下調(diào)miR-21通過PDCD4抑制人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖并抑制PI3K/Akt信號(hào)通路

慕生枝，孫要文，王國(guó)棟

（陜西省人民醫(yī)院燒傷整形醫(yī)學(xué)美容外科　陜西　西安　710068）

下調(diào)miR-21通過PDCD4抑制人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖并抑制PI3K/Akt信號(hào)通路

慕生枝，孫要文，王國(guó)棟

（陜西省人民醫(yī)院燒傷整形醫(yī)學(xué)美容外科陜西西安710068）

目的：探討microRNA-21（miR-21）對(duì)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中程序性細(xì)胞死亡因子（PDCD4）表達(dá)和細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制。方法：利用熒光定量PCR檢測(cè)正常皮膚成纖維細(xì)胞GM0639和人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞（HSF）中miR-21的表達(dá)。構(gòu)建含有PDCD4-pGC-Fu-GFP慢病毒和空載體對(duì)照慢病毒pGC-Fu-GFP感染HSF細(xì)胞。將HSF細(xì)胞按照不同處理方法分為：空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染非特異miRNA的陰性對(duì)照組、轉(zhuǎn)染miRNA-21抑制物的mir21 Inhibitor組、轉(zhuǎn)染miR-21質(zhì)粒的miR-21 mimic組、PDCD4-pGC-Fu-GFP組、pGC-Fu-GFP組和Ly294002組。轉(zhuǎn)染后48h收集細(xì)胞，MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。采用免疫熒光技術(shù)、熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-21 mimic組和miR-21 Inhibitor組細(xì)胞中PDCD4的表達(dá)以及基因和蛋白水平。采用熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)PDCD4-pGC-Fu-GFP組、pGC-Fu-GFP組和Ly294002組細(xì)胞周期相關(guān)蛋白C-MYC，CCND1以及通路相關(guān)蛋白p-Akt、JNK1的蛋白表達(dá)。結(jié)果：HSF細(xì)胞中miR-21呈現(xiàn)高表達(dá)。與空白對(duì)照組相比，抑制miR-21表達(dá)可以抑制HSF細(xì)胞增殖，上調(diào)PDCD4表達(dá)。過表達(dá)PDCD4可以抑制細(xì)胞增殖，下調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白C-MYC，CCND1的表達(dá)，同時(shí)抑制通路蛋白p-Akt和JNK1的表達(dá)。結(jié)論：下調(diào)miR-21的表達(dá)能夠促進(jìn)PDCD4表達(dá)，抑制HSF細(xì)胞增殖以及PI3K/AKt信號(hào)通路。

microRNA-21；PDCD4；人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞；細(xì)胞增殖；抑制；PI3K/Akt

增生性瘢痕（hypertrophic scar，HS）常發(fā)生于創(chuàng)傷尤其是燒傷后，是一種病理性愈合現(xiàn)象，不僅影響美觀而且可能導(dǎo)致機(jī)體功能障礙[1]。在組織學(xué)上增生性瘢痕的形成是由傷區(qū)成纖維細(xì)胞過度增殖、膠原分泌活性增強(qiáng)導(dǎo)致。瘢痕形成過程中，成纖維細(xì)胞合成并分泌大量的膠原蛋白，使細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）成分大量沉積在組織中[2]。目前對(duì)增生性瘢痕的預(yù)防和治療仍面臨著很多困難。雖然有許多治療方法，但眾多學(xué)者還在不斷地探索更理想的防治方案[3]，但是還沒有對(duì)瘢痕形成的治療模式達(dá)成共識(shí)[4]。研究發(fā)現(xiàn)，一些miRNAs參與了纖維化過程中ECM的代謝調(diào)控，在心衰、間質(zhì)纖維化和心肌肥厚等疾病中，成纖維細(xì)胞中miR-21的表達(dá)增加。同時(shí)miR-21的表達(dá)失調(diào)也與肺纖維化病變中的多個(gè)關(guān)鍵信號(hào)通路有關(guān)[5-6]。另外，有研究表明抑制 miR-21的表達(dá)能夠降低博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺部間質(zhì)纖維化的病變程度[7]。然而，miR-21是否參與了增生性瘢痕組織形成的調(diào)控目前還不清楚，本研究將從miR-21對(duì)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖影響及調(diào)控機(jī)制展開研究和討論，從而為增生性瘢痕的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料和方法

1.1材料

正常人皮膚成纖維細(xì)胞GM0639和人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞（hypertrophic scar fibroblasts，HSF），SYBR Premix Ex TaqTM熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自上海生工生物試劑公司，新生牛、胎牛血清為PAA產(chǎn)品，Opti-MEM、RPMI1640培養(yǎng)基為Hyclone產(chǎn)品，LipofectamineTM2000脂質(zhì)體購(gòu)自Invitrogen公司。PDCD4多克隆抗體為Cell Signal公司產(chǎn)品，βactin（鼠抗）、HRP標(biāo)記的抗鼠、抗兔二抗為中杉金橋公司產(chǎn)品，C-MYC、CCND1、p-Akt抗體均購(gòu)自Cell Signaling Technology公司，JNK1購(gòu)自epitomics公司。10%正常羊封閉血清購(gòu)自福州碩博生物技術(shù)有限公司，免疫熒光染色二抗稀釋液購(gòu)自碧云天生物。Ly294002為Cayman Chemical公司產(chǎn)品。

1.2構(gòu)建PDCD4-pGC-Fu-GFP病毒表達(dá)載體

從上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司購(gòu)買PDCD4全長(zhǎng)克隆，應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增PDCD4編碼框序列，產(chǎn)物經(jīng)過純化、AgeⅠ酶切、酶切片段凝膠回收、連接，將其克隆到慢病毒表達(dá)載體pGC-Fu-GFP中。并且將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，挑取克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證。鑒定陽(yáng)性者送公司測(cè)序。比對(duì)分析后，提取測(cè)序成功的克隆的質(zhì)粒。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)及分組

人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞（HSF）常規(guī)培養(yǎng)于含10%FBS胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液中，放置37℃含5%CO2培養(yǎng)箱。轉(zhuǎn)染前1天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代，使其融合度為40%的時(shí)候進(jìn)行轉(zhuǎn)染。根據(jù)處理方法的不同將HSF細(xì)胞分為以下幾組：①空白對(duì)照組：不轉(zhuǎn)染，細(xì)胞正常生長(zhǎng)；②陰性對(duì)照組：轉(zhuǎn)染非特異性siRNA作為陰性對(duì)照；③miR-21 mimic組：轉(zhuǎn)染miR-21質(zhì)粒；④miR-21 Inhibitor組：轉(zhuǎn)染miR-21抑制物；⑤PDCD4-pGC-Fu-GFP組：感染含有PDCD4的慢病毒載體PDCD4-pGC-Fu-GFP；⑥pGC-Fu-GFP組：感染pGC-Fu-GFP空載對(duì)照慢病毒；⑦Ly294002組：終濃度為20μmol/L Ly294002處理細(xì)胞阻斷PI3K/Akt通路。

1.4 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況

分別取上述處理后的各組細(xì)胞，按每孔1×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，每孔體積為200μl，每組細(xì)胞設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照，各培養(yǎng)24 h、36h、48h和72h。每孔加入5 mg/ml的MTT 20μl，37℃培養(yǎng)4h后棄去培養(yǎng)基，加入150μl DMSO，室溫避光搖床震蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。以空白孔為對(duì)照，酶標(biāo)儀490nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度值（OD值），OD值的大小表示細(xì)胞增殖能力的大小。各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次取平均值。

1.5免疫熒光染色檢測(cè)PDCD4表達(dá)

細(xì)胞在蓋片上生長(zhǎng)融合到95%～100%時(shí)，用1× PBS洗3次，每次10 min；4%的甲醛室溫固定25 min；0.2%Triton X-100透化2～5min；5%牛血清白蛋白（BSA）室溫封閉30min，加一抗PDCD4（用1%BSA按照1：1 000稀釋）4℃過夜，1×PBS洗滌3次，每次10 min；加二抗IgG（用1%BSA按照1：1 000稀釋）暗室避光30min，95%甘油封片。熒光顯微鏡下觀察結(jié)果并拍攝圖片。陽(yáng)性反應(yīng)為綠色熒光。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)量熒光強(qiáng)度并定位分析。

1.6 qRT-PCR檢測(cè)miR-21、PDCD4、C-MYC和CCND1的mRNA相對(duì)表達(dá)量

各組處理后的細(xì)胞根據(jù)按照GREEN spin組織/細(xì)胞RNA快速提取試劑盒說明書步驟提取細(xì)胞總RNA。按照Takara RNA PCR Kit（AMY）Ver.3.0說明書操作進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。用RT試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA的第1鏈作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析、DNA吸光度掃描檢測(cè)；顯色條帶圖像分析系統(tǒng)（Alpha Imager 2 000）檢測(cè)其積分吸光度值，與內(nèi)參β-actin條帶的比值為mRNA表達(dá)水平參數(shù)。正常人皮膚成纖維細(xì)胞和人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中檢測(cè)miR-21的表達(dá)，miR-21的基因表達(dá)檢測(cè)是以U6小RNA為內(nèi)參。空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-21 mimic組和miR-21 Inhibitor組檢測(cè)PDCD4的mRNA表達(dá)，空白對(duì)照組、PDCD4-pGC-Fu-GFP組和pGC-Fu-GFP組檢測(cè)C-MYC和CCND1的mRNA表達(dá)。所用引物均由上海生工有限公司合成。具體引物序列表1。

1.7 Western blot檢測(cè)各組蛋白表達(dá)

收獲各組細(xì)胞，加入裂解液提取蛋白，BCA法總蛋白定量。調(diào)整上樣量為25μg總蛋白/樣本，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉過夜。封閉完畢后PBST洗膜5次，分別加一抗（所用的一抗稀釋比例分別為抗體PDCD4 1：2000；抗體C-MYC 1：1000；抗體CCND1 1：1000；抗體p-Akt 1：1000；抗體JNK1 1：1000），37℃反應(yīng)1.5 h，PBS洗膜5次，加辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，37℃反應(yīng)1h，PBS洗膜5次。染色，曝光，采用BIORAD GELDOC XR凝膠成像系統(tǒng)依次顯影、定影，Quantity One Basic軟件分析膠片中蛋白條帶。本步實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)（x±s）表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析多樣本比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較釆用LSD法，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1　所有所有檢測(cè)基因具體引物序列

2　結(jié)果

2.1正常成纖維細(xì)胞和HSF中miR-21的表達(dá)檢測(cè)

與人正常皮膚成纖維細(xì)胞相比，HSF細(xì)胞中miR-21的表達(dá)顯著增加（P＜0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1）。

2.2miR-21調(diào)控HSF細(xì)胞增殖

與空白對(duì)照組相比，miR-21 Inhibitor組中HSF細(xì)胞增殖顯著受到抑制（圖2），miR-21 mimic組中HSF細(xì)胞增殖顯著增加，陰性對(duì)照組無明顯差異。2.3 miR-21調(diào)控HSF細(xì)胞中PDCD4的表達(dá)

圖1　GM0639和HSF細(xì)胞中miR-21表達(dá)量檢測(cè)

與空白對(duì)照組相比，miR-21 Inhibitor組中HSF細(xì)胞內(nèi)PDCD4的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），免疫熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。miR-21 mimic組中HSF細(xì)胞內(nèi)PDCD4的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)顯著降低，免疫熒光強(qiáng)度也降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3），陰性對(duì)照組中無明顯差異。

圖2　miR-21對(duì)HSF細(xì)胞增殖的影響

2.4 PDCD4過表達(dá)抑制HSF細(xì)胞增殖

與空白對(duì)照組相比，PDCD4-pGC-Fu-GFP組中細(xì)胞增殖顯著受到抑制（圖4），pGC-Fu-GFP組無明顯差異。

圖3　miR-21對(duì)HSF細(xì)胞中PDCD4表達(dá)的影響

2.5 PDCD4過表達(dá)抑制細(xì)胞周期蛋白C-MYC和CCND1的表達(dá)

圖4　過表達(dá)PDCD4對(duì)HSFb細(xì)胞增殖的影響

與空白對(duì)照組相比，PDCD4-pGC-Fu-GFP組中細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞周期蛋白C-MYC和CCND1的基因表達(dá)（P＜0.05）和蛋白表達(dá)都顯著減少（圖5），pGCFu-GFP組無明顯差異。

2.6 PDCD4過表達(dá)抑制PI3K/Akt通路

與空白對(duì)照組相比，PDCD4-pGC-Fu-GFP組中細(xì)胞PI3K/AKt通路中相關(guān)蛋白pAKt、JNK1的蛋白表達(dá)顯著減弱（圖6），Ly294002組中pAKt、JNK1的蛋白表達(dá)也顯著減弱，pGC-Fu-GFP組無明顯差異。

3　討論

增生性瘢痕是人體對(duì)創(chuàng)傷產(chǎn)生過度愈合反應(yīng)的結(jié)果，是人體創(chuàng)傷、炎癥、燒傷、外傷或自發(fā)的一種過度的皮膚纖維增生性疾病，以成纖維細(xì)胞增殖旺盛、細(xì)胞外基質(zhì)中膠原、蛋白多糖、糖蛋白等過度沉積，膠原纖維排列紊亂為主要病理特征[3，8]。目前臨床上對(duì)于增生性瘢痕還沒有十分滿意的治療方案。由于成纖維細(xì)胞參與了瘢痕形成的整個(gè)過程，抑制成纖維細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)化對(duì)于瘢痕治療有重要意義[9]。

圖5　過表達(dá)PDCD4對(duì)HSF細(xì)胞中C-MYC和CCND1表達(dá)的影響

圖6　過表達(dá)PDCD4對(duì)PI3K/AKt通路中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

miRNA是一種長(zhǎng)約19-22nt的非編碼RNA，在基因表達(dá)調(diào)控方面具有廣泛和普遍的作用，參與調(diào)節(jié)正常生理過程及病理過程，如器官的發(fā)育、創(chuàng)傷的愈合以及腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移等，它幾乎參與了調(diào)控細(xì)胞活動(dòng)的各個(gè)環(huán)節(jié)，例如細(xì)胞增殖、分化以及凋亡[10]。已經(jīng)有研究報(bào)道m(xù)iR-21在心衰、間質(zhì)纖維化和心肌肥厚的成纖維細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)miR-21表達(dá)失調(diào)可能調(diào)控肺纖維化的幾個(gè)關(guān)鍵信號(hào)通路[11-12]。通過上述文獻(xiàn)可以發(fā)現(xiàn)miR-21是對(duì)膠原等ECM合成起促進(jìn)作用的一類miRNA分子，在纖維化疾病中具有重要調(diào)控作用。在我們的研究中也證實(shí)了miR-21在HSF細(xì)胞中的表達(dá)量比正常皮膚成纖維細(xì)胞中顯著增加。PDCD4是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的與細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)的抑癌基因，同時(shí)是miR-21調(diào)控的靶基因[13]。本研究中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-21之后，HSF細(xì)胞中PDCD4表達(dá)顯著下降，同時(shí)促進(jìn)了細(xì)胞增殖。抑制miR-21表達(dá)之后，能夠顯著降低HSF細(xì)胞的增殖以及增加PDCD4的表達(dá)量。這表明miR-21的高表達(dá)能夠促進(jìn)瘢痕的形成，抑制miR-21表達(dá)能夠抑制瘢痕形成，臨床上可以通過基因干擾技術(shù)下調(diào)miR-21的表達(dá)來減少瘢痕的發(fā)生。

PI3K/Akt信號(hào)通路為細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)傳導(dǎo)通路之一，其在維持細(xì)胞的正常生理功能如生長(zhǎng)、分化、代謝及細(xì)胞骨架重排中起著關(guān)鍵的作用[14]。PI3K/Akt通路已被證實(shí)廣泛存在于人體的多個(gè)生理功能中，大量證據(jù)說明激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路具有抗細(xì)胞凋亡作用，而且這一通路與增生性疾病有著緊密的聯(lián)系。然而，有關(guān)在體外實(shí)驗(yàn)中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與增生性瘢痕的相關(guān)性研究文獻(xiàn)報(bào)道較少。Bao[15]等發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-21可通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路從而減少肝癌細(xì)胞MHCC-97H的增殖與遷移。這表明miR-21與PI3K/ Akt通路在細(xì)胞增殖中具有密切協(xié)調(diào)作用。本研究中發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-21表達(dá)之后，PDCD4表達(dá)上調(diào)。構(gòu)建含有PDCD4片段的慢病毒載體感染HSF使HSF細(xì)胞過表達(dá)PDCD4基因，抑制了HSF細(xì)胞的增殖，顯著減少了細(xì)胞周期蛋白C-MYC和CCND1的表達(dá)，同時(shí)降低PI3K/ Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白p-AKt和JNK1的表達(dá)，這與使用Ly294002阻斷PI3K/Akt通路后所降低p-AKt和JNK1蛋白表達(dá)的作用一致。因此，我們推斷下調(diào)miR-21之后能夠上調(diào)靶基因PDCD4表達(dá)，通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路從而抑制HSF細(xì)胞增殖。

綜上所述，在增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中，miR-21呈現(xiàn)高表達(dá)，促進(jìn)了細(xì)胞增殖和瘢痕的形成。通過干擾miR-21的表達(dá)之后，能夠上調(diào)細(xì)胞內(nèi)抑癌基因PDCD4的表達(dá)，通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路從而抑制細(xì)胞增殖，減少瘢痕的發(fā)生，這對(duì)于臨床上應(yīng)用miR-21靶向分子治療增生性瘢痕提供了理論依據(jù)。

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編輯/張惠娟

Down-regulation of miR-21 inhibits the HSF cells proliferation and the PI3K/Akt pathways via PDCD4

MU Sheng-zhi，SUN Yao-wen，WANG Guo-dong
（Department of Burn and Plastic and Cosmetic Surgery，Shaanxi Province People's Hospital，Xi'an 710068，Shaanxi，China）

ObjectiveTo study the effect and mechanism of microRNA-21 on the expression of PDCD4 and the proliferation of HSF cells.Methods The level of miR-21 in GM0639 and HSF cells was detected with qRT-PCR.HSF cells were divided into seven groups：control group，negative control group（transfected with no-related siRNA），miR21 Inhibitor group（transfected with miRNA-21 inhibitors），miR-21 mimic group（transfected with miR-21 mimic），PDCD4-pGC-Fu-GFP group，pGCFu-GFP group and Ly294002 group.The cells proliferation was detected by MTT after the transfection with48h.TheexpressionofPDCD4geneandproteininthecellsweredetectedby immunofluorescence，Real-time PCR and Western-blot methods respectively.The expression of CMYC and CCND1 as well as p-Akt and JNK1 in the group of control，pGC-Fu-GFP and PDCD4-pGC-Fu-GFP were detected by Real-time PCR and Western blot，respectively.Results miR-21 was overexpressed in HSF cells.Compared with the group of control，down-regulation miR-21 obviously inhibited the HSF cells proliferation and induced the expression of PDCD4.PDCD4 overexpression inhibited the HSF cells proliferation and decreased the expression of C-MYC，CCND1，p-Akt and JNK1.ConclusionDown-regulation of miR-21 could induce the PDCD4 overexpression，which inhibits the HSF cells proliferation and the PI3K/Akt pathways.

microRNA-21；PDCD4；hypertrophic scar fibroblasts；cell proliferation；inhibit；PI3K/Akt

R619+.6

A

1008-6455（2015）23-0039-05

孫要文，主任醫(yī)師；主要研究方向：瘢痕整形修復(fù)，創(chuàng)傷修復(fù)，自體脂肪移植；單位：陜西省人民醫(yī)院燒傷整形醫(yī)學(xué)美容外科，陜西西安友誼西路256號(hào)，郵編：710068

2015-10-21

2015-12-15