、50%、25%的稀釋液與等體積的灰霉病病原菌孢子懸浮液混合（發(fā)酵液終濃度為50%、25%、125%），用載玻片懸滴法[4]于25 ℃培養(yǎng)，以加入營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的孢子懸浮液為對(duì)照，24 h后鏡檢孢子萌發(fā)情況。

1.2.5 B-09無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)人參灰霉病防治試驗(yàn) 取3年生人參盆栽苗，每株人參苗針刺8個(gè)傷口，用人參灰霉病病原菌孢子懸浮液（濃度約為2×105 CFU/mL）噴灑接種，接種后保濕，36 h 后噴灑B-09無(wú)菌發(fā)酵液，6株為1處理，每處理設(shè)3次重復(fù)。10 d后觀察發(fā)病情況，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和病情指數(shù)，并計(jì)算防治效果[5-6]。對(duì)照組和化學(xué)藥劑組分別噴灑無(wú)菌水與多菌靈1 000倍液。病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下[7]：0級(jí)，無(wú)病斑；1級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉面積5%以下；3級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉面積6%～10%；5級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉面積11%～20%；7級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉面積21%～50%；9級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉面積50%以上。

2 結(jié)果與分析

2.1 B-09菌株平板內(nèi)抑菌效果

從圖1可見，生防菌與灰霉病病原菌對(duì)峙培養(yǎng)6 d后，在生防菌周圍形成直徑為32 mm的透明抑菌圈，且直徑大小不隨時(shí)間的推移而改變。顯微鏡下觀察可見，抑菌圈周圍的病原菌菌絲生長(zhǎng)緩慢，部分菌絲頂端膨大，并且細(xì)胞壁被破壞，原生質(zhì)體外泄，表現(xiàn)出溶菌現(xiàn)象（圖2）。

2.2 B-09菌株無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

從表1可見，B-09無(wú)菌發(fā)酵液在5.0%的濃度下對(duì)菌絲生長(zhǎng)有抑制作用，但效果不明顯；在14%、20%濃度下的抑菌效果較好，且二者沒有顯著差異。表明分無(wú)菌發(fā)酵液在14%的濃度下已能有效抑制病原菌菌絲的生長(zhǎng)。

3 討論與結(jié)論

近年來(lái)，某些國(guó)家正在逐漸淘汰化學(xué)農(nóng)藥，越來(lái)越多采用生物農(nóng)藥和生物肥料等生物防治措施控制和消滅植物病蟲害，并取得了顯著進(jìn)展[8-9]。生物農(nóng)藥包括細(xì)菌農(nóng)藥、真菌農(nóng)藥、病毒農(nóng)藥和抗生素農(nóng)藥四大類。由于生物農(nóng)藥具有選擇性強(qiáng)、效率高、成本低、不污染環(huán)境、對(duì)人畜無(wú)害等特點(diǎn)，某些國(guó)家正越來(lái)越多地將其應(yīng)用于農(nóng)作物防病、治蟲、防草等方面，推廣應(yīng)用前景廣泛。

生防菌B-09是從200余個(gè)人參土壤根際菌中經(jīng)過(guò)反復(fù)篩選后獲得的抗菌活性很強(qiáng)的菌株。試驗(yàn)結(jié)果表明，供試菌株的活菌體能夠良好地抑制人參灰霉病病原菌菌絲的生長(zhǎng)能力；菌株的無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)人參灰霉病病原菌菌絲生長(zhǎng)與孢子萌發(fā)均表現(xiàn)出顯著的抑制作用。在溫室盆栽試驗(yàn)中，B-09無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)人參灰霉病的防治效果達(dá)到78.6%，與常用化學(xué)農(nóng)藥效果相當(dāng)，但溫室是一個(gè)相對(duì)可控的系統(tǒng)，影響因素相對(duì)于田間要少，菌株B-09雖然具有一定開發(fā)為生物農(nóng)藥的潛力，但防控效果還需要進(jìn)一步進(jìn)行田間試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)：

[1]楊春澍.藥用植物學(xué)[M]. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1998：251-252.

[2]徐懷友，馬友德，張 輝，等. 人參灰霉病安全高效防治藥劑組合篩選研究[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，30（專輯）：44-47.

3]李小俊，成麗霞，吳彥彬，等. 拮抗菌抗菌譜及發(fā)酵液拮抗能力測(cè)定的新方法[J]. 生物技術(shù)，2007，17（1）：55-58.

[4]方中達(dá). 植病研究方法[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1998：152.

[5]Brunner K，Zeilinger S，Ciliento R，et al. Improvement of the Fungal Biocontrol Agent Trichoderma atroviride to Enhance both Antagonism and Induction of Plant Systemic Disease Resistance[J]. Applied and Environmental Microbiology，2005，71（7）：3959-3962.

[6]農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所. 農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則（一）[M]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社. 1998：45-51.

[7]王存興，李光武. 植物病理學(xué)[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社. 2012：92-94.

[8]陳志誼，張榮勝. 植物病害生防芽孢桿菌研究進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，28（5）：999-1006.

[9]楊敬輝，吉沐祥，文平蘭，等. 黃麻鏈霉菌NF0919菌株對(duì)水稻紋枯病的生防活性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，28（6）：1288-1293.

摘要：菌株B-09是1株從人參根際土壤中篩選出的生防菌。為明確B-09菌株在人參灰霉病生防應(yīng)用中的潛力，進(jìn)行了B-09室內(nèi)抑菌效果和溫室防治效果試驗(yàn)。結(jié)果表明，室內(nèi)抑菌試驗(yàn)B-09活體菌株對(duì)人參灰霉病病原菌的抑菌圈直徑達(dá)32 mm；B-09無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)人參灰霉病病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率達(dá)90%以上，對(duì)人參灰霉病病原菌孢子萌發(fā)的抑制率達(dá)87%以上。在溫室控病試驗(yàn)中，B-09無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)人參灰霉病的防治效果達(dá)78.6%左右，與化學(xué)藥劑處理組效果相當(dāng)，表明供試生防菌可開發(fā)為生物農(nóng)藥的潛力。

關(guān)鍵詞：生防菌；人參灰霉?。灰志饔?；生物防治

中圖分類號(hào)： S435.675 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）03-0074-02

人參為五加科多年生草本植物，以根莖、葉、花、果實(shí)入藥，具有大補(bǔ)元?dú)?、?fù)脈固脫、補(bǔ)氣益血、生津、安神等功效[1]。人參灰霉病是20世紀(jì)80年代國(guó)內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的病害，該病以危害人參的葉片、葉柄、花、果實(shí)為主，嚴(yán)重時(shí)危害根部，1981—1988年吉林省栽培人參該病的發(fā)病率達(dá)20%～30%。自2002年以來(lái)，吉林省人參灰霉病發(fā)生頻繁，已成為影響人參產(chǎn)量的主要病害之一[2]。目前，該病的防治主要以化學(xué)防治為主，由于長(zhǎng)期大量使用化學(xué)農(nóng)藥，給生態(tài)環(huán)境、藥材品質(zhì)帶來(lái)了不可忽視的危害；另外因植物病原菌對(duì)常用化學(xué)藥劑抗藥性的逐漸增強(qiáng)，使其防效不斷下降。因此，有針對(duì)性地使用生物農(nóng)藥，開發(fā)微生物殺菌劑是植物病害防治的必然趨勢(shì)。試驗(yàn)以抗菌譜較廣的生防菌B-09為材料，對(duì)菌株的抑菌活性和控病作用開展了研究，明確了生防菌B-09對(duì)人參灰霉病的抑制效果，為進(jìn)一步開發(fā)生物農(nóng)藥奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試生防菌枯草芽孢桿菌B-09，分離自吉林省撫松縣人參根際土壤。供試病原菌人參灰霉病病原菌，分離自吉林省吉安市人參種植基地人參灰霉病病株?；瘜W(xué)藥劑。80%多菌靈可濕性粉劑，北京綠怡園科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)。培養(yǎng)基。PDA培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生防菌B-09無(wú)菌發(fā)酵液的制備 將菌株B-09接種于NA培養(yǎng)基活化24 h后，取直徑3mm的菌餅轉(zhuǎn)接于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，離心后取上清液，再用0.22 μm微孔濾膜濾去上清液中殘留菌體，制得B-09無(wú)菌發(fā)酵液。

1.2.2 B-09菌株平板內(nèi)拮抗作用 利用平板對(duì)峙法[3]，在PDA平板中央接種直徑為6 mm的病原菌菌餅，距菌餅 25 mm 處用接種針點(diǎn)接生防菌，以不接生防菌的PDA平板作為空白對(duì)照，于25 ℃溫箱培養(yǎng)，6 d后檢測(cè)生防菌株對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用，并測(cè)定抑菌圈直徑大小。每處理3次重復(fù)（下同）。

1.2.3 B-09無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用 將B-09無(wú)菌發(fā)酵液與冷卻至50 ℃左右的PDA培養(yǎng)基分別以1 ∶ 4、1 ∶ 6、1 ∶ 10、1 ∶ 18的體積比混勻（發(fā)酵液終濃度為20%、14%、9%、5%）倒平板，冷卻后于平板中央接種直徑 6 mm 病原菌菌餅，以裝有營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基與PDA培養(yǎng)基混合物的平板為對(duì)照，比例同上，于“1.2.2”節(jié)的條件下培養(yǎng) 6 d 后測(cè)量各處理病原菌菌絲直徑，并計(jì)算抑制率。

1.2.4 B-09無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)病原菌孢子萌發(fā)的抑制作用 用無(wú)菌水配制灰霉病病原菌孢子懸浮液，濃度為1×106 CFU/mL。將B-09無(wú)菌發(fā)酵液100%、50%、25%的稀釋液與等體積的灰霉病病原菌孢子懸浮液混合（發(fā)酵液終濃度為50%、25%、125%），用載玻片懸滴法[4]于25 ℃培養(yǎng)，以加入營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的孢子懸浮液為對(duì)照，24 h后鏡檢孢子萌發(fā)情況。

1.2.5 B-09無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)人參灰霉病防治試驗(yàn) 取3年生人參盆栽苗，每株人參苗針刺8個(gè)傷口，用人參灰霉病病原菌孢子懸浮液（濃度約為2×105 CFU/mL）噴灑接種，接種后保濕，36 h 后噴灑B-09無(wú)菌發(fā)酵液，6株為1處理，每處理設(shè)3次重復(fù)。10 d后觀察發(fā)病情況，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和病情指數(shù)，并計(jì)算防治效果[5-6]。對(duì)照組和化學(xué)藥劑組分別噴灑無(wú)菌水與多菌靈1 000倍液。病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下[7]：0級(jí)，無(wú)病斑；1級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉面積5%以下；3級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉面積6%～10%；5級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉面積11%～20%；7級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉面積21%～50%；9級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉面積50%以上。

2 結(jié)果與分析

2.1 B-09菌株平板內(nèi)抑菌效果

從圖1可見，生防菌與灰霉病病原菌對(duì)峙培養(yǎng)6 d后，在生防菌周圍形成直徑為32 mm的透明抑菌圈，且直徑大小不隨時(shí)間的推移而改變。顯微鏡下觀察可見，抑菌圈周圍的病原菌菌絲生長(zhǎng)緩慢，部分菌絲頂端膨大，并且細(xì)胞壁被破壞，原生質(zhì)體外泄，表現(xiàn)出溶菌現(xiàn)象（圖2）。

2.2 B-09菌株無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

從表1可見，B-09無(wú)菌發(fā)酵液在5.0%的濃度下對(duì)菌絲生長(zhǎng)有抑制作用，但效果不明顯；在14%、20%濃度下的抑菌效果較好，且二者沒有顯著差異。表明分無(wú)菌發(fā)酵液在14%的濃度下已能有效抑制病原菌菌絲的生長(zhǎng)。

3 討論與結(jié)論

近年來(lái)，某些國(guó)家正在逐漸淘汰化學(xué)農(nóng)藥，越來(lái)越多采用生物農(nóng)藥和生物肥料等生物防治措施控制和消滅植物病蟲害，并取得了顯著進(jìn)展[8-9]。生物農(nóng)藥包括細(xì)菌農(nóng)藥、真菌農(nóng)藥、病毒農(nóng)藥和抗生素農(nóng)藥四大類。由于生物農(nóng)藥具有選擇性強(qiáng)、效率高、成本低、不污染環(huán)境、對(duì)人畜無(wú)害等特點(diǎn)，某些國(guó)家正越來(lái)越多地將其應(yīng)用于農(nóng)作物防病、治蟲、防草等方面，推廣應(yīng)用前景廣泛。

生防菌B-09是從200余個(gè)人參土壤根際菌中經(jīng)過(guò)反復(fù)篩選后獲得的抗菌活性很強(qiáng)的菌株。試驗(yàn)結(jié)果表明，供試菌株的活菌體能夠良好地抑制人參灰霉病病原菌菌絲的生長(zhǎng)能力；菌株的無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)人參灰霉病病原菌菌絲生長(zhǎng)與孢子萌發(fā)均表現(xiàn)出顯著的抑制作用。在溫室盆栽試驗(yàn)中，B-09無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)人參灰霉病的防治效果達(dá)到78.6%，與常用化學(xué)農(nóng)藥效果相當(dāng)，但溫室是一個(gè)相對(duì)可控的系統(tǒng)，影響因素相對(duì)于田間要少，菌株B-09雖然具有一定開發(fā)為生物農(nóng)藥的潛力，但防控效果還需要進(jìn)一步進(jìn)行田間試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。

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