β-連環(huán)素對卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥性的影響

廖丹，劉睿，曾瀚慶

β-連環(huán)素對卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥性的影響

廖丹，劉睿，曾瀚慶

目的：探討信號分子β連環(huán)素（β-catenin）在多個(gè)卵巢癌耐藥細(xì)胞系中的表達(dá)及其對順鉑耐藥性的影響。方法：首先在2個(gè)卵巢癌耐藥細(xì)胞系（C13K，SKOV-3），2個(gè)卵巢癌敏感細(xì)胞系（OV2008，A2780），A2780順鉑敏感株、A2780-cis順鉑耐藥株，COC10順鉑敏感株、COC1-cis順鉑耐藥株中檢測β-catenin蛋白的水平。通過小干擾RNA （siRNA）介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)靶向沉默細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time PCR）和蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）驗(yàn)證β-catenin基因沉默效果。臺盼藍(lán)染色方法分析β-catenin基因沉默對細(xì)胞化療藥物順鉑敏感性的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測順鉑處理后β-catenin基因沉默細(xì)胞的凋亡率。Western blotting篩選多個(gè)凋亡相關(guān)信號分子的改變。結(jié)果：β-catenin在2個(gè)卵巢癌耐藥細(xì)胞系C13K，SKOV-3中蛋白水平較敏感細(xì)胞系明顯上調(diào)。與親本A2780和COC10細(xì)胞相比，在耐藥株A2780-cis和COC1-cis中表達(dá)水平也明顯增高。β-catenin siRNA能顯著抑制細(xì)胞中β-catenin蛋白的水平。β-catenin基因沉默后，卵巢癌耐藥細(xì)胞C13K，SKOV-3對順鉑敏感性顯著增高；流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)β-catenin基因沉默可以促進(jìn)順鉑介導(dǎo)的卵巢癌耐藥細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。Western blotting發(fā)現(xiàn)βcatenin基因沉默后，順鉑處理可以顯著上調(diào)促凋亡分子p53和caspase-3蛋白水平。結(jié)論：β-catenin在卵巢癌耐藥細(xì)胞系表達(dá)明顯增高，β-catenin沉默可以促進(jìn)卵巢癌耐藥細(xì)胞對順鉑的敏感性，并同時(shí)促進(jìn)了順鉑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

卵巢腫瘤；腫瘤細(xì)胞系；β連環(huán)素；順鉑；抗藥性，腫瘤

【Abstract】Objective:To investigate the expression of β-catenin in several human ovarian cancer cell lines and its effect on cisplatin resistance.Methods：The protein level of β-catenin in two cisplatin-resistant cell lines（C13K，SKOV-3），two cisplatin-sensitive cell lines（OV2008，A2780），A2780，A2780-cis，COC10 and COC1-cis was examined by real-time PCR and western blotting analysis.Expression of β-catenin in ovarian cancer cells was knockdown by siRNA transfection.The effect of β-catenin silencing on cisplatin resistance was examined by trypan blue staining and flowcytometry.The change of apoptosisrelated proteins were examined by western blotting analysis.Results：The expression of β-catenin was upregulated in cisplatinresistant cell lines（C13K，SKOV-3）compared with cisplatin-sensitive cell lines.The expression of β-catenin in cisplatinresistant A2780 and COC1 was also higher than that in paretnal A2780 and COC1 cells.siRNA targeting β-catenin effectively knockdown expression of β-catenin in ovarian cancer cells.Silencing of β-catenin enhanced the sensitivity of cisplatin-resistant cells（C13K，SKOV-3）to cisplatin.β-catenin siRNA also resulted in more apoptosis compared with control siRNA.Cisplatin treatment in β-catenin silencing cells induced the expression of apoptosis-related protein p53 and caspase-3.Conclusions：These finding suggested that β-catenin was upregulated in cisplatin-resistant cells.Gene silencing of β-catenin enhanced sensitivity to cisplatin in cisplatin-resistant cells by inducing more cisplatin-mediated apoptosis.

【Keywords】Ovarian neoplasms；Cell line，tumor；Beta catenin；Cisplatin；Drug resistance，neoplasm

（J Int Obstet Gynecol，2015，42：108-111）

卵巢癌的發(fā)病率在女性生殖器惡性腫瘤中居第3位，但病死率卻高居第1位。盡管近10年來開展了在腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)基礎(chǔ)上聯(lián)合順鉑為主的治療方案，但卵巢癌患者的5年生存率一直在20％～30％左右，其主要原因是卵巢癌對化療藥物產(chǎn)生了耐藥性。耐藥性的產(chǎn)生直接影響了化療效果和患者生存率，因此研究卵巢癌細(xì)胞耐藥發(fā)生的機(jī)制對于防止或逆轉(zhuǎn)耐藥產(chǎn)生、改善化療效果、提高患者生存率有著很重要的意義。

卵巢癌耐藥的產(chǎn)生是多因素、多層次、多途徑共同作用的結(jié)果。目前研究發(fā)現(xiàn)多個(gè)信號分子或信號通路參與了卵巢癌耐藥發(fā)生的機(jī)制，例如白細(xì)胞介素6（IL-6）［1］、酪氨酸蛋白激酶（Src）家族［2］、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號通路［3］等。β連環(huán)素（β-catenin）是Wnt信號通路中的關(guān)鍵分子，作為信號分子主要參與細(xì)胞分化［4］、細(xì)胞凋亡［5］、細(xì)胞增殖［6］及多種腫瘤的遷移侵襲過程［7］等。已有研究發(fā)現(xiàn)，β-catenin參與了多種腫瘤細(xì)胞的耐藥過程，如肝癌［8］、肺癌［9］和神經(jīng)母細(xì)胞瘤［10］等。本研究主要探討β-catenin與卵巢癌順鉑耐藥的關(guān)系，通過RNA干擾技術(shù)沉默β-catenin基因后，觀察其對耐藥卵巢癌細(xì)胞藥物敏感性的影響，為卵巢癌細(xì)胞耐藥發(fā)生的機(jī)制提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料β-catenin抗體（Abcam，英國），p53抗體和caspase-3（cell signaling technology，美國），β-actin抗體（Sigma-Aldrich，美國），辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的驢抗兔IgG抗體（GE healthcare公司，美國），臺盼藍(lán)染色細(xì)胞存活率檢測試劑盒（碧云天），凋亡檢測試劑盒（Annexin V-PE Apoptosis Detection Kit，Abcam公司），小干擾RNA（siRNA）購自Invitrogen公司，轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 2000（Invitrogen公司，美國）。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞系 C13K，A2780，OV2008，SKOV-3均培養(yǎng)于含有10％胎牛血清、1％青/鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在含5％CO2、37℃孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.3蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）分析使用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，離心去除細(xì)胞碎片，提取各細(xì)胞總蛋白后二喹啉甲酸（BCA）法測蛋白濃度。取其等量（30 μg）細(xì)胞蛋白樣品變性后上樣經(jīng)8％聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳后，以90 V電轉(zhuǎn)膜4 h將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素（NC）膜。轉(zhuǎn)移好的NC膜5％脫脂奶粉封閉1 h，一抗4℃孵育搖床過夜（βcatenin抗體1∶3 000稀釋），Tris-Hcl緩沖液溶液（TBST）洗膜3次，每次5 min，二抗室溫孵育2 h（二抗為HRP標(biāo)記的驢抗兔免疫球蛋白G（IgG）1∶3 000稀釋），用TBST洗膜后，加入化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）后顯影。以β-actin為內(nèi)參。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）分析提取細(xì)胞的總RNA，20 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為：RNA 1 μg、Master mix 4 μL、酶1 μL、去RNA酶（Rnase）水。混勻，按下列條件進(jìn)行反應(yīng)：25℃5 min，42℃30 min，85℃5 min，4℃5 min。取1 μL互補(bǔ)DNA（cDNA），SYB Green 5 μL，引物（primer，10 μmol/ L）各0.2 μL，去Rnase水3.6 μL，混勻，按下列條件進(jìn)行反應(yīng)：94℃20 s，60℃20 s，72℃15 s，共35個(gè)循環(huán)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本均采用3管重復(fù)，重復(fù)3次，取其平均值。

1.5臺盼藍(lán)染色方法將對照siRNA和β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后，加入適量胰酶消化細(xì)胞，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。同時(shí)以未轉(zhuǎn)染組為對照細(xì)胞。以每孔4×104細(xì)胞接種6孔板，24 h孵育后加入順鉑（60 μmol/L）處理48 h后在不同的時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞。吸取100 μL重懸的細(xì)胞到塑料離心管內(nèi)，加入100 μL臺盼藍(lán)染色液，輕輕混勻，染色3 min；吸取少量經(jīng)過染色的細(xì)胞，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。具體檢測方法參照試劑盒說明書。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡將對照siRNA和β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞3 d后，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌貼壁細(xì)胞1次，加入適量胰酶消化細(xì)胞，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，1 000×g離心5 min，棄上清。使用PBS洗滌細(xì)胞，棄上清，并加入500 μL Annexin V-PE結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-PE，輕輕混勻，室溫（20～25℃）避光孵育5 min，隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.7siRNA轉(zhuǎn)染β-catenin siRNA和control siRNA通過轉(zhuǎn)染試劑（lipofectamine 2000）分別轉(zhuǎn)染卵巢癌耐藥細(xì)胞系C13K和SKOV-3，具體操作見轉(zhuǎn)染試劑說明書。轉(zhuǎn)染72 h后Western blotting檢測細(xì)胞β-catenin的表達(dá)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩樣本均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1β-catenin在人卵巢癌耐藥細(xì)胞系和卵巢癌敏感細(xì)胞系中的表達(dá)水平Western blotting結(jié)果顯示，β-catenin在卵巢癌耐藥細(xì)胞系C13K、SKOV-3的表達(dá)水平顯著高于敏感細(xì)胞系OV2008、A2780，見圖1。Western blotting結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)在耐藥的細(xì)胞中β-catenin的蛋白水平顯著高于其親本非耐藥的細(xì)胞，見圖2。

圖1　Western blotting檢測4個(gè)卵巢癌細(xì)胞系中β-catenin的表達(dá)

圖2　Western blotting檢測順鉑耐藥株和親本敏感株中β-catenin蛋白水平

2.2靶向β-catenin的siRNA的干擾效率檢測RT-PCR結(jié)果顯示，同對照siRNA相比β-cateninsiRNA抑制了β-catenin的mRNA水平，抑制率達(dá)90％，見圖3。Western blotting結(jié)果證實(shí)同對照siRNA相比，β-catenin siRNA成功地沉默了2個(gè)卵巢癌細(xì)胞系中β-catenin的表達(dá)（＞80％），見圖4。

圖3　RT-PCR驗(yàn)證靶向β-catenin的siRNA的基因沉默效率

圖4　Westernblotting驗(yàn)證靶向β-catenin的siRNA的基因沉默效率

2.3β-catenin在卵巢癌耐藥細(xì)胞對化療藥物順鉑的抵抗性臺盼藍(lán)染色方法結(jié)果顯示，在C13K和SKOV-3細(xì)胞中，經(jīng)順鉑處理3 d后，β-catenin基因沉默已經(jīng)對細(xì)胞增殖活力產(chǎn)生影響，同時(shí)轉(zhuǎn)染對照siRNA的細(xì)胞和未處理組細(xì)胞增殖能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；經(jīng)順鉑處理后，β-catenin基因沉默的細(xì)胞增殖活力在不同的時(shí)間點(diǎn)（即3，4，5 d）均顯著低于對照細(xì)胞和未處理組細(xì)胞（P＜0.01），見圖5。

2.4β-catenin對順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，在β-catenin基因沉默的細(xì)胞中，順鉑處理誘導(dǎo)更多細(xì)胞處于凋亡狀態(tài)。在C13K細(xì)胞中，對照組細(xì)胞凋亡率為（19.4±0.9）％，β-catenin基因沉默的細(xì)胞凋亡率為（34.2±2.1）％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.59，P＜0.05）；在SKOV-3細(xì)胞中，對照組細(xì)胞凋亡率為（9.6±1.1）％，β-catenin基因沉默細(xì)胞的凋亡率為（19.8±1.8）％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 15.38，P＜0.05），見圖6（見后插一）。

2.5β-catenin對順鉑誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)信號分子表達(dá)的影響為了進(jìn)一步分析順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，本研究篩選了一系列與凋亡相關(guān)的信號分子，包括p53，p73，caspase-3，caspase-7，B淋巴細(xì)胞瘤2（Bcl-2），Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）等。本研究發(fā)現(xiàn)，在β-catenin表達(dá)沉默的細(xì)胞中，順鉑顯著增加了p53和caspase-3蛋白的表達(dá)，見圖7。

圖5　不同時(shí)間點(diǎn)順鉑處理后卵巢癌細(xì)胞活性

圖7　Western blotting檢測順鉑誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

3　討論

卵巢癌早期診斷困難，70％患者初診時(shí)已處于晚期，在腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)的基礎(chǔ)上開展順鉑為主的聯(lián)合方案目前已成為卵巢癌的常規(guī)治療方案，然而卵巢癌細(xì)胞對順鉑存在耐藥導(dǎo)致患者5年生存率仍偏低。目前導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞對順鉑產(chǎn)生耐藥的具體分子機(jī)制并不十分清楚，近年廣泛關(guān)注細(xì)胞信號通路和轉(zhuǎn)錄因子的功能。有研究發(fā)現(xiàn)抗凋亡蛋白Bcl-2 和Bcl-XL在卵巢癌耐藥細(xì)胞中表達(dá)水平較敏感細(xì)胞明顯上調(diào)，并通過下調(diào)細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶caspase-3的表達(dá)而參與卵巢癌細(xì)胞的順鉑耐藥過程［11］。George等［2］報(bào)道Src激酶活性的抑制可以增加細(xì)胞對化療藥物順鉑或紫杉醇的敏感性，并可扭轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞對紫杉醇的抗藥性。Lee等［3］也證實(shí)PI3K/AKT信號通路參與卵巢癌細(xì)胞的耐藥過程。在卵巢癌耐順鉑細(xì)胞株OVCAR-3/CDDP的AKT磷酸化水平明顯高于其親代細(xì)胞株OVCAR-3，同時(shí)順鉑處理可抑制親代細(xì)胞株中AKT磷酸化水平，而在耐藥的卵巢癌細(xì)胞中卻無此作用。另外，PI3K活性抑制劑可以明顯提高順鉑對耐藥細(xì)胞株誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

人類β-catenin基因又名β-catenin1，定位于染色體3q21。一方面β-catenin與鈣依賴性跨膜糖蛋白E鈣黏蛋白（E-cadherin）的胞內(nèi)段結(jié)合介導(dǎo)細(xì)胞間黏附、遷移等功能，對上皮極性和完整性的維持起重要作用；另一方面β-catenin參與Wnt通路的信號傳導(dǎo)，在調(diào)控細(xì)胞生長和腫瘤發(fā)生中發(fā)揮著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)β-catenin卵巢癌耐藥細(xì)胞系中蛋白水平較敏感細(xì)胞系明顯上調(diào)。β-catenin基因沉默后，卵巢癌耐藥細(xì)胞C13K、SKOV-3對順鉑敏感性顯著增高，并同時(shí)伴隨著凋亡細(xì)胞數(shù)的增加。以上結(jié)果提示抑制β-catenin的表達(dá)可能通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)，從而增加了耐藥卵巢癌細(xì)胞對順鉑的敏感性。

p53是重要的腫瘤抑制基因，該基因的突變或缺失是導(dǎo)致許多腫瘤發(fā)生的原因，同時(shí)p53可參與細(xì)胞凋亡過程而介導(dǎo)耐藥，而順鉑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是發(fā)揮其抗腫瘤作用的重要機(jī)制。目前已有研究發(fā)現(xiàn)順鉑可以通過誘導(dǎo)p53/Bax途徑，啟動(dòng)線粒體凋亡途徑而殺傷卵巢癌細(xì)胞［12］。筆者前期的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，在β-catenin表達(dá)沉默的細(xì)胞中，順鉑處理可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡的相關(guān)分子p53和caspase-3的表達(dá)的增高，提示p53/caspase-3信號通路可能參與了卵巢癌細(xì)胞的耐藥機(jī)制。

［1］Guo Y，Xu F，Lu T，et al.Interleukin-6 signaling pathway in targeted therapy for cancer［J］.Cancer Treat Rev，2012，38（7）：904-910.

［2］George JA，Chen T，Taylor CC.SRC tyrosine kinase and multidrug resistance protein-1 inhibitions act independently but cooperatively to restore paclitaxel sensitivity to paclitaxel-resistant ovarian cancer cells［J］.Cancer Res，2005，65（22）：10381-10388.

［3］Lee S，Choi EJ，Jin C，et al.Activation of PI3K/Akt pathway by PTEN reduction and PIK3CA mRNA amplification contributes to cisplatin resistance in an ovarian cancer cell line［J］.Gynecol Oncol，2005，97 （1）：26-34.

［4］Kielman MF，Rindap?? M，Gaspar C，et al.Apc modulates embryonic stem-cell differentiation by controlling the dosage of β-catenin signaling［J］.Nat Genet，2002，32（4）：594-605.

［5］Xu MX，Zhao L，Deng C，et al.Curcumin suppresses proliferation and induces apoptosis of human hepatocellular carcinoma cells via the wnt signaling pathway［J］.Int J Oncol，2013，43（6）：1951-1959.

［6］Bilir B，Kucuk O，Moreno CS.Wnt signaling blockage inhibits cell proliferation and migration，and induces apoptosis in triple-negative breast cancer cells［J］.J Transl Med，2013，11：280-292.

［7］Zhao L，Li W，Zang W，et al.JMJD2B promotes epithelialmesenchymal transition by cooperating with β-catenin and enhances gastric cancer metastasis［J］.Clin Cancer Res，2013，19（23）：6419-6429.

［8］Xu N，Shen C，Luo Y，et al.Upregulated miR-130a increases drug resistance by regulating RUNX3 and Wnt signaling in cisplatintreated HCC cell［J］.Biochem Biophys Res Commun，2012，425（2）：468-472.

［9］Teng Y，Wang X，Wang Y，et al.Wnt/beta-catenin signaling regulates cancer stem cells in lung cancer A549 cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2010，392（3）：373-379.

［10］Flahaut M，Meier R，Coulon A，et al.The Wnt receptor FZD1 mediates chemoresistance in neuroblastoma through activation of the Wnt/beta-catenin pathway［J］.Oncogene，2009，28（23）：2245-2256.

［11］Yang X，Zheng F，Xing H，et al.Resistance to chemotherapy-induced apoptosis via decreased caspase-3 activity and overexpression of antiapoptotic proteins in ovarian cancer［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2004，130（7）：423-428.

［12］Cheng JQ，Jiang X，F(xiàn)raser M，et al.Role of X-linked inhibitor of apoptosis protein in chemoresistance in ovarian cancer：possible involvement of the phosphoinositide-3 kinase/Akt pathway［J］.Drug Resist Updat，2002，5（3/4）：131-146.

The Effect of β-catenin on Cisplatin Resistance in Human Ovarian Cancer Cells

LIAO Dan，LIU Rui，ZENG Han-qing.
Department of Obstetrics and Gynecology（LIAO Dan），Department of General Surgery（LIU Rui），Nada Hospital of Hainan State Farms，Danzhou 571700，Hainan Province，China；Department of Hematology，The Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing400016，China（ZENGHan-qing）

LIAO Dan，E-mail：liaodancq1981@163.com

2014-02-24）

［本文編輯秦娟］

571700海南省儋州市農(nóng)墾那大醫(yī)院婦產(chǎn)科（廖丹），普外科（劉睿）；重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院血液內(nèi)科（曾瀚慶）

廖丹，E-mail：liaodancq1981@163.com